velikost textu

Amelioration of obesity-associated disorders by n-3 PUFA and oleuropein: adipocentric view

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Amelioration of obesity-associated disorders by n-3 PUFA and oleuropein: adipocentric view
Název v češtině:
Zlepšení metabolických komplikací spojených s obezitou podáváním n-3 PUFA a oleuropeinu: význam tukové tkáně
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Michaela Svobodová, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Pavel Flachs, Ph.D.
Oponenti:
RNDr. Monika Cahová, CSc., Ph.D.
Doc. MUDr. Marie Kunešová, CSc.
Id práce:
84984
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
27. 5. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Karlova Univerzita v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie Akademie věd České republiky Fyziologický ústav Autoreferát dizertační práce Zlepšení metabolických komplikací spojených s obezitou podáváním n-3 PUFA a oleuropeinu: význam tukové tkáně Michaela Svobodová Praha 2015 Doktorské studijní programy v biomedicíně 1 2 Univerzita Karlova v Praze a Akademie věd České republiky Program: Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie Předseda oborové rady: prof. RNDr. Stanislav Zadražil, DrSc. Školicí pracoviště: Fyziologický ústav AV ČR Autor: Michaela Svobodová Školitel: RNDr. Pavel Flachs, Ph.D. S disertací je možno se seznámit v příslušných knihovnách Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze. 3 ZKRATKY…….…….……4 ABSTRAKT……5 1 ÚVOD…….. …….8 1.1 Bílá tuková tkáň, obesita a metabolický syndrom…….8 1.2. Adiponektin……9 1.3 Transkripční faktor PPARγ.……....10 1.4 AMP-aktivovaná proteinová kináza....……10 1.5 Příznivé účinky n-3 PUFA……….…….…..11 1.6 Thiazolidinediony..……12 1.7 Oleuropein……...12 1.8 Kalorická restrikce..……..……..13 2 METODY..……..………14 3 CÍLE ……..……14 4 VÝSLEDKY……..16 Publikace A……..……16 Publikace B……..………17 Publikace C……..….……..19 5 DISKUSE…..……....20 6 ZÁVĚR……..……..25 7 REFERENCE.……..……....26 4 Použité zkratky 15d-PGJ2 15-deoxy-∆12,14 - prostaglandin J2 AA kyselina arachidonová AMPK AMP–aktivovaná proteinová kináza cHF dieta s vysokým obsahem kukuřičného oleje cHF+CR cHF dieta v kombinaci s 10% kalorickou restrikcí cHF+F cHF dieta suplementovaná rybím koncentrátem cHF+F+CR cHF+F dietav kombinaci s 10% kalorickou restrikcí cHF+F+TZD cHF+F dieta suplementovaná thiazolidinediony cHF+TZD cHF dieta suplementovaná thiazolidinediony CR calorie restriction DHA kyselina docosahexaenová (22:6 n-3) EPA kyselina eicosapentaenová (20:5 n-3) FA mastná kyselina GLUT4 glukózový transportér 4 HMW vysokomolekulární hmotnost IL interleukin NEFA volné mastné kyseliny PGC-1α peroxizomální proliferací aktivovaný receptor gamma koaktivátor 1α PPAR peroxizomální proliferací aktivovaný receptor PUFA polynenasycená mastná kyselina SCD-1 stearoyl koenzym A desaturáza-1 SREBP1 protein vážící se na sterol-regulující element 1 TG triacylglycerol TZD thiazolidinediony WAT bílá tuková tkáň 5 Abstrakt Téměř miliarda a půl dospělých na celém světě trpí nadváhou nebo obezitou (WHO, 2008). Onemocnění spojená s obezitou, jako diabetes 2. typu, dyslipidemie či další nemoci, se při souběžném výskytu alespoň dvou z nich označují za „metabolický syndrom“, vedou velmi často ke kardiovaskulárním chorobám a globálně jsou považovány za jeden z nejpalčivějších zdravotních problémů. Komplexní etiologie těchto onemocnění zahrnuje jak genetické, tak i environmentální faktory, jež se různým způsobem projevují v nárůstu onemocnění u jednotlivých pacientů. Léčba metabolického syndromu vyžaduje strategie, které kombinují různé farmakologické přístupy s odlišnými účinky. Kromě nich je ovšem třeba změnit i životní styl. Změna životního stylu, podpořená vyšší fyzickou aktivitou, nižším celkovým energetickým příjmem a kladením důrazu na nutriční složení potravy, je přitom sama o sobě nejlepší prevencí metabolického syndromu. U polynenasycených mastných kyselin (FA) s dlouhým řetězcem řady n- 3 PUFA z mořských ryb, zejména eikosapentaenové (EPA; 20:5 n- 3) a dokosahexaenové (DHA ; 22:6 n- 3) kyseliny, bylo prokázáno, že působí jako přírodní hypolipidemika, brání rozvoji inzulínové rezistence a hrají tak klíčovou roli v patofyziologii metabolického syndromu. Navazující studie prokázaly inverzní vztah mezi citlivostí na inzulín a stupněm nasycení přijímaných lipidů. Studie na imbredních kmenech myší, u kterých byla dietou s vysokým obsahem tuku indukována obezita (C57BL/6J), poskytují důležité poznatky o jejich vlivu na savčí tkáň a umožňují nám testovat potenciální 6 terapeutické postupy. Dále nám dovolují rozšířit naše studie o možné terapeutické využití kombinací n- 3 PUFA s antidiabetiky používané v klinické praxi. n-3 PUFA snižují chronický zánět, který vzniká při obezitě v bílé tukové tkáni. Ten se vyznačuje tím, že při něm dochází ke změně sekrece adipokinů, které přispívají k rozvoji inzulínové rezistence. Adipocyty a infiltrující imunitní buňky (především makrofágy) přispívají ke změně sekrečních vlastností bílé tukové tkáně při obezitě, což vede k výrazným změnám ve struktuře buněk a složení tkáně. Protizánětlivé účinky n- 3 PUFA pravděpodobně závisí na tvorbě jejich metabolitů, a to jak v adipocytech tak i makrofázích a jiných imunitních buňkách. Tyto lipidové mediátory, jako jsou prostaglandiny, resolviny a protektiny, pocházejí buď z cílené enzymatické syntézy, nebo z neenzymatických oxidačních reakcí. Mohou pak působit jako ligandy pro receptory na povrchu buněk, nebo mohou ovlivňovat signální proteiny, včetně transkripčních faktorů PPARy a NF-kB atd. Syntéza EPA a DHA v lidském těle probíhá velice neefektvně z esenciální α - linolenové kyseliny (ALA, 18:3 n- 3). Vzhledem k nízké spotřebě mořských ryb, různé odborné společnosti na celém světě doporučují zvýšení příjmu EPA + DHA na 0,5-1,0 gram/den, čehož je možné dosáhnout konzumací dvou jídel tučných mořských ryb týdně, nebo prostřednictvím výživových doplňků (omega 3). Především u pacientů s Diabetes mellitus druhého typu se doporučuje zvýšit příjem n-3 PUFA. Působení na transkripční faktor PPARγ se děje i prostřednictvím anti- diabetických léčiv z rodiny thizolidinediony (TZD), které aktivují tento 7 jaderný receptor a zvyšují tak inzulínovou citlivost zvýšením lipidové absorpce a mitochondrialní β-oxidace v bílé tukové tkáni. K aktivaci mitochondriální biogeneze a β-oxidace v bílé tukové tkáni dochází jak působením TZD, tak i působením n-3 PUFA. Děje se tak přes důležité jaderné transkripční faktory PPARα/γ a PPARγ koaktivátory, PGC-1α a β. Fytofarmamaka ze skupiny polyfenoly, jako například nejznámější resveratrol z vinných hroznů či katechiny ze zeleného čaje, ovlivňují celou řadu biochemických reakcí. Resveratrol má kromě jiných pozitivních účinků na organismus příznivý účinek na celkový obsah tělesného tuku a na ukládání bílé tukové tkáně u myší. Oleuropein, polyfenol extrahovaný z listů nebo plodů olivovníku, je jednou z mnoha složek olivového oleje. Polyfenolům je připisován i příznivý vliv na tukovou tkáň. Je známo, že mají vliv již na diferenciaci tzv. pre- adipocytů do vyzrálých tukových buněk. Důležitým jaderným transkripčním faktorem, který řídí diferenciaci a lipidový metabolismus v adipocytech je PPARγ. Podkladem pro tuto disertační práci jsou tři publikované články (označené dále v textu jako A, B a C). Všechny tři práce se věnují problematice bílé tukové tkáně. V těchto pracích jsme ukázali, že bílá tuková tkáň je metabolicky i strukturně flexibilní orgán a n-3 PUFA, rostlinné polyphenoly, kalorická restrikce a TZD mají významnou úlohu v její biologii. Tato disertační práce ukazuje, že EPA a DHA hrají důležitou roli v lipidové a glukózové homeostázy. Obohacení potravy o n-3 PUFA, zvláště pak v kombinaci s antidiabetickými léčivy ze skupiny glitazonů (především pioglitazonem) nebo kalorickou restrikcí, by se mohlo stát 8 důležitou součástí léčby a prevence onemocnění, která jsou spojená s obezitou. Obecným cílem našeho výzkumu je napomoci léčbě obezity a souvisejících onemocnění podáváním n-3 PUFA mastných kyselin mořského původu v kombinaci s dalšími nefarmakologickými přístupy, zejména mírnou kalorickou restrikcí nebo užíváním rostlinných derivátů. 