velikost textu

Antimikrobiální peptidy izolované z jedu blanokřídlého hmyzu

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Antimikrobiální peptidy izolované z jedu blanokřídlého hmyzu
Název v angličtině:
Antimicrobial peptides isolated from the venom of hymenopterous insect
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Lenka Monincová, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Václav Čeřovský, CSc.
Oponenti:
prof. Ing. Tomáš Macek, CSc.
prof. Ing. Martin Fusek, CSc.
Id práce:
85123
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
25. 11. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
antimikrobiální peptidy, jedové váčky, disulfidické můstky, NMR spektroskopie, CD spektroskopie, antimikrobiální aktivita, syntéza peptidů, membrány, stabilita peptidů, Lasioglossum laticeps, Halictus sexcinctus, Macropis fulvipes, Xiphydria camelus
Klíčová slova v angličtině:
antimicrobial peptides, venom, disluphide bridges, NMR spectroscopy, CD spectroscopy. antimicrobial activity, peptide synthesis, membranes, peptide stability, Lasioglossum laticeps, Halictus sexcinctus, Macropis fulvipes, Xiphydria camelus
Abstrakt:
Abstrakt S ohledem na stále narůstající rezistenci a multirezistenci mikrobů vůči tradičním antibiotikům je nezbytný vývoj nových antimikrobiálních látek. Mezi nadějné kandidáty již několik let patří antimikrobiální peptidy (AMP). Jejich výhodou je rychlé a selektivní působení na prokaryotní buňku. Jejich účinek ve většině případů spočívá v narušení mikrobiální membrány, které vede ke smrti buňky. Bohatým zdrojem AMP se ukázal být jed blanokřídlého hmyzu. Z jedu divoce žijících včel bylo izolováno několik nových AMP. Podrobnější výzkum je věnován halictinům (HAL-1 a HAL-2) z ploskočelky šestipásé, lasiocepsinu (Las) z ploskočelky velkohlavé a macropinu (MAC-1) z olejnice žlutonohé. Jsou aktivní proti Gram-pozitivním i Gram-negativním baktériím a proti kvasince Candida albicans. Liší se v hemolytické aktivitě. Zatímco halictiny a macropin mají značnou hemolytickou aktivitu, Las není hemolytický. Nový AMP byl izolován také ze sekretu pilořitky olšové. Jedná se o nový hmyzí defensin složený z 55 aminokyselin, který je na C-konci amidovaný a obsahuje tři disulfidické můstky. Výsledky CD a NMR studií ukázaly schopnost HAL-1, HAL-2 a MAC-1 vytvářet v přítomnosti micel dodecylsulfátu sodného nebo organického rozpouštědla trifluoroethanolu amfipatickou α-helikální strukturu. Pro studium vztahu struktury a biologické aktivity jsme připravili řadu analogů peptidů HAL-1, HAL-2 a MAC-1. Sledovali jsme vliv kationicity, α- helicity, hydrofobicity nebo amfipaticity na antimikrobiální a hemolytickou aktivitu. Analogy se zvýšeným kladným nábojem patří mezi ty nejslibnější. Vykazovaly zvýšenou antimikrobiální aktivitu proti některým patogenním bakteriím a zároveň nižší hemolytickou aktivitu. V případě MAC-1 se ukázalo, že vhodně zvolené modifikace v N-koncové části sekvence vedou ke zvýšení stability peptidu v krevním séru oproti přírodnímu MAC-1. Las je cyklický peptid, jehož terciální struktura je složena ze dvou α-helixů spojených smyčkou. Struktura celé molekuly je stabilizovaná dvěma disulfidickými můstky. Strukturně- aktivitní studie ukázala, že disulfidické můstky jsou důležité pro udržení optimální terciální struktury, která je zásadní pro působení na bakteriální membránu. Mechanizmus účinku HAL-1 a Las jsme studovali jednak na modelových membránách vytvořených v podobě vezikul o různém složení a jednak na buňkách bakterie E.coli. Oba peptidy silně interagovaly s dvouvrstvou anionických vezikul a docházelo i k jejich zanoření do této dvouvrstvy. Interakce i hloubka zanoření se zvyšovala s obsahem kardiolipinu v dvouvrstvě. Oba dva peptidy narušovaly jak vnější, tak i vnitřní membránu E.coli.
Abstract v angličtině:
Abstract Rapid development of bacterial resistance and multiresitance to conventional antibiotics has resulted in an intensive search for alternative antimicrobial agents. Antimicrobial peptides (AMPs) belong to promising anti-infective candidates since they do not development bacterial resistance. They kill microbes by disturbing or permeabilizing the cytoplasmic membrane, or may target putative key intracellular compartments. Their advantages include fast action and selectivity between prokaryotic and eukaryotic cells. We have isolated several novel AMPs from the venom of wild bees: halictines (HAL-1 and HAL-2) from Halictus sexcinctus, lasiocepsin (Las) from Lasioglossum laticeps and macropin (MAC-1) from Macropis fulvipes. They are active against Gram-positive and Gram- negative bacteria and against yeast Candida albicans. While halictines and macropin have moderate hemolytic activity, Las shows no hemolytic activity. A novel AMP was isolated also from the mucus of Xiphydria camelus. This AMP belongs to the category of insect defensins. It contains 55 amino acid residues, three disulphide bridges and its C-terminus is amidated. CD and NMR studies of HAL-1, HAL-2 and MAC-1 revealed propensity to form amphipathic α-helical structure in the presence of sodium dodecyl sulfate or trifluoroethanol. For the structure-activity relationship study we synthesized series of HAL-1, HAL-2 and MAC analogs in order to follow effect of cationicity, α-helicity, hydrophobicity or amphipathicity on antimicrobial and hemolytic activity. Peptides with increased positive net charge belong to the most promising analogs. They show increased antimicrobial activity against pathogenic bacteria and lower hemolytic activity. MAC-1 analogs with modification at the N-terminal part of its sequence exhibited better serum stability than natural MAC-1. Las belongs to the category of cyclic AMPs. Its tertiary structure consists of two α- helices linked by a structured loop. Whole structure is stabilized by two disulfide bridges. Structure-activity relationship studies confirmed the importance of disulfide bridges for stabilization of its tercialy structure that is important for the interaction with bacterial membrane and thus for its antimicrobial activity. Mechanism of action of HAL-1 and Las was studied on vesicles of various compositions as models of biological membranes or directly on the cells of E.coli. Both peptides interacted strongly with the membrane of anionic vesicles simulating bacterial cell membranes and also penetrated into their bilayer. The interaction was further enhances by increasing concentration of cardiolipin in bilayer of membrane. Both peptides increased permeability of outer and inner membrane of E.coli.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Lenka Monincová, Ph.D. 2.24 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Lenka Monincová, Ph.D. 11.94 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Lenka Monincová, Ph.D. 75 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Lenka Monincová, Ph.D. 74 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Lenka Monincová, Ph.D. 689 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Ing. Tomáš Macek, CSc. 145 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Ing. Martin Fusek, CSc. 137 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 961 kB