velikost textu

Mouse polyomavirus: The role of cell cytoskeleton in virus endosomal trafficking and properties of the minor capsid proteins

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Mouse polyomavirus: The role of cell cytoskeleton in virus endosomal trafficking and properties of the minor capsid proteins
Název v češtině:
Myší polyomavirus: Role buněčného cytoskeletu v endozomálním transportu viru a vlastnosti minoritních kapsidových proteinů
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Vojtěch Žíla, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Jitka Forstová, CSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Pavel Hozák, DrSc.
Ing. Michaela Rumlová, Ph.D.
Id práce:
84813
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
19. 9. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
Myší polyomavirus, pohyb virionů, stukturní proteiny
Klíčová slova v angličtině:
Mouse polyomavirus, trafficking, structural proteins
Abstrakt:
ABSTRAKT Myší polyomavirus (MPyV) je neobalený tumorogení DNA virus, replikující se v jádře hostitelské buňky. Do buněk vstupuje endocytózou zprostředkovanou receptorem a jeho následný transport k jádru je závislý na kyselém prostředí endozomů a vláknech mikrotubulů, potřebných pro dopravení virionů do endoplazmatického retikula (ER). V ER dochází k disociaci virové kapsidy a rozbalení genomu viru. Mechanizmus, kterým je virový genom následně dopraven do nukleoplazmy není doposud objasněn, ale předpokládá se, že se ho kromě buněčných faktorů účastní také virové minoritní kapsidové proteiny VP2 a VP3. Po dopravení genomu do jádra dochází k produkci časných virových antigenů, které navozují vhodné prostřední pro replikaci viru. Po replikaci virové DNA a morfogenezi virionů, virové potomstvo opouští buňku během její lyze. Výzkum této disertační práce se ve své první části zaměřil na vnitrobuněčný transport MPyV a zapojení cytoskeletárních sítí během dopravy viru do ER. Zejména byl zacílen na stále nejasnou roli mikrotubulů během transportu viru v endozómech a na roli asociovaných mikrotubulárních motorů, která v případě MPyV nebyla doposud testována. Náš výzkum ukázal, že transport MPyV vedoucí k produktivní infekci nevyžaduje funkci kinesinu-1 či kinesinu-2, ale je závislý na transportu zprostředkovaném mikrotubulární motorem dyneinem. Funkce dyneinu se ukázala potřebná pro efektivní translokaci virionů z periferie buněk, často z kompartmentů připomínajících multikaveolární komplexy, do časných a pozdních endozómů a dále pro dopravení virionů do ER. I přesto, že na mikrotubulech závisel i transport viru do recyklujících endozómů, tyto kompartmenty se neukázaly jako potřebné pro produktivní infekci. Ve své druhé části se výzkum zaměřil na studium vlastností minoritních kapsidových proteinů VP2 a VP3. Minoritní kapsidové proteiny jsou nepostradatelné pro dopravení virového genomu do jádra. U obou minoritních proteinů byla demonstrována afinita k arteficielním membránám, a u proteinu VP2 schopnost tyto membrány perforovat. Tyto výzkumy tak naznačují, že interní minoritní strukturní proteiny, exponované po disociaci kapsidy v ER, mohou přispívat k translokaci virového genomu z ER do nukleoplazmy. My jsme připravili fúzní varianty minoritních kapsidových proteinů s fluorescenčním proteinen EGFP, pro jejich individuální expresi v savčích buňkách bez přítomnosti ostatních genových produktů MPyV. Biochemické analýzy ukázaly, že minoritní proteiny MPyV jsou cytotoxické a že jsou silnými induktory apoptotických procesů. Konfokální a immuno-elektronová mikroskopie ukázala schopnost obou minoritních proteinů interagovat s vnitrobuně- čnými membránami a poškozovat je, což naznačuje mechanizmus zodpovědný za jejich cytotoxicitu. Nicméně, analýza apoptotických markerů a kinetiky smrti buněk transfekovaných genomem MPyV divokého typu či genomem mutovaným v iniciačních kodónech pro translaci VP2 a VP3 ukázala, že minoritní proteiny významně nepřispívají k indukci apoptotických procesů během infekce, a že jsou zcela postradatelné pro destrukci buňky na konci replikačního cyklu viru. Tyto výsledky tak indikují preferenční roli minoritních kapsidových proteinů během vstupu viru do buněk a dopravení virového genomu do jádra.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Mouse polyomavirus (MPyV) is a non-enveloped DNA tumor virus, which replicates in the host cell nucleus. MPyV enters cells by receptor-mediated endocytosis and its subsequent transport towards the nucleus requires acidic environment of endosomes and intact microtubules, which are important for virus delivery to endoplasmic reticulum (ER). In ER, capsid disassembly and uncoating of viral genome take place. The mechanism of subsequent translocation of viral genome from ER into nucleoplasm is still only poorly understood process with predicted involvement of cellular factors and viral minor capsid proteins VP2 and VP3. Once the genome appears in the nucleus, early viral antigens are produced and mediate suitable environment for replication of viral genomes. After replication of viral DNA and morphogenesis of virions, virus progeny is released from the cells during its lysis. The research presented in the first part of thesis focused on intracellular transport of MPyV and involvement of cytoskeletal networks during virus delivery to the ER. In particular, we investigated still unclear role of microtubules during virus trafficking in endosomes, and involvement of microtubular motors. We found that MPyV trafficking leading to productive infection does not require the function of kinesin-1 and kinesin-2, but depends on functional dynein-mediated transport along microtubules. Dynein was shown to mediate translocation of virions from peripheral often multicaveolar-like compartments to the early and late endosomes, and further virus trafficking to the ER. Despite microtubules were also found to mediate virus transport to recycling endosomes, these compartments were showed to be dispensable for productive infection. In the second part, research focused on properties of the minor capsid proteins VP2 and VP3. Minor capsid proteins were showed to be indispensable for delivery of viral genome into the nucleus. The affinity of both minor proteins to artificial membranes and ability of VP2 protein to perforate these membranes were demonstrated. These finding thus suggest that the internal minor capsid proteins, exposed after capsid disassembly in the ER, might contribute to translocation of viral genome from ER to nucleoplasm. We prepared fusion variants of minor capsid proteins by linking them to enhanced green fluorescent protein (EGFP) and tested them during their individual expression in the absence of other MPyV gene products. Our biochemical studies proved each of the minor proteins to be a very potent inducer of apoptosis. Confocal and immunoelectron microscopy analyses showed ability of both minor proteins to interact with and damage the intracellular membranes, suggesting the mechanism of their cytotoxicity. Nevertheless, further analysis of apoptotic markers and cell death kinetics in cells transfected with MPyV genome mutated in both VP2 and VP3 translation start codons revealed that the minor proteins are only moderate contributors to apoptotic processes during infection and dispensable for cell destruction at the end of the virus replication cycle. These results thus indicate the role of the minor capsid proteins preferentially during virus entry and delivery of viral genome into the cell nucleus.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Vojtěch Žíla, Ph.D. 15.26 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Vojtěch Žíla, Ph.D. 112 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Vojtěch Žíla, Ph.D. 49 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Pavel Hozák, DrSc. 81 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Michaela Rumlová, Ph.D. 753 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 728 kB