1. Úvod 1.1 Bílá tuková tkáň, obesita a metabolický syndrom Bílá tuková tkáň (WAT – White Adipose Tissue) je důležitá pro ukládání metabolické energie. Nadměrné hromadění bílého tukové tkáněje základem obezity, což představuje stále větší zdravotní problém. Obezita vede k různým chronickýcým onemocněním, včetně diabetu typu 2, dyslipidemie, a kardiovaskulárních onemocnění, společně označována jako metabolický syndrom. Inzulínová rezistence je klíčovou poruchou v patogenezi metabolického syndromu, která může být detekována mnoho let před klinickým nástupem onemocnění. Za normálních okolností, je inzulín sekretován z pankreatických β – buněk a působí přes specifické receptory v cílových tkáních, tedy ve svalové a tukové tkáni a v játrech, které regulují metabolické reakce (inzulín zvyšuje syntézu glykogenu, a navozuje lipogenesi), a způsobuje transport transportérů glukózy použitím GLUT- 4 do nitra buňky (hypoglykemický účinek). Mezi sekrecí a působení inzulínu byl 9 pozorován inverzní vztah, který má hyperbolický průběh. To znamená, že zvýšení sekrece inzulínu je spojeno se snížením citlivosti na inzulín, a naopak. Hypertrofické tukové buňky zvyšují uvolňování mastných kyselin (FA), následně rostoucí akumulaci lipidů v periferních tkáních (tzv. lipotoxicita). Hypertrofofáné adipocyty jsou rezistentník inzulínu, což má za následek nižší vychytávání triacylglycerolů (TG) z plazmy a vyšší uvolňování mastných kyselin z tukové tkáně. Kromě uvolňování mastných kyselin, tuková tkáň produjuje hormony - tzv.adipokiny jako je leptin, adiponektin, tumor nekrotizující faktor α (TNFa), interleukin-6 (IL-6) a visfatin. Tyto hormony modulují citlivost jiných tkání na inzulín a mohou se účastnit v indukci systémové inzulínové rezistence (27). Prostřednictvím sekrece adipokinů se tuková tkáň podílí na regulaci energetické bilance organismu, tělesné teploty, imunitní odpovědi, srážení krve, funkci štítné žlázy a reprodukčních funkcí (5). 1.2 Adiponektin Adiponektin je protein produkovaný především zralými adipocyty. Hladiny adiponektinu v plazmě a tukové tkáni u obézních jedinců ve srovnání s hubenými jednotlivci jsou sníženy. Adiponektin významně reguluje metabolismus sacharidů a lipidů, zvyšuje oxidaci mastných kyselin ve svalech, snižuje plazmatické hladiny glukózy, triacylglycerolů a volných mastných kyselin. 10 1.3 Transkripční factor PPARγ Klíčovou roli v procesu diferenciace hrají transkripční faktory PPARs a C / EBP (CCAAT / enhancer-vázající protein) (2). Transkripční faktor PPARγ je klíčový regulátor diferenciace adipocitů, což bylo prokázáno in vitro, i in vivo (17). PPARy ovlivňuje ukládání mastných kyselin v tukové tkáni. S C / EBP transkripčním faktorem je PPARy součástí programu diferenciace adipocytů, který indukuje zrání pre-adipocytů do tukových buněk. Většina PPARy cílových genů v tukové tkáni jsou přímo zapojeny do lipogeneze, včetně lipoproteinové lipázy (LPL), adipocytárního proteinu vázajícího mastné kyseliny (A-FABP nebo AP2), acyl-CoA syntázy mastných kyselin a transportního proteinu (FATP) (26). Protein PPARy existuje ve dvou izoformách, které jsou kódovány stejného genem s využitím odlišných promotorů. PPARγ2 se liší od PPARγ1 přítomností úseku aminokyselinových zbytků 30 aminokyselin na N-konci, což vede k vyšší transkripční aktivitě ve srovnání s PPARγ1 (23,25). PPARγ1 je hojně exprimován v tukové tkáni, tlustéhém střevě, hematopoetických buněk, a v menší míře v ledvinách, játrech, svalech, pankreatu a tenkém střevě. PPARγ2 je za fyziologických podmínek omezen na bílou a hnědou tukovou tkáň (24). 1.4 AMP-aktivovaná proteinová kináza AMPK je klíčovým regulátorem buněčné a celotělové energetické homeostázy, ovlivňujícím klíčové dráhy energetického metabolismu. 11 Podílí se na akutní regulaci glukózového i lipidového metabolizmu přímou stimulací aktivit enzymů a řídí expresi genů zapojených do energetického metabolizmu především v játrech a kosterním svalu, ale také v tukové tkáni (16). Vychytávání glukózy, jakož i oxidace mastných kyselin je stimulována AMPK. Naproti tomu lipogeneze, syntéza cholesterolu a glukoneogeneze jsou inhibovány AMPK. AMPK funguje jako heterotrimerický komplex sestávající z katalytické (α) a regulačních (β a γ) podjednotek. n-3 PUFA aktivují AMPK a hrají tak důležitou úlohu při regulaci lipidů a metabolismu glukózy (20). Adipokiny, jako adiponektin a leptin jsou také silnými aktivátory AMPK (8). 1.5 Příznivé účinky n-3 PUFA Olej z mořských ryb, převážně polynenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem docosahexaenová kyselina (DHA; 22:6n-3), eikosapentaenová kyselina (EPA; 20:5n-3) a dokosapentaenová kyselina (DPA, 22:5n-3) působí jako přírodní hypolipidemikum a anti- inflamační agens a zlepšují různé factory metabolického syndromu (5, 6, 13). Příjem n-3 PUFA je spojen s řadou buněčných odpovědí, včetně změn v genové expresi a složení mastných kyselin v membránových fosfolipidech, které by mohly ovlivnit syntézu eikosanoidů a propustnost biologických membrán (12). n-3 PUFA v souvislosti s obezitou a s její související inzulínovou rezistencí, bylo prokázáno několik potenciálních mechanismů: 12 a) omezení lipotoxicity ve tkáni citlivé na inzulín b) eliminace zánětlivé reakce v obézní tukové tkáni c) benefiční změny v sekreci hormonů tukovou tkání hlavně adiponektinu d) vznik biologicky aktivních lipidových mediátorů, jmenovitě resolviny a protektiny e) aktivace AMPK 1.6 Thiazolidinediony Thiazolidinediony(TZDs), nejznámější jsou rosiglitazon a pioglitazon, byly do nedávna mezi preferovanými farmakologickými léčivy používanými pro diabetické pacienty při inzulínové rezistenci. Dva hlavní intracelulární mechanismy, do kterých jsou TZD zapojeny: (i) přímá vazba TZD na jaderný transkripční factor PPARγ (peroxisome proliferator activated receptor-γ), který je důležitý při aktivaci adipocytární diferenciace v tukové tkáni; (ii) rychlá stimulace AMP- kinázy v játrech, svalech a jiných tkáních (11). Nicméně v souvislosti s používáním léčiv TZD jsou spojovány i vedlejší účinky a to oedema a přibývání na váze (21), zvýšené riziko srdečního selhání (15) a ubývání kostní hmoty (10). 13 1.7 Oleuropein Olivový olej je zdrojem alespoň 30 fenolických sloučenin, zejména extra panenský olivový olej obsahuje značné množství fenolických látek, například hydroxytyrosol a oleuropein. In vitro oleuropein snižuje expresi PPARγ, inhibuje adipogenesi a zvyšuje osteoblastogenesi v kmenových buňkách odvozených z kostní dřeně (19). Oleuropein u 3T3-L1 buněk způsobuje inhibici diferenciace do adipocytů a hromadění lipidů a tím reguluje velikost tukových buněk (4). 1.8 Kalorická restrikce Kalorická restrikce (CR) je nezbytnou součástí při léčbě obezity a přidružených onemocnění (18). Kalorické restrikce vzájemně interaguje s AMPK, senzorem energetické homeostázy (viz. 1.4) (22). Kromě toho, kalorická restrikce indukuje mitochondriální biogenezi v různých tkáních (7), s relativně silným účinkem v tukové tkáni (9, 14). Indukce mitochondrií zahrnuje transkripční faktory PPARα / γ a PPARy koaktivátoru, PGC- 1α (7, 14). 14 2. METHODY Práce se zvířaty a příprava diet Glukózová homeostáze Práce s myší buněčnou linie 3T3-L1 Izolace, pěstování primárních pre-adipocytů/adipocytů Testy na viabilitu tkáňových kultur -Trypan Blue assay a WST-1 assay Oil red-O barvení Reporter-gene assay Izolace RNA Kvantitativní PCR v reálném čase Izolace primárních hepatocytů Pěstování primárních izolovaných hepatocytů Ex- vivo analýza oxidace mastných kyselin v izolovaných primárních hepatocytech Statistická analýza 3. CÍLE Obecným cílem této studie je zlepšit strategii pro léčbu a prevenci obezity pomocí n-3 mastných kyselin z mořských ryb v kombinaci s dalšími přírodními přístupy, a to mírné omezení kalorií nebo polyfenolů rostlinného původu. Modelem pro tuto práci nám byly myši k dietou indukované obezitě a in vitro buněčná linie 3T3-L1. Specifické cíle: 15 1. Zjistit, zda kombinační podání pioglitazonu s n-3 PUFA vyvolává aditivní příznivé účinky u myší s dietou indukovanou obezitou a inzulínovou rezistencí. Hlavním cílem experimentu bylo charakterizovat účinky na tělesnou hmotnost, stejně jako metabolickou flexibilitu a glukózovou homeostázy, včetně základních mechanismů a též zapojení adiponektinu - jednoho z hlavních adipokinů. 2. Popsat základní mechanizmy účinku v případě kombinovaného podání n-3 PUFA s 10% kalorickou restrikcí v prevenci obezity a souvisejících onemocnění u myší s dietou indukovanou obezitou a inzulínovou rezistencí. Zvláštní důraz byl kladen na charakteristiku zapojení bílé tukové tkáně v celotělové reakci na kombinované léčby. 3. Charakterizovat molekulární mechanismus působení oleuropeinu, polyfenolu získaného z olivových listů, na různých modelech in vitro. 16 4. Výsledky -publikace Publikace A Unasking differential effects of rosiglitazone and pioglitazone in the combination treatment with n-3 fatty acids in mice fed a high-fat diet. Kus V1, Flachs P, Kuda O, Bardova K, Janovska P, Svobodova M, Jilkova ZM, Rossmeisl M, Wang-Sattler R, Yu Z, Illig T, Kopecky J. Mastné kyseliny z mořských ryb, tj dokosahexaenové a kyseliny eikosapentaenové (EPA a DHA – n-3 PUFA), působí jako hypolipidemika, ale nevylepšují glykémie u pacientů s diabetem. Thiazolidindiony (TZDs), jako je rosiglitazon a pioglitazon, tj specifické aktivátory PPRAγ zvyšují citlivost celého těla na inzulín. Naše studie ukázaly, že kombinovaná léčba za použití n-3 PUFA koncentrátu (DHA / EPA) a rosiglitazonu měla aditivní příznivé účinky na dyslipidemii a poruchu glukózové tolerance (IGT) u obézních myší. Cílem další studie proto bylo blíže studovat působení mechanismu TZDs, a to v kombinaci s roziglitazonem nebo pioglitazonem. Samci myší C57BL/6J byly krmeny dietou s vysokým obsahe tuku. Diety: n-3 PUFA nahrazovala 15% lipidů z potravy, rosiglitazon (10 mg / kg stravy), nebo pioglitazon (50 mg / kg), nebo kombinace obou n-3 PUFA s rosiglitazonem nebo pioglitazonem. Bylo analyzováno tělesná hmotnost, adipozita, metabolické markery a adiponektin v plazmě, akumulace triacylglycerolu v játrech a svalech. Test intraperitoneální tolerance glukózy byl použit pro charakterizaci změny glukózové homeostáze. Metabolická flexibilita byla testována mezi dvěma nutričními stavy – na lačno a tzv.re-fed stavu (opětovném nakrmení). 