velikost textu

Úloha mutace genu LIF a relativní zastoupení NK buněk, NKT a T lymfocytů ve folikulární tekutině a krvi žen s různou anamnézou neplodnosti

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Úloha mutace genu LIF a relativní zastoupení NK buněk, NKT a T lymfocytů ve folikulární tekutině a krvi žen s různou anamnézou neplodnosti
Název v angličtině:
The role of LIF gene mutations and the relative distribution of NK cells, NKT and T lymphocytes in follicular fluid and blood of women with different history of infertility
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Jiří Křížan, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Petr Šíma, CSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Věra Jonáková, DrSc.
RNDr. Zuzana Kročová, Ph.D.
Id práce:
84630
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Imunologie (P1517)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
16. 2. 2011
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
mutace LIF, neplodnost, IVF, folikulární tekutina, primární neplodnost, nuligravidita, idiopatická neplodnost, endometrióza, tubální faktor, ovariální faktor, PCOS, NK buňky, NKT lymfocyty, T lymfocyty, TGGE, průtoková cytometrie
Klíčová slova v angličtině:
LIF mutation, infertility, IVF, follicular fluid, primary infertility, nulligravidity, idiopathic infertility, endometriosis, tubal factor, ovarial factor, PCOS, NK cells, NKT lymphocytes, T lymphocytes, TGGE, flow cytometry
Abstrakt:
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Autoreferát dizertační práce Úloha mutace genu LIF a relativní zastoupení NK buněk, NKT a T lymfocytů ve folikulární tekutině a krvi žen s různou anamnézou neplodnosti Jiří Křížan Praha 2010 Doktorské studijní programy v biomedicíně Univerzita Karlova v Praze a Akademie věd České republiky Program: Biomedicína Předseda oborové rady: Doc. RNDr. Vladimír Holáň, Dr.Sc. Školicí pracoviště: Mikrobiologický ústav, v.v.i., AV ČR Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4 tel: +420 296 442 318 Autor: Mgr. Jiří Křížan Školitel: RNDr. Petr Šíma, CSc. S disertací je možno se seznámit na děkanátě Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze 1|Stránka OBSAH Obsah 2 Souhrn 3 1. Úvod 5 2. Hypotézy a cíle práce 6 3. Materiál a metodika 7 Materiál: 7 Metodika: 8 4. Výsledky 10 5. Diskuse 12 6. Závěry 15 7. Použitá literatura 16 Seznam publikací doktoranda v tomto uspořádání: 18 1. publikace in extenso (podkladem dizertace) 18 2. publikace in extenso (bez vztahu k dizertaci) 19 2|Stránka SOUHRN Cílem dizertační práce „Úloha mutace genu LIF a relativní zastoupení NK buněk, NKT a T lymfocytů ve folikulární tekutině a krvi žen s různou anamnézou neplodnosti“ bylo stanovit, zda diagnostikované příčiny neplodnosti jsou v přímé souvislosti s některými mutacemi genu LIF, které by se mohly odrazit ve změnách zastoupení subpopulací imunokompetentních buněk a expresi některých povrchových markerů. Detekce mutací LIF byla provedena teplotní gradientovou gelovou elektroforézou. Relativní zastoupení subpopulací NK buněk, NKT a T lymfocytů ve FF a PB bylo stanoveno průtokovou cytometrií. V endometriu neplodných žen podstupujících opakovaně IVF byly stanoveny změny v zastoupení imunokompetentních buněk s markery CD3, CD16 a