velikost textu

Hlavní strukturní protein myšího polyomaviru: interakce s buněčnými strukturami

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Hlavní strukturní protein myšího polyomaviru: interakce s buněčnými strukturami
Název v angličtině:
Major capsid protein of mouse polyomavirus: interaction with cellular structures
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Lenka Horníková, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Jitka Forstová, CSc.
Oponenti:
RNDr. Šárka Němečková, DrSc.
MUDr. Zora Mělková, Ph.D.
Id práce:
84972
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
29. 6. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
myší polyomavirus, VP1, endocytosa, protein - proteinové interakce
Klíčová slova v angličtině:
mouse polyomavirus, endocytosis, protein - protein interactions
Abstrakt:
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený DNA virus. I když je tento virus zkoumán již více než 50 let, stále zůstává nezodpovězená otázka, jak virus dopraví svou genetickou informaci do jádra nebo jakým mechanismem jsou sestavovány viriony v infikovaných buňkách. V první části práce jsme se zaměřili na charakterizaci endocytické dráhy, kterou využívá myší polyomavirus k dopravě genetické informace do blízkosti jádra. Pomocí dominantně negativní mutanty kaveolinu 1 jsme ukázali, že internalizace a efektivní infekce MPyV není závislá na kaveolinu 1. MPyV při vstupu do buňky využívá časné endozomy. Pro produktivní infekci je nezbytné kyselé pH endozomů. Zabránění vstupu viru do časného endozomu (dominantně negativní mutanta GTPázy Rab 5) nebo zvýšení pH endozomů (chloridem amonným nebo bafilomycinem A1) vedla k drastickému snížení infektivity MPyV. Alkalizace endozomů měla za následek zadržování virionů v časných endozomech, což naznačuje, že virus je dále transportován do pozdního endozomu. Pomocí metody FRET jsme potvrdili, že MPyV je v perinukleárním prostoru lokalizován v recyklujících endozomech. Dalším, dosud málo charakterizovaným dějem životního cyklu MPyV je morfogeneze virionu. Jaderné a celobuněčné lyzáty infikovaných buněk nebo buněk transientně produkujících hlavní kapsidový protein MPyV, VP1, byly separovány modrou nativní elektroforézou (BN-PAGE) pro charakterizaci buněčných proteinů přítomných v prekurzorech virionů. Pomocí BN-PAGE jsme nalezli několik proteinových komplexů obsahujících protein VP1. Některé tyto proteinové komplexy obsahovaly buněčný protein Hsp 70. I když interakce mezi proteinem VP1 a Hsp 70 byla popsána již dříve, toto je poprvé, kdy bylo detekováno několik odlišných forem VP1-Hsp 70 komplexu. Žádný z komplexů obsahující protein VP1 nebyl zastoupen natolik, aby mohl být analyzován hmotnostní spektrometrií. Proto byly připraveny plazmidy umožňující expresi proteinu VP1 fúzovaného na N- nebo C- konci s kotvou BioEase Tag (Invitrogen), která umožňuje in vivo biotinylaci fúzního proteinu a jeho následnou izolaci afinitní chromatografií. Fúzní proteiny s navázanými interagujícími proteiny byly izolovány afinitní chromatografií a jednotlivé složky izolovaných komplexů byly analyzovány hmotnostní spektrometrií. Identifikovali jsme buněčné proteiny Hsp 90α, GAPDH a cytoskeletární keratin typ I. Ověření interakcí těchto buněčných proteinů s proteinem VP1 jakožto i jejich případné zapojení v morfogenezi virionu a životním cyklu viru bude předmětem dalšího zkoumání. Klíčová slova: myší polyomavirus, časný endozom, protein VP1, modrá nativní elektroforéza, Hsp 70, protein-proteinové interakce
Abstract v angličtině:
Mouse polyomavirus (MPyV) is small non-enveloped DNA virus. Although this virus has been studied for almost 60 years, it still remains unclear, how can virus transport its genetic information to the cell nucleus. Also, the mechanism of virion morphogenesis is not well understood. First part of this work is focused on endocytic pathway which is used by MPyV for trafficking toward the cell nucleus. Using dominant negative mutant of caveolin-1 we showed that caveolin-1dependent endocytic pathway, described for SV40, is not used by MPyV for productive infection. MPyV is transported to early endosomes. Acidic milieu of endosomes is indispensable for productive infection. Preventing virus localisation into early endosomes (dominant negative mutant of Rab 5 GTPase) or endosomes alkalisation (by ammonium chloride or bafilomycin A1) led to dramatic decrease of virus infectivity. Alkalisation of endosomes entailed retention of MPyV in early endosomes. It indicates that virus is further transported to late endosomes. Finally, we confirmed by FRET that MPyV is in perinuclear space localized into recycling endosomes. Another poor characterized process is virion morphogenesis. To characterize the participation of cellular proteins in virion precursor complexes, nuclear as well as whole-cell lysates of infected cells or cells transiently expressing VP1 were separated by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Several VP1 positive protein complexes were identified. Some of these complexes contained proteins from the heat shock protein 70 family. Although the interaction between VP1 and hear shock proteins has been described previously, this is the first time that BN-PAGE has been shown to detect several different forms of VP1-Hsp 70 complexes. None of the VP1-positive bands was abundant enough to be analysed by mass spectrometry. Therefore, we created plasmids which allow expression of VP1 fused with BioEase Tag (Invitrogen) at its N or C terminus. This tag ensures in vivo biotinylation and purification by affinity chromatography of fusion protein. Complexes of fusion proteins and cellular proteins were isolated by affinity chromatography and composition of the complexes were analysed by mass spectrometry. Cellular proteins Hsp 90α, GAPDH and keratin type I were identified. Confirmation of interaction between VP1 and these cellular proteins as well as their roles in virion assembly and virus life cycle remains to be elucidated. Key words: mouse polyomavirus, early endosome, VP1 protein, blue native polyacrylamide gel electrophoresis, Hsp 70, protein-protein interactions
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Lenka Horníková, Ph.D. 3.28 MB
Stáhnout Příloha k práci RNDr. Lenka Horníková, Ph.D. 3.06 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Lenka Horníková, Ph.D. 121 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Lenka Horníková, Ph.D. 61 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Šárka Němečková, DrSc. 91 kB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Zora Mělková, Ph.D. 79 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 955 kB