17 Naše studie ukázala, že kombinační dieta n-3 PUFA s TZD působí příznivě a to v prevenci obezity, dyslipidemie a IGT, zatímco dochází ke snížení hromadění triacylglycerolu v játrech a zvýšené produkci adiponektinu. Léčba také zlepšila metabolickou flexibilitu. Jak rosiglitazon tak pioglitazon by mohly být použity v kombinaci s n-3 PUFA jako doplňkové terapie a neutralizovat dyslipidemii a rezistenci na inzulín. Kombinovaná léčba může snížit požadavky na dávky a tím i výskyt nežádoucích vedlejších účinků léčby thiazolidindionů. Publikace B Synergistic induction of lipid catabolism and anti-inflammatory lipids in white fat of dietary obese mice in response to calorie restriction and n-3 fatty acids. Flachs P, Rühl R, Hensler M, Janovska P, Zouhar P, Kus V, Macek Jilkova Z, Papp E, Kuda O, Svobodova M, Rossmeisl M, Tsenov G, Mohamed-Ali V, Kopecky J. Kalorické restrikce (CR) je nezbytnou součástí při léčbě obezity a přidružených onemocnění. Polynenasycené mastné kyseliny s n-3 dlouhým řetězcem (n-3 PUFA) působí jako přírodní hypolipidemika, snižují riziko kardiovaskulárních onemocnění, a můžou být nápomocni při rozvoji obezity a inzulínové rezistence. Naším cílem bylo charakterizovat účinnost a základní mechanismy kombinační léčby s n-3 PUFA a mírnou CR v prevenci obezity a souvisejících onemocnění u myší. Samci myšího kmene C57BL / 6J byli krmeni vysokotukovou dietou (CHF) po dobu 2 týdnů a potom byli náhodně rozděleni do skupin, které byly krmeny po dobu 5 týdnů nebo 15 týdnů dietami: (i) CHF (vysokotuková dieta) ad libitum; (ii), CHF +F, kde je nahrazeno 15% lipidů z potravy n-3 PUFA, ad libitum; (Iii) CHF + CR, CHF snížení stravy 18 o 10% ve srovnání s ad libitum myší krmených CHF; a (iv) cHF + F + CR. Ve srovnání s cHF dietou, kombinovaná léčba (cHF + F + CR) nejefektivněji snížila přírůstek tělesné hmotnosti a to hmotnosti jak epididymálního tak i subkutánního depa bílé tukové tkáně, přičemž ale také došlo ke zlepšení citlivosti na inzulín (index HOMA) a glukózovou toleranci (OGTT). Ektopická akumulace lipidů v játrech a kosterním svalstvu se také výrazně snížila při kombinované léčbě. Infiltrace WAT makrofágy, což ukazuje na chronický tzv. low-grade zánět, byla významně snížena též při kombinované léčbě cHF + F + CR. Právě kombinace CR a n-3 PUFA aditivně indukuje konverzi n-3 PUFA na protizánětlivé lipidové mediátory v epididymálním tukovém depu. Například hladiny 15-deoxy-prostaglandinu J2 a neuroprotectin D1 byly zvýšeny 6,6-krát a 35-krát při léčení cHF + F + CR ve srovnání s myší CHF. Kromě toho, genová exprese ukázala, synergickou aktivaci PPARα / PGC-1 A signálních drah při léčbě cHF + F + CR v epididymálním depu WAT, ale ne v játrech, svalech nebo hnědém tuku. Výše uvedené účinky kombinované léčby jsou v korelaci s rychlostí oxidace palmitátu a mitochondriální respirační kapacity WAT. To znamená, že maximální rychlost oxidace palmitátu měřena v epididymalním depu WAT ex vivo byla 2-krát vyšší u myší na cHF + F + CR dietě ve srovnání s cHF skupinou (60.01 ± 8.04 vs. 24.73 ± 5.67 pmol 02/s/mg DNA; p = 0.012). Ukázali jsme, že n-3 PUFA mohou rozšířit protizánětlivé a metabolické účinky CR prostřednictvím indukce mitochondriální biogeneze a oxidace mastných kyselin ve WAT, zatímco indukují tvorbu protizánětlivých lipidových mediátorů. Tato studie odhaluje nový mechanismus účinku kalorické restrikce na modulaci zánětu. 19 Publikace C Oleuropein as an inhibitor of peroxisome proliferator- activated receptor gamma. Svobodova M, Andreadou I, Skaltsounis AL, Kopecky J, Flachs P. Oleuropein je hlavní fenolická sloučenina nalezená v olivových listech a olivovém oleji. Vykazuje četné pozitivní účinky a to antioxidantní, protizánětlivé, anti-aterogenní či protirakovinné. Kromě toho, oleuropein potlačuje diferenciaci adipocytů in vitro. Naším cílem bylo charakterizovat molekulární mechanizmy anti-adipogenních účinků oleuropeinu. Byly použity 3T3-L1 buněčná linie a myší primární kultury pre - adipocytů z epididymálního a subkutánního tuku. Diferenciační médium přítomné v průběhu první 48 hodin obsahoval 10% FCS, 2uM dexamethason a 100 nM BRL a 5 ug / ml inzulín, který se přidává pro všechny časy diferenciace. Po 2 dnech diferenciace bylo médium nahrazeno DMEM obsahujícím 10% FCS a 5 ug / ml inzulínu. Životaschopnost buněk / proliferace byla analyzována pomocí trypanové modři a WST-1 testu, a tukové kapénky byly barveny Oil Red O barvením. Genové exprese byla analyzována qRT-PCR. Genové reportérové assaye pro PPARα, PPARδ / β a PPAR (GeneBLAzer, Invitrogen, USA) byly použity ke studiu přímých účinků na transkripční aktivitu transkripčních receptorů z rodiny PPAR. Výsledky: Oleuropein v závislosti na dávce (10-400 um) inhibuje diferenciaci adipocytů v obou experimentálních modelech a potlačil genové exprese PPARγ, C / EBP1α, SREBP-1C a FAS. PPARα a PPARδ / β aktivity nebyly ovlivněny oleuropeinem (10-200 um). Naproti tomu, 20 PPARy transkripční aktivita byla snížena v důsledku účinků oleuropeinu (> 100 um). Oleuropein potlačuje jak preadipocytární proliferaci tak diferenciaci adipocytů in vitro. Navíc naše údaje naznačují, že oleuropein vykazuje anti-adipogenní účinek prostřednictvím přímé inhibice PPARy aktivity. 5. Diskuse Naše experimenty na myších dietou indukované obezitě naznačují, že kombinace n-3 PUFA a TZD může mít příznivé aditivní účinky při léčbě glukózové intolerance a dyslipidemie u pacientů s diabetem. Jak jsme pozorovali u myší, tak pouze rosiglitazon ale ne pioglitazon v kombinaci s n-3 PUFA zabránil nárůstu tělesného tuku v korelaci s indukcí β-oxidace mastných kyselin. Nicméně, dokonce i v nepřítomnosti jakéhokoliv vlivu na tělesné hmotnosti v kombinaci s anti-diabetickými léky, kombinovaná léčba vykazuje silnější účinek pioglitazonu na glukózovou homeostázy, triglyceridémii a jaterní steatózu, v závislosti pravděpodobně na indukci adiponektinu. Dalším významným účinkem kombinační diety obou TZD s n-3 PUFA je silné sníženi celkové hladiny cholesterolu v plazmě. Dieta CR s n-3 PUFA rozšiřuje anti-obezitní strategii a současně vylepšuje metabolismus lipidů a glukózovou homeostázy. Tyto účinky se pravděpodobně odráží v synergické indukci mitochondriální oxidaci FA ve WAT, spojené s potlačením nízkého stupně zánětu této tkáně. Synergická indukce specifických protizánětlivých lipidových mediátorů, a to 15d-PGJ2 (z n-6 PUFA metabolite) a PD1 (z n-3 PUFA 21 metabolite), mohou být základem jak protizánětlivé, tak metabolické kombinované léčby ve WAT. Další výzkum strategie a přístupu zacílený na bílou tukovou tkáň a kombinaci dvou vzájemně se doplňujících přístupů, tj. dieta s n-3 PUFA a mírná kalorická restrikce, mohou být důležité pro prevenci a léčbu metabolického syndromu. Oleuropein potlačuje diferenciaci adipocytů prostřednictvím inhibice genové exprese, tak i proteinovou aktivitu PPARy. Jak bylo také nedávno odhaleno v klinické studii (3), doplněk stravy z olivového listí z řad polyfenolů, a to především oleuropein, může být použit jako součást nových terapeutických strategií pro prevenci a léčení obezity a inzulínové rezistence. Ale v kombinaci s anti-diabetickými léky, v důsledku potlačení transkripčního faktoru PPARy, není vhodným kandidátem. Table 1: Summary of effects on growth characteristics and metabolic features of mice n-3 PUFA + TZDs ( vs. n-3 PUFA + CR cHF diet) (vs. cHF diet) Energy balance Body weight gain decreased* decreased* Food intake no effect no effect Glucose homeostasis GTT (total AUC) decreased decreased Fasting glucose decreased decreased* HOMA-index decreased decreased* 22 Metabolic flexibility (INCA) improved improved* Plasma (random fed) NEFA decreased* no data TAG decreased* decreased* Cholesterol decreased no data Glucose no data no chase increased (PIO)*, Adiponectin increased (ROSI) increased* Leptin decreased decreased* Insulin decreased* Decreased WAT Subcutaneus WAT Total mass decreased* decreased* Adipocytes size decreased* decreased Insulin sensitivity increased* Increased Infammation (CLS)** decreased decreased Epididymal WAT Total mass decreased decreased* Insulin sensitivity