CD56. Patnáct neplodných žen s mutací LIF zahrnutých do této studie, je doposud nejpočetnější skupinou, která byla sledována. Potvrdili jsme, že samotná mutace LIF na pozici 3400 není příčinou jejich neplodnosti. Z našich výsledků vyplývá, že u žen s mutací LIF je nejnižší úspěšnost IVF u diagnóz IN a EM. Z toho lze usuzovat, že u těchto žen ovlivňují úspěšnost IVF i jiné faktory, např. změny v zastoupení některých populací imunokompetentních buněk, anebo změny jejich funkčního projevu po interakci s produkty alel LIF, případně jiné, ještě neznámé mechanizmy (v úvahu připadá i průměrný vyšší věk u těchto skupin). Výsledky této práce naznačují, že stanovení změn v zastoupení NK buněk, NKT a T lymfocytů ve FF jsou pro diagnostiku neplodnosti a predikci úspěšnosti IVF důležitější než vyšetření PB. Zjistili jsme rovněž, že v proliferačním endometriu u všech neplodných žen se vyskytují nižší počty 3|Stránka imunokompetentních buněk nesoucích markery CD3+, CD16+ a CD56+. Rovněž tento poznatek bylo možné využít pro diagnostické účely. 4|Stránka 1. ÚVOD Názory na funkci imunitního systému procházejí neustálým vývojem. Postupně se zjišťuje jeho regulační vliv i na jiné funkce organismu, než je obrana před patogeny a imunitní dohled. Ukázalo se, že v kooperaci s nervovým a endokrinním systémem reguluje průběh menstruačního cyklu i těhotenství. Dozrávání vajíčka a jeho další osud po oplození je determinován humorálním a buněčným složením FF (včetně imunocytů a obklopujícími podpůrnými buňkami kumulu), hormony a neurotransmitery, ale také produkty mutací genu kódujícího cytokin LIF. Genetická determinace i jakákoliv nerovnováha mezi humorální a buněčnou složkou se odrazí v poruchách plodnosti. 5|Stránka 2. HYPOTÉZY A CÍLE PRÁCE Cílem práce bylo stanovit, zda diagnostikované příčiny neplodnosti jsou v přímé souvislosti s některými mutacemi genu LIF, které by se mohly odrazit ve změnách zastoupení hlavních subpopulací imunokompetentních buněk. Za tímto účelem byla provedena analýza mutací LIF pomocí teplotní gradientové gelové elektroforézy (TGGE), a ve FF a PB průtokovou cytometrií stanoveno relativní zastoupení subpopulací NK buněk, NKT a T lymfocytů. V endometriu neplodných žen podstupujících opakovaně IVF byly stanoveny změny v zastoupení imunokompetentních buněk s markery CD3, CD16 a CD56. 6|Stránka 3. MATERIÁL A METODIKA Materiál: 96 jamkové mikrotitrační destičky s kulatým dnem (Dynex Inc., USA); mikrozkumavky (Alpha Inc., Británie); sterilní centrifugační zkumavky 15 ml (Roth Inc., USA); Polybond Film (Whatman); zkumavky na nesrážlivou krev (K3EDTA) (Vacuette ®); DNeasy Tissue Kit (QIAgen, Hilden, Germany); Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA) Chemikálie pro přípravu roztoků: Acryl-Glide (Amresco), chemikálie (Lachema s.r.o., ČR) HCl, KCL, Na2HPO4 . 12 H2O, NaCl, NaH2PO4 . 