increased* increased* Adipocytes size decreased decreased* Infammation (CLS)** decreased decreased* decreased (PIO)*, no Liver Weight effect (ROSI) decreased* Insulin sensitivity increased increased* Tissue lipid decreased (PIO)*, no content change (ROSI) decreased* 23 Muscle (gastrocnemiu s) Weight no effect no effect Insulin sensitivity increased increased* Tissue lipid content no effect decreased *** Glycogen content increased* no data * Additive effect of the combination treatment;**Number of CLS per 100 adipocytes; *** after 15 weeks of the treatment; Abbreviations: AUC, total area under the curve; cHF, corn oil based high fat diet; CLS, crown like structure; GTT , glucose tolerance test; INCA, indirect calorimetry,N.D. not determined. Table 2: Gene expression n-3 PUFA + TZDs ( n-3 PUFA + CR WAT vs. cHF diet) (vs. cHF diet) Subcutaneus Fatty acid sytnetsis: WAT SCD1, FAS no effect no effect Fatty acid oxidation: CPT-1, PPARα no data increased* Mitochondrial biogenesis: PGC-1a no data no effect Glyceroneogenesis: PEPCK, PDK4 increase increase Epididymal Fatty acid sytnetsis: WAT SCD1, FAS no effect increased* Fatty acid oxidation: CPT-1, PPARα no effect no effect 24 Mitochondrial biogenesis: PGC-1a increased big increased* Glyceroneogenesis: PEPCK, PDK4 increased increased* Glucose metabolism: Liver PDK4 no effect no effect Fatty acid sytnetsis: FAS decreased, SCD1, FAS SCD1 increased decreased* Fatty acid oxidation: CPT-1, PPARα increased no effect Mitochondrial biogenesis: PGC-1a decreased* no effect Muscle (gastrocnemi Glucose metabolism: us) PDK4 no effect no effect Fatty acid sytnetsis: SCD1 no effect no effect Fatty acid oxidation: CPT-1 increased no effect CPT-1, Carnitine palmitoyltransferase I, PDK4, Pyruvate dehydrogenase lipoamide kinase isozyme 4, PEPCK, Phosphoenolpyruvate carboxykinase, PGC-1α, Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, PPARα, Peroxisome proliferator-activated receptor alpha, SCD1, Stearoyl-CoA desaturase 25 6. Závěry 1. Kombinační dieta n-3 PUFA s roziglitazonem nebo s pioglitazonem odhalila rozdílné efekty u těchto dvou anti-diabetických léčiv rodiny TZD. Pouze kombinace n-3 PUFA + rosiglitazone snižovala hmotnostní přírůstek. Obě kombinace vykazovaly aditivní stimulační efekt na sekreci adiponektinu z bílé tukové tkáně a zvyšují glukózovou homeostázy. Pouze kombinační dieta n-3 PUFA s pioglitazonem eliminovala jaterní steatózu a vykazovala zlepšení inzulínové rezistence u obezních myší. 2. Kombinované působení mírné kalorické restrikce a n-3 PUFA aktivujer katabolismus lipidů a zlepšuje glukózovou homeostázy. Tyto efekty reflektují synergickou indukci mitochondriální oxidaci mastných kyselin specificky v abdominální bílé tukové tkáni a snížení chronického zánětu organismu. 3. Oleuropein in vitro vykazuje anti-adipogenní efekt prostřednictvím inhibice jak genové exprese, tak i aktivity PPARγ. 26 7. Reference 1. Cannon B and Nedergaard J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev 84: 277-359, 2004. 2. Cho MC, Lee K, Paik SG, and Yoon DY. Peroxisome Proliferators-Activated Receptor (PPAR) Modulators and Metabolic Disorders. PPAR Res 2008: 679137, 2008. 3. de Bock M, Derraik JG, Brennan CM, Biggs JB, Morgan PE, Hodgkinson SC, Hofman PL, and Cutfield WS. Olive (Olea europaea L.) leaf polyphenols improve insulin sensitivity in middle-aged overweight men: a randomized, placebo-controlled, crossover trial. PLoS One 8: e57622, 2013. 4. Drira R, Chen S, and Sakamoto K. Oleuropein and hydroxytyrosol inhibit adipocyte differentiation in 3 T3-L1 cells. LIFE Sci 89: 708-716, 2011. 5. Flachs P, Rossmeisl M, Bryhn M, and Kopecky J. Cellular and molecular effects of n-3 polyunsaturated fatty acids on adipose tissue biology and metabolism. Clin Sci (Lond) 116: 1-16, 2009. 6. Flachs P, Rossmeisl M, and Kopecky J. The effect of n-3 fatty acids on glucose homeostasis and insulin sensitivity. Physiol Res 63 Suppl 1: S93-118, 2014. 7. Flachs P, Rühl R, Hensler M, Janovska P, Zouhar P, Kus V, Macek Jilkova Z, Papp E, Kuda O, Svobodova M, Rossmeisl M, Tsenov G, Mohamed-Ali V, and Kopecky J. Synergistic induction of lipid catabolism and anti-inflammatory lipids in white fat of dietary obese mice in response to calorie restriction and n-3 fatty acids. Diabetologia 54: 2626-2638, 2011. 27 8. Hardie DG. AMPK: a key regulator of energy balance in the single cell and the whole organism. Int J Obes (Lond) 32 Suppl 4: S7- 12, 2008. 9. Higami Y, Pugh TD, Page GP, Allison DB, Prolla TA, and Weindruch R. Adipose tissue energy metabolism: altered gene expression profile of mice subjected to long-term caloric restriction. FASEB J 18: 415-417, 2004. 10. Lazarenko OP, Rzonca SO, Hogue WR, Swain FL, Suva LJ, and Lecka-Czernik B. Rosiglitazone induces decreases in bone mass and strength that are reminiscent of aged bone. Endocrinology 148: 2669- 2680, 2007. 11. LeBrasseur NK, Kelly M, Tsao TS, Farmer SR, Saha AK, Ruderman NB, and Tomas E. Thiazolidinediones can rapidly activate AMP-activated protein kinase in mammalian tissues. Am J Physiol Endocrinol Metab 291: E175-181, 2006. 12. Lombardo YB and Chicco AG. Effects of dietary polyunsaturated n-3 fatty acids on dyslipidemia and insulin resistance in rodents and humans. A review. J Nutr Biochem 17: 1-13, 2006. 13. Mozaffarian D, Lemaitre RN, King IB, Song X, Huang H, Sacks FM, Rimm EB, Wang M, and Siscovick DS. Plasma phospholipid long- chain ω-3 fatty acids and total and cause-specific mortality in older adults: a cohort study. Ann Intern Med 158: 515-525, 2013. 14. Nisoli E, Tonello C, Cardile A, Cozzi V, Bracale R, Tedesco L, Falcone S, Valerio A, Cantoni O, Clementi E, Moncada S, and Carruba MO. Calorie restriction promotes mitochondrial biogenesis by inducing the expression of eNOS. Science 310: 314-317, 2005. 15. Nissen SE and Wolski K. Effect of rosiglitazone on the risk of myocardial infarction and death from cardiovascular causes. N Engl J Med 356: 2457-2471, 2007. 28 16. Oakhill JS, Scott JW, and Kemp BE. Structure and function of AMP-activated protein kinase. Acta Physiol (Oxf) 196: 3-14, 2009. 17. Rosen ED and Spiegelman BM. Molecular regulation of adipogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol 16: 145-171, 2000. 18. Sacks FM, Bray GA, Carey VJ, Smith SR, Ryan DH, Anton SD, McManus K, Champagne CM, Bishop LM, Laranjo N, Leboff MS, Rood JC, de Jonge L, Greenway FL, Loria CM, Obarzanek E, and Williamson DA. Comparison of weight-loss diets with different compositions of fat, protein, and carbohydrates. N Engl J Med 360: 859-873, 2009. 19. Santiago-Mora R, Casado-Díaz A, De Castro MD, and Quesada-Gómez JM. Oleuropein enhances osteoblastogenesis and inhibits adipogenesis: the effect on differentiation in stem cells derived from bone marrow. Osteoporos Int 22: 675-684, 2011. 20. Suchankova G, Tekle M, Saha AK, Ruderman NB, Clarke SD, and Gettys TW. Dietary polyunsaturated fatty acids enhance hepatic AMP-activated protein kinase activity in rats. Biochem Biophys Res Commun 326: 851-858, 2005. 21. Yang X and Smith U. Adipose tissue distribution and risk of metabolic disease: does thiazolidinedione-induced adipose tissue redistribution provide a clue to the answer? Diabetologia 50: 1127- 1139, 2007. 22. Zhang BB, Zhou G, and Li C. AMPK: an emerging drug target for diabetes and the metabolic syndrome. Cell Metab 9: 407-416, 2009. 23. Zhu, Y., C. Qi, J. R. Korenberg, X. N. Chen, D. Noya, M. S. Rao, and J. K. Reddy, 1995, Structural organization of mouse peroxisome proliferator-activated receptor gamma (mPPAR gamma) gene: 29 alternative promoter use and different splicing yield two mPPAR gamma isoforms: Proc Natl Acad Sci U S A, v. 92, p. 7921-5. 24. Vidal-Puig, A. J., R. V. Considine, M. Jimenez-Liñan, A. Werman, W. J. Pories, J. F. Caro, and J. S. Flier, 1997, Peroxisome proliferator-activated receptor gene expression in human tissues. Effects of obesity, weight loss, and regulation by insulin and glucocorticoids: J Clin Invest, v. 99, p. 2416-22. 25. Werman, A., A. Hollenberg, G. Solanes, C. Bjorbaek, A. J. Vidal-Puig, and J. S. Flier, 1997, Ligand-independent activation domain in the N terminus of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma). Differential activity of PPARgamma1 and -2 isoforms and influence of insulin: J Biol Chem, v. 272, p. 20230-5. 26. Memon, R. A., L. H. Tecott, K. Nonogaki, A. Beigneux, A. H. Moser, C. Grunfeld, and K. R. Feingold, 2000, Up-regulation of peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR-alpha) and PPAR- gamma messenger ribonucleic acid expression in the liver in murine obesity: troglitazone induces expression of PPAR-gamma-responsive adipose tissue-specific genes in the liver of obese diabetic mice: Endocrinology, v. 141, p. 4021-31. 27. Tilg, H., and A. R. Moschen, 2006, Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity: Nat Rev Immunol, v. 6, p. 772-83.
Abstract v angličtině:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Genetics and Microbiology Academy of Sciences of the Czech Republic Institute of Physiology, v.v.i Synopsis of Ph.D. Thesis Amelioration of obesity –associated disorders by n-3 PUFA and oleuropein: adipocentric view Michaela Svobodová Praha 2015 Doktorské studijní programy v biomedicine 1 2 Univerzita Karlova v Praze a Akademie věd České republiky Program: Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie Předseda oborové rady: prof. RNDr. Stanislav Zadražil, DrSc. Školicí pracoviště: Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Autor: Michaela Svobodová Školitel: RNDr. Pavel Flachs, Ph.D. S disertací je možno se seznámit v příslušných knihovnách Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze. 3 LIST OF ABBREVIATIONS…….…….……4 ABSTRACT……5 1 INTRODUCTION …….8 1.1 White fat, obesity and metabolic syndrome……..8 1.2. Adiponectin……9 1.3 Transcription factor PPARγ…….9 1.4 AMP-activated protein kinase…….10 1.5 Beneficial effects n-3 PUFA…….…..11 1.6 Thiazolidinediones……12 1.7 Oleuropein……...12 1.8 Caloric restriction……..……..13 2 METODS……..………13 3 AIMS OF THE THESIS……..……14 4 RESULTS……....15 Publication A…….15 Publication B…….16 Publication C…….………18 5 DISCUSSION…….19 6 CONCLUSIONS…….……..25 7 REFERENCES……....26 4 LIST OF ABBREVIATIONS 15d-PGJ2 15-deoxy-∆12,14 - prostaglandin J2 AA arachidonic acid AMPK AMP–activated protein kinase cHF corn oil based high-fat diet cHF+CR cHF diet in combination with 10% of calorie restriction cHF+F cHF diet supplemented with fish oil cHF+F+CR cHF+F diet in combination with 10% of calorie restriction cHF+F+TZD cHF+F diet supplemented with thiazolidinedione cHF+TZD cHF diet supplemented with thiazolidinedione CR calorie restriction DHA docosahexaenoic acid (22:6 n-3) EPA eicosapentaenoic acid (20:5 n-3) FA fatty acid GLUT4 glucose transporter 4 HMW high-molecular weight IL interleukin IRS insulin receptor substrate NEFA non-esterified fatty acids NFκB nuclear factor NF-kappa-B NRF-1 nuclear respiratory factor 1 PGC-1α peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1α PI3K phosphatidylinositol 3-kinase PPAR peroxisome proliferator-activated receptor PUFA polyunsaturated fatty acid RQ respiratory quotient SCD-1 stearoyl-Coenzyme A desaturase 1 SREBP1 sterol regulatory element binding protein 1 5 TG triacylglycerol TNFα tumor necrosis factor-alpha TZD thiazolidinediones UCP1 uncoupling protein 1 VLDL very low-density lipoprotein WAT white adipose tissue Abstract Globally 1, 5 billion adults are overweight or obese according to WHO. Obesity-associated diseases, namely type 2 diabetes, dyslipidaemia and other morbidities clustered in the 'metabolic syndrome’ predispose individuals to cardiovascular disease and represent a significant health problem around the world. Complex aetiology of these diseases involves both genetic and environmental factors with a different contribution to disease progression in various individuals. Treatment of metabolic syndrome requires strategies combining several pharmacological approaches with multiple mechanisms of action. Besides these interventions, lifestyle changes are inevitable, and they are extremely important for the prevention of metabolic syndrome. Thus, physical activity, total energy intake, macronutrient composition of the diet, as well as minor dietary constituents are all important. Long-chain polyunsaturated fatty acids (FAs) of n-3 series (n-3 PUFA) from marine fishes, mainly eicosapentaenoic (EPA; 20:5 n-3) and docosahexaenoic (DHA; 22:6 n-3) acids, have been shown to act as natural hypolipidaemics, while preventing development of insulin resistance, the key feature in the pathophysiology of metabolic syndrome. Other studies have demonstrated an inverse relationship between insulin sensitivity and the degree of saturation of parent 6 lipids. Studies with an obesity-prone mouse model (C57BL/6) provide important knowledge regarding their effect on mammalian tissues and to test potential therapeutic interventions. Further, this model allows us to extend our studies on the therapeutic use of a combination of n-3 PUFA with antidiabetic drugs. n-3 PUFA decrease age- or disease-related chronic inflammation, including obesity-associated low-grade inflammation of WAT characterized by altered secretion patterns of adipokines, which contributes to development of insulin resistance. Both adipocytes and infiltrating macrophages contribute to changing secretory properties of white adipose tissue during obesity, reflecting pronounced changes in tissue structure and cellular composition. The anti-inflammatory effects of n-3 PUFA probably depend on the formation of their metabolites, both in adipocytes and in macrophages. These lipid mediators originate from either targeted enzymatic synthesis or non-enzymatic oxidative reactions, such as prostaglandins, resolvins and protectins. They can act as ligands for surface receptors or can interact with signaling proteins including PPARγ and NF-κB. Namely resolvins and protectins have pro-resolving and anti-inflammatory effects. EPA and DHA are essential fatty acids, which could be elongated in the human body at a relatively low rate from α-linolenic acid (ALA; 18:3 n-3). Due to the low consumption of sea fish, various professional societies worldwide recommend in their guidelines to increase the intake of EPA+DHA to 0.5-1.0 g/day, which could be accomplished by two meals of fatty sea fish weekly, or by means of encapsulated (omega 3) nutritional supplements. Additionally, diabetic patients may be advised to increase their intake of n-3 PUFA. 7 Thizolidinediones (TZDs) are a class of anti-diabetic drugs that activate the nuclear transcription factor, PPARγ, pathway resulting in increased insulin sensitivity through increased lipid absorption and mitochondrial β-oxidation in white adipose tissue. For instance, both TZDs and n-3 PUFA induce mitochondrial biogenesis and β-oxidation. Mitochondrial induction involves transcription factors PPARα/γ and PPARγ coactivator, PGC-1α. Polyphenols, the most well-known of which is resveratrol from grapes, or catechins from green tea, affect a wide variety of biochemical reactions. Oleuropein, a polyphenol extracted from olive tree leaves is one of many components of olive oil. Polyphenols are attributed to a beneficial effect on adipose tissue. It is known to have an effect on the differentiation of the already pre-adipocytes into mature adipocytes important nuclear transcription factor for lipogenesis and overall lipid metabolism is PPARγ. This thesis is based on three published articles (A, B and C). In the publications, we have shown that white adipose tissue is a flexible body and polyphenols, n-3 PUFAs, TZDs play an important role in its biology. This dissertation has shown that EPA and DHA play an important role in lipid and glucose homeostasis. Enrichment of food of n-3 PUFAs, especially in combination with TZDs or caloric restriction, could become an important part of prevention and treatment of comorbidities associated with obesity. 8 1. Introduction 1.1 White fat, obesity and metabolic syndrome White adipose tissue (WAT) is crucial for storage of metabolic energy. Excessive accumulation of WAT underlies obesity, which represents an increasing health care problem. The obesity leads to various chronic morbidities, including type 2 diabetes, dyslipidaemia, and cardiovascular disease, together called as metabolic syndrome. Insulin resistance is a key event in the pathophysiology of metabolic syndrome that may be detected many years before the clinical onset of hyperglycemia. Normally, insulin released from pancreatic β - cells acts through specific receptors in target tissues, i.e. in muscle and adipose tissue and hepatocytes, which produces metabolic response (insulin increases glycogen synthesis, and operates lipogenesis and proteoanabolic), and causes the transport of glucose transporters using GLUT- 4 to the cell interior (hypoglycemic effect). Among secretion and insulin action was observed an inverse relationship, which has a hyperbolic course. This means that the increase in an insulin secretion is associated with a decrease in insulin sensitivity, and vice versa. Therefore, the hypertrophic fat cells enhance release of fatty acids (FAs) consequently the increasing accumulation of lipids in the peripheral tissues (so-called lipotoxicity). In fact, hypertrophic adipocytes themselves become resistant to insulin, which results in lower clearance of plasma triacylglycerols (TG) and higher FAs release from the adipose tissue. In addition to FAs, also various adipocyte- secreted proteins (adipokines), like leptin, adiponectin, tumor necrosis factor α (TNFα), interleukin-6 (IL-6), and visfatin modulate sensitivity of other tissues to insulin and may be involved in the 9 induction of systemic insulin resistance (27). Through the secretion of adipokines, WAT is involved in the control of energy balance, body temperature, immune response, blood clotting, bone mass, and thyroid and reproductive functions, as well as some other functions (5). The role of WAT in storing and releasing lipids for oxidation by skeletal muscle and other tissues became so firmly established decades ago that a persistent lack of interest hindered the study of the extraordinarily dynamic behavior of adipocytes. WAT is a type of connective tissue which plays an important role in the functioning of the body. It is not an inert cell mass contributing only to storage of fat but also functions as an endocrine organ, contributing to inflammation and the innate immune response. 