2 H2O, NaHCO3, NaOH, NaN3, želatina, NH4Cl, KHCO3, Na2EDTA, MOPS, bromphenol blue, glycerol, akrylamid, TEMED, APS, etanol, formaldehyd, AgNO3, HNO3, kyselina octová Roztoky: Fosfát-fyziologický (10xPBS), pro průtokovou cytometrii, lyzační pro průtokovou cytometrii (10xACK), pro TGGE (50x MOPS buffer), pro TGGE (10x loading buffer), pro TGGE (40 % akrylamid (37,5 AA: 1 bisAA), pro akrylamidový gel pro TGGE (8 % AA, 6 M urea), pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) Přístroje: analytické váhy (Precisa Instrument AG, Švýcarsko); FACS LSR II (Becton Dikinson, SJ, USA); laminární a UV box (Jouan Inc., Francie); světelný mikroskop (Carl-Zeiss, Německo); univerzální chlazená centrifuga (Hermle AG, Francie); PCR cycler; TGGE (Biometra, Goettingen, Germany); sekvenátor ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems) 7|Stránka Metodika: Kontrolovaná ovariální hyperstimulace byla prováděna podáním gonadotropních hormonů v kombinaci s agonisty nebo antagonisty hormonu uvolňující gonadotropin (GnRH) (Lukassen et al. 2003). Tento postup byl upraven podle odpovědi každé ženy na hyperstimulaci. K izolaci DNA z lymfocytů pro analýzu LIF byl použit DNeasy Tissue Kit (QIAgen, Hilden, Germany) podle standardního protokolu. Celkem bylo analyzováno pět úseků genu LIF (dvě exon intronové oblasti exonů 1 a 2, a exon 3 rozdělaný na tři úseky včetně intronových junkcí). PCR produkty byly analyzovány pomocí teplotní gradientové gelové elektroforézy (TGGE). Pozitivní vzorky z TGGE byly sekvenovány na sekvenátoru ABI Prism 310 (PE/Applied Biosysteme, Foster City, USA). K stanovení relativního zastoupení populací NK buněk, NKT a T lymfocytů byl používán FC LSR II BD™. Fenotypická analýza buněk FF a PB byla provedena v jednom kroku šesti barevným značením (CD3 PE-A750, EXBIO, Vestec, Praha, CZ; CD16 PB™, BD PharMingen, San Diego, California, USA; CD45 PO, Caltag Laboratories, Burlingame, California, USA a CD56 APC, EXBIO, Vestec, Praha, CZ a mrtvé buňky byly značeny PI, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) v den odběru vzorků od žen podstupující IVF. Data byly počítačově analyzovány příslušným komerčním programem a statisticky vyhodnoceny programem FlowJo. U žen s poruchou plodnosti, u nichž byla provedena hysteroskopie a biopsie endometria, byly sledovány markery mAB CD3, CD16 a CD56 pro stanovení hlavních imunokompetentních buněčných populací. Kontrolní skupinu tvořily plodné ženy, u nichž byla prováděna konizace z důvodu 8|Stránka displastických změn na děložním čípku. Vzorky endometria pro stanovení imunokompetentních buněk byly poskytnuty Šiklovým patologicko-anatomický ústavem Fakultní nemocnice Plzeň. 9|Stránka 4. VÝSLEDKY Přítomnost mutace LIF je ve skupině neplodných žen signifikantně vyšší při srovnání s plodnými ženami (p < 0,01). Ve skupině žen s mutací LIF a s diagnózou IN byla úspěšnost IVF 3% ve srovnání s ostatními skupinami neplodnosti (úspěšnost IVF u EM 17 %, PCOS 17 %, a úspěšnost IVF u hyperprolaktinémie a AF 100 %). Z porovnání vyplývá, že ve srovnání se zdravými kontrolními ženami se u neplodných žen statisticky průkazně častěji vyskytují mutace v genu LIF (p < 0,05), které navíc nejsou výhradně vázány na ženy s primární neplodností a ženy s diagnózou IN. Srovnáním skupin A a B (mutace LIF), a C a D (bez mutace LIF) se neukázal statisticky signifikantní rozdíl. Avšak při porovnání úspěšnosti otěhotněni u skupin A a B se statisticky signifikantní rozdíl objevil (p = 0,01). U žen s diagnostikovanou poruchou plodnosti (skupina C) došlo ke statisticky průkaznému snížení imunoregulačních NK buněk (p < 0,05) a současně také ke statisticky průkaznému snížení NKT lymfocytů (p < 0,05) ve srovnání s kontrolní skupinou (AF) ve FF. V relativním zastoupení CD122 a CD161 nedošlo k významným rozdílům mezi skupinami C a D a rovněž i A a B. Zastoupení buněčných populací nesoucích tyto markery bylo srovnatelné v FF i PB, Největší úspěšnost IVF byla dosažena u žen s AF, kde otěhotnělo 19 % žen, u ostatních skupin bylo IVF méně úspěšné (TF 9 %, OF 6 %, EM 6 % a IM 0 %). U žen, které neotěhotněly po IVF (skupina A), bylo prokázáno statisticky průkazné zvýšení zastoupení imunoregulačních NK buněk a NKT lymfocytů a statisticky neprůkazné zvýšení zastoupení T lymfocytů ve FF ve srovnání s ženami, které po IVF 10 | S t r á n k a otěhotněly (skupina B). Zastoupení ostatních populací se neměnilo. U žen skupiny A došlo ke statisticky průkaznému zvýšení T lymfocytů v PB ve srovnání se ženami skupiny B. Zastoupení ostatních populací se neměnilo. U žen s diagnózou neplodnosti bylo procentuální zastoupení buněk CD3+, CD16+ a CD56+ celkově vyšší, než u žen kontrolních. Nesignifikatní nárůst byl zaznamenán u CD3+ buněk (neplodné 6,6 %, kontrolní 10,1 %). U CD16+ a CD56+ buněk nebyly nalezeny rozdíly mezi kontrolními a neplodnými. U žen s proliferačním endometriem bylo procentuální zastoupení buněk CD3+, CD16+ a CD56+ nesignifikantně vyšší, než u žen s neproliferačním endometriem. Výrazný nárůst byl zaznamenán u CD3+ buněk (proliferační e. 8,1 %, neproliferační e. 4,0 %). 11 | S t r á n k a 5. DISKUSE Většina neúspěšných ET byla u žen s IN. Všechny ženy s diagnózou neplodnosti (PCOS, AF, hyperprolaktinémie), kromě jedné, otěhotněly již po prvním ET. Lze usuzovat, že u žen s EM a hlavně u žen s IN hrají vliv kromě mutace LIF i jiné faktory, které úspěšné nidaci zabraňují. To potvrzují hodnoty získané po přepočtení úspěšnosti IVF na jeden cyklus (velmi nízká úspěšnost IVF u diagnózy IN 3 % a nižší úspěšnost IVF u diagnózy EM 17 %). Úspěšnost IVF u žen s diagnózou PCOS (17 %) je po přepočtení na cyklus IVF srovnatelná s úspěšností u EM. U žen s diagnózou hyperprolaktinémie a AF byla úspěšnost IVF 100 %. U žen s diagnózami hyperprolaktinémie a AF lze usuzovat, že LIF mutace na úspěšnost IVF je minimální. Neúspěšnost IVF u diagnóz IN a EM ve srovnání s ostatními skupinami diagnóz lze přisoudit také vyššímu věku žen (maximální věkový rozdíl 8 let). Tyto výsledky prokazují, že mutace LIF mají vliv na průběh nidace a časné embryogeneze a tím úspěšnost IVF. Proto někteří autoři považují suplementace medií nemutovaným LIF a dalšími růstovými faktory za perspektivní směr při IVF (Cheung et al. 2003; Sirisathien et al. 2003). Některé práce přinesly důkaz, že nemutovaný LIF vývoj a morfologii blastocysty ovlivňuje (Cheung et al. 2003; Sirisathien et al. 2003). Proto se substituce LIF u neplodných žen při IVF používala (Borini et al. 1997; Giess et al. 1999). Naše výsledky však dokazují, že mutace LIF nejsou pro úspěšnost IVF rozhodující. Zjistili jsme je také u žen, které měly diagnostikovány časné aborty (Králíčková et al. 2006). Lze předpokládat, že mutovaný LIF ovlivňuje průběh embryo- maternální komunikace při nidaci a v pozdějších fázích embryogeneze. Možným zdůvodněním úspěšnosti IVF u žen 12 | S t r á n k a s mutací LIF je regulace nidace jinými faktory, především cytokiny, které jsou produkovány lymfocyty v endometriu. Jak se domnívá Moffet-King (2002), procházejí