1.2 Adiponectin Adiponectin is a protein produced mainly mature adipocytes. Adiponectin levels in the plasma and adipose tissue are decreased in obese individuals compared with lean individuals. Adiponectin significantly regulates the metabolism of carbohydrates and lipids, increased utilization and transport glucose and free fatty acids into muscle, liver and fat cells. 1.3 Transcription factor PPARγ Adipocytes are derived from mesenchymal stem cells (MESCs), common precursors for adipocytes, osteoblasts, myocytes and chondrocytes. The key role in the differentiation process is played by transcription factors from the PPAR and C/EBP (CCAAT/enhancer-binding protein) 10 families (2). Among adipogenic transcription factors PPAR γ stands out as a key regulator obligate for in vitro as well as in vivo development of adipocytes (17). PPARγ influences the storage of fatty acids in the adipose tissue. With the C/EBP transcription factors, PPARγ is part of the adipocyte differentiation program that induces the maturation of pre-adipocytes into fat cells. Most of the PPARγ target genes in adipose tissue are directly implicated in lipogenic pathways, including lipoprotein lipase (LPL), adipocyte fatty acid binding protein (A-FABP or aP2), acyl-CoA synthase and fatty acid transport protein (FATP) (26). The PPARγ protein exists in two isoforms that are expressed from the same gene by utilizing distinct promoters. PPARγ2 differs from PPARγ1 by the presence of an additional stretch of 30 amino acid residues in the ligand-independent domain at the N-terminal end resulting in a higher transcriptional activity compared to PPARγ1 (23,25). The two PPARγ isoforms also show a distinct expression pattern: PPARγ1 is abundantly expressed in adipose tissue, large intestine, and hematopoietic cells, and to a lower degree in kidney, liver, muscles, pancreas, and small intestine. PPARγ2 is restricted to white and brown adipose tissue under physiological conditions (24). 1.4 AMP-activated protein kinase AMP-activated protein kinase (AMPK) has been proposed to function as a ‘fuel gauge’ to monitor cellular energy status in response to nutritional environmental variations. AMPK is a key regulator of cellular and whole-body energy homeostasis that co-ordinates metabolic pathways in order to balance nutrient supply with energy demand. Activation of AMPK protects cells from physiological and pathological stresses that lower cellular energy charge (increase the 11 AMP/ATP ratio) including nutrient starvation, hypoxia/ischaemia and exercise (16). Glucose uptake as well as fatty acid oxidation is stimulated by AMPK. Contrarily, lipogenesis, cholesterol synthesis and gluconeogenesis are inhibited by AMPK. AMPK functions as a heterotrimeric complex consisting of a catalytic (α) and regulatory (β and γ) subunits. n-3 PUFA activates the AMPK and plays that an important role in the regulation of lipid and glucose metabolism (20). Adipokines such as adiponectin and leptin are also potent activators of AMPK (8). 1.5 Beneficial effects n-3 LC PUFA Marine fish oils, namely long-chain (LC) polyunsaturated fatty acids (PUFA) of n-3 series (omega-3), such as docosahexaenoic acid (DHA; 22:6n-3), eicosapentaenoic acid (EPA; 20:5n-3) and docosapentaenoic acid (DPA, 22:5n-3) act as natural hypolipidaemic and anti-inflammatory agents and enhance various factors of the metabolic syndrome (5, 6, 13). Dietary intake of n-3 LC-PUFA is associated with a variety of cellular responses including changes in gene expression and FA composition of plasma membrane phospholipids, which could affect the synthesis of eicosanoids as well as the fluidity of biological membranes (12). Concerning of n-3 LC-PUFA in the context of obesity-associated insulin resistance, several potential mechanisms have been suggested: a) Limitation of lipotoxicity in insulin-sensitive tissues b) Elimination of inflammatory response in obese adipose tissue c) Beneficial changes in the secretory profile of adipose tissue- derived hormones adipokines, namely adiponectin 12 d) Formation of biologically active lipid mediators, i.e. resolvins and protectins e) Activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) 1.6 Thiazolidinediones Thiazolidinediones (TZDs) such as rosiglitazone and pioglitazone are among the preferred pharmacological agents in the treatment of insulin resistance in diabetic patients. Two major intracellular regulatory mechanisms are involved in the action of TZDs: (i) direct binding of TZDs to nuclear peroxisome proliferator activated receptor-γ (PPARγ), leading to the activation of a transcriptional program of adipocyte differentiation in adipose tissue, with a much less understood consequences in other tissues; and (ii) rapid stimulation of AMP-activated protein kinase (AMPK) in liver, skeletal muscle and other tissues (11). However, TZDs are also associated with unwanted side-effects, such as oedema and weight gain (21), increased risk of heart failure (15), and bone loss (10). 1.7 Oleuropein Olive oil is a source of at least 30 phenolic compounds, and particularly, extra virgin olive oil contains considerable amounts of phenolic compounds, e.g. hydroxytyrosol and oleuropein. In vitro, oleuropein reduces the expression of PPARγ, inhibits adipogenesis and enhances osteoblastogenesis in stem cells derived from human bone marrow (19). Oleuropein acts on 3T3-L1 cells to reduce preadipocyte differentiation and lipid accumulation and thus regulate the size of fat cells (4). 13 1.8 Caloric restriction Calorie restriction (CR) is an essential component in the treatment of obesity and associated diseases (18). Calorie restriction-signaling mutually interacts with AMPK, the sensor of energy state and the key regulator of fuels partitioning (22). Moreover, calorie restriction induces mitochondrial biogenesis in various tissues (7), with a relatively strong effect in white WAT (9, 14). The induction of mitochondria involves transcription factors PPARα/γ and PPARγ coactivator, PGC-1α (7, 14). 2. METHODS Animals and treatments Glucose homeostasis Murine 3T3-L1 cells/adipocytes Isolation, plating and culture condition of primary adipocytes Cell viability assays Trypan Blue assay WST-1 assay Oil red-O staining Reporter-gene assay Isolation RNA and RT – PCR Quantitative real time PCR The rate of fatty acid oxidation in isolated hepatocytes Statistical analysis 14 3. AIMS OF THE THESIS The general goal of the study is to improve the strategy for obesity treatment and prevention using n-3 fatty acids of marine origin in combination with anti-diabetic drugs from TZD family and other natural approaches, namely mild calorie restriction or the plant- derived polyphenols in dietary obese mice. Specific aims: 1. To study whether pioglitazone, a TZD-drug with partially diverse biological effects, approved for the treatment of diabetic patients until recently, could elicit the additive beneficial effects when combined with n-3 PUFA in mice fed obesogenic high-fat diet. Main focus of the experiments was to characterize the effects on body weight gain, as well as metabolic flexibility and glucose homeostasis, including the underlying mechanisms. The involvement of adiponectin, one of the major adipokines, was also investigated. 2. To verify a hypothesis whether combined treatment using n-3 PUFA and calorie restriction could induce additive beneficial metabolic effects in mice fed high-fat diet. Special focus was to characterize the involvement of WAT in the whole body responses to the combination treatment. 3. To characterize the molecular mechanism of the action of oleuropein, polyphenols extracted from olive leaves, using cell line 3T3-L1 and SVF isolated from gonadal and dorsolumbar adipose tissue of mice and differentiated in vitro. 15 4. RESULTS OF PUBLICATIONS Publication A Unasking differential effects of rosiglitazone and pioglitazone in the combination treatment with n-3 fatty acids in mice fed a high-fat diet. Kus V1, Flachs P, Kuda O, Bardova K, Janovska P, Svobodova M, Jilkova ZM, Rossmeisl M, Wang-Sattler R, Yu Z, Illig T, Kopecky J. (2011) PLOS ONE Volume: 6 Issue: 11 ( IF: 4.092; citations: 13) Fatty acids of marine origin, i.e. docosahexaenoic and eicosapentaenoic acid (DHA and EPA, respectively) act as hypolipidemics, but they do not improve glycemic control in diabetic patients. Thiazolidinediones (TZDs), like rosiglitazone and pioglitazone, i.e. specific activators of peroxisome proliferator- activated receptor-gamma improve whole-body insulin sensitivity. It was shown that a combination treatment using a DHA and EPA concentrate (DHA/EPA) and rosiglitazone provided, by complementary mechanisms, additive beneficial effects on dyslipidemia and impaired glucose tolerance (IGT) in obese mice. Aim of the project was to further study mechanism of action of TZDs, namely of roziglitazone and pioglitazone. Male C57BL/6 mice were fed high-fat diet. The effects of DHA/EPA (replacing 15% dietary lipids), rosiglitazone (10 mg/kg diet), or pioglitazone (50 mg/kg), or combination of both DHA/EPA and rosiglitazone or pioglitazone on body weight, adiposity, metabolic markers and adiponectin in plasma, liver and muscle triacylglycerol accumulation analyzed. Intraperitoneal glucose tolerance test was used to characterize the changes of glucose homeostasis. Metabolic 16 flexibility was tested between two limited condition – fasted and re- fed status. DHA/EPA and TZDs exerted additive effects in prevention of obesity, dyslipidemia, and IGT, while suppressing hepatic triacylglycerol accumulation and inducing adiponectin. The treatment also improved metabolic flexibility. In conclusion both type of TZD could be used in combination with DHA/EPA as complementary therapies to counteract dyslipidemia and insulin resistance. The combination treatment may reduce dose requirements and hence the incidence of adverse side-effects of the thiazolidinedione therapy. Publication B Synergistic induction of lipid catabolism and anti-inflammatory lipids in white fat of dietary obese mice in response to calorie restriction and n-3 fatty acids. Flachs P, Rühl R, Hensler M, Janovska P, Zouhar P, Kus V, Macek Jilkova Z, Papp E, Kuda O, Svobodova M, Rossmeisl M, Tsenov G, Mohamed-Ali V, Kopecky J. (2011) DIABETOLOGIA Volume: 54 Issue: 10 Pages: 2626-2638 (IF: 6,814; citations: 28) Calorie restriction (CR) is an essential component in the treatment of obesity and associated diseases. n-3 long chain polyunsaturated fatty acids (n-3 LC-PUFA) act as natural hypolipidemics, reduce risk of cardiovascular disease and could prevent development of obesity and insulin resistance. We aimed to characterize the efficacy and underlying mechanisms of the 17 combination treatment with n-3 LC-PUFA and mild CR in the prevention of obesity and associated disorders in mice. Male C57BL/6J mice were habituated to a corn oil-based high-fat diet (cHF) for 2 weeks and then randomly assigned to various dietary treatments for 5 weeks or 15 weeks: (i) cHF, ad libitum; (ii) cHF+F, cHF diet with n-3 LC-PUFA concentrate (EPAX 1050 TG) replacing 15% of dietary lipids, ad libitum; (iii) cHF+CR, cHF diet reduced by 10% as compared with the ad libitum cHF-fed mice; and (iv) cHF+F+CR. Compared with the cHF diet, the combination treatment (cHF+F+CR) most efficiently reduced body weight gain and the weight of both abdominal and subcutaneous white adipose tissue (WAT) depots, while it also improved insulin sensitivity (HOMA index) and glucose tolerance (OGTT). Ectopic lipid accumulation in the liver and skeletal muscle was also markedly decreased by the combination treatment. Moreover, the infiltration of WAT by macrophages, indicating a chronic low-grade inflammation of the tissue, was prevented by the cHF+F+CR treatment. Specifically in abdominal WAT, the conversion of PUFA to anti-inflammatory lipid mediators was additively induced by CR and n-3 LC-PUFA. For instance, the levels of 15-deoxy- prostaglandin J2 and neuroprotectin D1 were increased 6.6-fold and 35-fold, respectively, by the cHF+F+CR treatment as compared with the cHF mice. Furthermore, gene expression analysis revealed synergistic activation of PPARa/PGC-1 a signalling pathways by the cHF+F+CR treatment in abdominal WAT, but not in the liver, muscle or brown fat. The above effects of the combination treatment correlated with the rate of palmitate oxidation and mitochondrial respiratory capacity in WAT. Thus, the maximal rate of palmitate oxidation measured in epididymal WAT ex 18 vivo was 2-fold higher in the cHF+F+CR mice as compared with the cHF mice (60 .01 ± 8.04 vs. 24.73 ± 5.67 pmol 02/s/mg DNA; p = 0.012), when measured in the presence of FCCP, an uncoupler of oxidative phosphorylation. We show that n-3 LC-PUFA augment the anti-inflammatory and metabolic effects of CR through the induction of mitochondrial biogenesis and fatty acid oxidation in WAT, while inducing tissue- specific changes in the production of anti-inflammatory lipid mediators. Thus, this study reveals a new mechanism of anti- inflammatory and CR. Publication C Oleuropein as an inhibitor of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Svobodova M, Andreadou I, Skaltsounis AL, Kopecky J, Flachs P. (2014) GENES AND NUTRITION Volume: 9 Issue:1 (IF: 3,149; citations: 0) Oleuropein, which is a major phenolic compound found in olive leaves and oil, exerts numerous beneficial effects including antioxidant, anti-inflammatory, anti-atherogenic and anti-cancer activities. Furthermore, oleuropein suppresses the adipocyte differentiation in vitro. We aimed to further characterize molecular mechanisms underlying anti-adipogenic effects of oleuropein. 3T3-L1 cells and mouse primary culture of differentiated adipocytes from subcutaneous fat were used. The differentiation medium present during the first 48h contained 10% FCS, 2uM dexamethasone and 100 nM BRL and 5ug/ml insulin which is added for all 19 differentiation time. After 2 days differentiation the medium was replaced with DMEM containing 10% FCS and 5ug/ml insulin. Cell viability/proliferation was analyzed using Trypan blue and WST-1 assay, and triglycerides were stained with Oil Red O. Gene expression was analyzed by qRT-PCR. Cell based gene reporter assays for PPARα, PPARδ/β and PPARγ (GeneBLAzer, Invitrogen, USA) were used to study direct effects on transcriptional activity of peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs). Results: Oleuropein (>100 µM) decreased viability of proliferating preadipocytes and didn’t exerted cytotoxic effects in post confluent cells after induction of differentiation (up to 400 µM). Oleuropein dose-dependently (10 - 400 µM) inhibited adipocyte differentiation in both experimental models and suppressed gene expression of PPARγ, C/EBP1α, SREBP-1c and FAS. PPARα and PPARδ/β activity were not affected by oleuropein (10-200 µM). Contrary, PPARγ transcription activity was diminished by oleuropein (>100 µM). Oleuropein suppresses both preadipocyte proliferation and adipocyte differentiation in vitro. Moreover, our data suggest, that oleuropein exerts anti-adipogenic effect through direct inhibition of PPARγ activity. 5. DISCUSION Our experiments on dietary obese mice suggest that also n-3 LC- PUFA and TZDs may elicit beneficial additive effects with respect to treatment of impaired glucose tolerance and dyslipidaemia in diabetic patients. Thus in mice, only rosiglitazone but not pioglitazone in the combination with n-3 LC-PUFA prevented 20 accretion of body fat, in correlation with the inducibility of fatty acid β-oxidation. However, even in the absence of any effect on body weight in combination with anti-diabetic drugs, the combination treatment unmasked stronger effect of pioglitazone on glucose homeostasis, triglyceridaemia and hepatic steatosis, depending probably on the induction of adiponectin. Importantly, total cholesterol levels in plasma were strongly decreased in response to both TZDs in their combinations with n-3 LC-PUFA. Dietary n-3 LC PUFA augments the anti-obesity effects of mild calorie restriction while improving lipid metabolism and glucose homeostasis. These effects are probably reflected by the large synergistic induction of mitochondrial FA oxidation in WAT, linked to a suppression of low-grade inflammation of this tissue. The synergistic induction of specific anti-inflammatory lipid mediators, namely 15d-PGJ2 (the most potent endogenous activator of PPARγ;, the LC n-6 PUFA metabolite), and protectin D1, the LC n-3 PUFA metabolite, may underlie both the anti-inflammatory and metabolic effects of the combination treatment in WAT. Further exploration of the strategy to target WAT by combining two complementary and physiological approaches, i.e. dietary intake of LC n-3 PUFA and mild restriction of energy intake, may be valuable for the prevention and treatment of metabolic syndrome. Oleuropein suppresses adipocyte differentiation inhibiting both expression and activity of PPARγ. As also revealed in recent clinical trial (3), dietary supplementation by polyphenols from olive leaf, and namely oleuropein, may be used as part of novel therapeutic strategies for prevention and treatment of obesity and insulin 21 resistance. But for combination with anti-diabetic drugs due to suppressing the transcription factor PPARγ is probably not suitable. Table 1: Summary of effects on growth characteristics and metabolic features of mice n-3 LC PUFA + TZDs ( n-3 LC PUFA + vs. cHF diet) CR (vs. cHF diet) Energy Body weight balance gain decreased* decreased* Food intake no effect no effect Glucose homeostasis GTT (total AUC) decreased decreased Fasting glucose decreased decreased* HOMA-index decreased decreased* Metabolic flexibility (INCA) improved improved* Plasma (random fed) NEFA decreased* no data TAG decreased* decreased* Cholesterol decreased no data Glucose no data no chase increased (PIO)*, Adiponectin increased (ROSI) increased* Leptin decreased decreased* Insulin decreased* Decreased 22 WAT Subcutaneus WAT Total mass decreased* decreased* Adipocytes size decreased* decreased Insulin sensitivity increased* Increased Infammation (CLS)** decreased decreased Epididymal WAT Total mass decreased decreased* Insulin sensitivity increased* increased* Adipocytes size decreased decreased* Infammation (CLS)** decreased decreased* decreased (PIO)*, no Liver Weight effect (ROSI) decreased* Insulin sensitivity increased increased* Tissue lipid decreased (PIO)*, no content change (ROSI) decreased* Muscle (gastrocnemiu s) Weight no effect no effect Insulin sensitivity increased increased* Tissue lipid content no effect decreased *** Glycogen content increased* no data 23 * Additive effect of the combination treatment;**Number of CLS per 100 adipocytes; *** after 15 weeks of the treatment; Abbreviations: AUC, total area under the curve; CLS, crown like structure; GTT , glucose tolerance test; INCA, indirect calorimetry,N.D. not determined. Table 2: Gene expression n-3 LC PUFA + n-3 LC PUFA + TZDs CR (vs. cHF WAT ( vs. cHF diet) diet) Subcutaneus Fatty acid sytnetsis: WAT SCD1, FAS no effect no effect Fatty acid oxidation: CPT-1, PPARα no data increased* Mitochondrial biogenesis: PGC-1α no data no effect Glyceroneogenesis: PEPCK, PDK4 increase increase Epididymal Fatty acid sytnetsis: WAT SCD1, FAS no effect increased* Fatty acid oxidation: CPT-1, PPARα no effect no effect Mitochondrial biogenesis: PGC-1α increased big increased* Glyceroneogenesis: PEPCK, PDK4 increased increased* Glucose metabolism: Liver PDK4 no effect no effect Fatty acid sytnetsis: FAS decreased, decreased* 24 SCD1, FAS SCD1 increased Fatty acid oxidation: CPT-1, PPARα increased no effect Mitochondrial biogenesis: PGC-1α decreased* no effect Muscle (gastrocnemi Glucose metabolism: us) PDK4 no effect no effect Fatty acid sytnetsis: SCD1 no effect no effect Fatty acid oxidation: CPT-1 increased no effect CPT-1 Carnitine palmitoyltransferase I, PDK4 Pyruvate dehydrogenase lipoamide kinase isozyme 4, PEPCK Phosphoenolpyruvate carboxykinase, PGC-1α Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, PPARα Peroxisome proliferator-activated receptor alpha, SCD1 Stearoyl-CoA desaturase 25 6. CONCLUSIONS 1. Our results reveal differential effects of rosiglitazone and pioglitazone, unmasked in the combination treatment with n-3 LC-PUFA, and support the notion that n-3 LC-PUFA could be used as add-on treatment to TZDs in order to improve diabetic patient's therapy. 2. The dietary LC n-3 PUFAs augment the anti-obesity effects of mild calorie restriction in mice while improving lipid metabolism and glucose homeostasis. These effects probably reflect in large synergistic induction of mitochondrial fatty acid oxidation in white adipose tissue, linked to a suppression of low-grade inflammation of this tissue. 3. Oleuropein in vitro exerts anti-adipogenic effect through inhibition of both expression and activity of PPARγ. 26 7. References 1. Cannon B and Nedergaard J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev 84: 277-359, 2004. 2. Cho MC, Lee K, Paik SG, and Yoon DY. Peroxisome Proliferators-Activated Receptor (PPAR) Modulators and Metabolic Disorders. PPAR Res 2008: 679137, 2008. 3. de Bock M, Derraik JG, Brennan CM, Biggs JB, Morgan PE, Hodgkinson SC, Hofman PL, and Cutfield WS. Olive (Olea europaea L.) leaf polyphenols improve insulin sensitivity in middle-aged overweight men: a randomized, placebo-controlled, crossover trial. PLoS One 8: e57622, 2013. 4. Drira R, Chen S, and Sakamoto K. Oleuropein and hydroxytyrosol inhibit adipocyte differentiation in 3 T3-L1 cells. LIFE Sci 89: 708-716, 2011. 5. Flachs P, Rossmeisl M, Bryhn M, and Kopecky J. Cellular and molecular effects of n-3 polyunsaturated fatty acids on adipose tissue biology and metabolism. Clin Sci (Lond) 116: 1-16, 2009. 6. Flachs P, Rossmeisl M, and Kopecky J. The effect of n-3 fatty acids on glucose homeostasis and insulin sensitivity. Physiol Res 63 Suppl 1: S93-118, 2014. 7. Flachs P, Rühl R, Hensler M, Janovska P, Zouhar P, Kus V, Macek Jilkova Z, Papp E, Kuda O, Svobodova M, Rossmeisl M, Tsenov G, Mohamed-Ali V, and Kopecky J. Synergistic induction of lipid catabolism and anti-inflammatory lipids in white fat of dietary obese mice in response to calorie restriction and n-3 fatty acids. Diabetologia 54: 2626-2638, 2011. 27 8. Hardie DG. AMPK: a key regulator of energy balance in the single cell and the whole organism. Int J Obes (Lond) 32 Suppl 4: S7- 12, 2008. 9. Higami Y, Pugh TD, Page GP, Allison DB, Prolla TA, and Weindruch R. Adipose tissue energy metabolism: altered gene expression profile of mice subjected to long-term caloric restriction. FASEB J 18: 415-417, 2004. 10. Lazarenko OP, Rzonca SO, Hogue WR, Swain FL, Suva LJ, and Lecka-Czernik B. Rosiglitazone induces decreases in bone mass and strength that are reminiscent of aged bone. Endocrinology 148: 2669- 2680, 2007. 11. LeBrasseur NK, Kelly M, Tsao TS, Farmer SR, Saha AK, Ruderman NB, and Tomas E. Thiazolidinediones can rapidly activate AMP-activated protein kinase in mammalian tissues. Am J Physiol Endocrinol Metab 291: E175-181, 2006. 12. Lombardo YB and Chicco AG. Effects of dietary polyunsaturated n-3 fatty acids on dyslipidemia and insulin resistance in rodents and humans. A review. J Nutr Biochem 17: 1-13, 2006. 13. Mozaffarian D, Lemaitre RN, King IB, Song X, Huang H, Sacks FM, Rimm EB, Wang M, and Siscovick DS. Plasma phospholipid long- chain ω-3 fatty acids and total and cause-specific mortality in older adults: a cohort study. Ann Intern Med 158: 515-525, 2013. 14. Nisoli E, Tonello C, Cardile A, Cozzi V, Bracale R, Tedesco L, Falcone S, Valerio A, Cantoni O, Clementi E, Moncada S, and Carruba MO. Calorie restriction promotes mitochondrial biogenesis by inducing the expression of eNOS. Science 310: 314-317, 2005. 15. Nissen SE and Wolski K. Effect of rosiglitazone on the risk of myocardial infarction and death from cardiovascular causes. N Engl J Med 356: 2457-2471, 2007. 28 16. Oakhill JS, Scott JW, and Kemp BE. Structure and function of AMP-activated protein kinase. Acta Physiol (Oxf) 196: 3-14, 2009. 17. Rosen ED and Spiegelman BM. Molecular regulation of adipogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol 16: 145-171, 2000. 18. Sacks FM, Bray GA, Carey VJ, Smith SR, Ryan DH, Anton SD, McManus K, Champagne CM, Bishop LM, Laranjo N, Leboff MS, Rood JC, de Jonge L, Greenway FL, Loria CM, Obarzanek E, and Williamson DA. Comparison of weight-loss diets with different compositions of fat, protein, and carbohydrates. N Engl J Med 360: 859-873, 2009. 19. Santiago-Mora R, Casado-Díaz A, De Castro MD, and Quesada-Gómez JM. Oleuropein enhances osteoblastogenesis and inhibits adipogenesis: the effect on differentiation in stem cells derived from bone marrow. Osteoporos Int 22: 675-684, 2011. 20. Suchankova G, Tekle M, Saha AK, Ruderman NB, Clarke SD, and Gettys TW. Dietary polyunsaturated fatty acids enhance hepatic AMP-activated protein kinase activity in rats. Biochem Biophys Res Commun 326: 851-858, 2005. 21. Yang X and Smith U. Adipose tissue distribution and risk of metabolic disease: does thiazolidinedione-induced adipose tissue redistribution provide a clue to the answer? Diabetologia 50: 1127- 1139, 2007. 22. Zhang BB, Zhou G, and Li C. AMPK: an emerging drug target for diabetes and the metabolic syndrome. Cell Metab 9: 407-416, 2009. 23. Zhu, Y., C. Qi, J. R. Korenberg, X. N. Chen, D. Noya, M. S. Rao, and J. K. Reddy, 1995, Structural organization of mouse peroxisome proliferator-activated receptor gamma (mPPAR gamma) gene: 29 alternative promoter use and different splicing yield two mPPAR gamma isoforms: Proc Natl Acad Sci U S A, v. 92, p. 7921-5. 24. Vidal-Puig, A. J., R. V. Considine, M. Jimenez-Liñan, A. Werman, W. J. Pories, J. F. Caro, and J. S. Flier, 1997, Peroxisome proliferator-activated receptor gene expression in human tissues. Effects of obesity, weight loss, and regulation by insulin and glucocorticoids: J Clin Invest, v. 99, p. 2416-22. 25. Werman, A., A. Hollenberg, G. Solanes, C. Bjorbaek, A. J. Vidal-Puig, and J. S. Flier, 1997, Ligand-independent activation domain in the N terminus of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma). Differential activity of PPARgamma1 and -2 isoforms and influence of insulin: J Biol Chem, v. 272, p. 20230-5. 26. Memon, R. A., L. H. Tecott, K. Nonogaki, A. Beigneux, A. H. Moser, C. Grunfeld, and K. R. Feingold, 2000, Up-regulation of peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR-alpha) and PPAR- gamma messenger ribonucleic acid expression in the liver in murine obesity: troglitazone induces expression of PPAR-gamma-responsive adipose tissue-specific genes in the liver of obese diabetic mice: Endocrinology, v. 141, p. 4021-31. 27. Tilg, H., and A. R. Moschen, 2006, Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity: Nat Rev Immunol, v. 6, p. 772-83.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Michaela Svobodová, Ph.D. 2.87 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Michaela Svobodová, Ph.D. 770 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Michaela Svobodová, Ph.D. 849 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Michaela Svobodová, Ph.D. 770 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Monika Cahová, CSc., Ph.D. 212 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. MUDr. Marie Kunešová, CSc. 204 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 681 kB