endometriální lymfocyty během menstruačního cyklu morfologickými, biochemickými změnami, které úspěšnou nidaci a udržování těhotenství podporují. Z našich výsledků vyplývá, že úspěšnost IVF u žen s mutací LIF závisí na diagnóze typu neplodnosti. Nejnižší úspěšnost IVF je u žen s diagnózou IN a EM (Novotný et al. 2009). Vysvětlením může být rozdílné zastoupení NK buněk a jejich funkční změny po interakci s produkty alel LIF, anebo ji u těchto žen zapříčiňují dosud neznámé mechanizmy. Signifikantní pokles zastoupení imunoregulačních NK buněk ve FF byl prokázán u žen s neúspěšnou IVF. Tento nález je v souladu s výsledky studií, které přisuzují této subpopulaci NK buněk významnou úlohu při decidualizaci endometria (King 2000). Jejich diagnostické stanovení by mohlo být důležité pro predikci úspěšnosti IVF (Coulam a Roussev 2003). Zvýšené relativní zastoupení NKT lymfocytů ve FF jsme zaznamenali u žen s neúspěšnou IVF (Křížan et al. 2009). Na rozdíl od publikovaných údajů, že zvýšené relativní množství NKT lymfocytů v PB je indikací opakovaných potratů nebo selhání implantace (Van Den Heuvel et al. 2007), nebyly prozatím práce zabývající se NKT lymfocyty ve FF referovány, a tudíž nelze naše výsledky porovnávat s jinými nálezy. Snížení počtu T lymfocytů jsme zaznamenali u žen s neúspěšnou IVF v PB i ve FF. I když ve FF toto snížení signifikantní nebylo, lze usuzovat, že T lymfocyty jsou dalším indikujícím faktorem úspěšnosti IVF. Statisticky průkazné snížení relativního zastoupení imunoregulačních NK buněk a NKT lymfocytů ve FF jsme zjistili u žen s diagnózami typů 13 | S t r á n k a neplodnosti v porovnání s ženami, u nichž příčina neplodnosti diagnostikována nebyla. V dostupné literatuře nejsou změny v relativním zastoupení NK buněk, NKT a T lymfocytů ve FF asociovány s žádnou poruchou neplodnosti. Do souvislosti se samovolnými potraty je dáváno pouze snížení početnosti imunoregulačních NK buněk v PB (Michou et al. 2003). Zvýšené relativní množství cytotoxických NK buněk je spojováno s IN a selháním nidace (King 2000; Koopman et al. 2003; Lukassen et al. 2003). Lze tedy opět usuzovat, že stanovení imunoregulačních NK i cytotoxických NK buněk může predikovat úspěšnost IVF. 14 | S t r á n k a 6. ZÁVĚRY Doposud bylo popsáno šest odlišných mutací LIF, z nichž jedna (v nekódující oblasti) u žen bez poruchy reprodukce. Mutace LIF samotná nezpůsobuje neplodnost, jen je jedním z faktorů snižující reprodukční kompetenci nejen v době nidace, ale i v průběhu těhotenství. Dále jsme zjistili, že mutace LIF není zcela výhradně vázána na nuligravidní ženy (primárně neplodné) jak bylo dříve předpokládáno, ale mohou se vyskytovat také u jiných diagnóz neplodnosti. Ukázalo se, že nejvíce mutací je u žen s diagnózami EM a IN, u nichž je nejnižší úspěšnost IVF. Protože mutace LIF v populaci neplodných žen nejsou tak časté, je jejich zjišťování pro predikci úspěchu IVF méně důležité, ale přesto může být velmi užitečné pro studium příčin neplodnosti. Mutace LIF mohou indukovat imunologické změny, které by mohly doposud neznámým způsobem narušit rovnováhu procesů regulujících otěhotnění. Vyšší relativní zastoupení imunoregulačních NK buněk ve FF, které jsme zjistili u žen s AF a žen, u nichž se IVF zdařila, což je v souladu s nálezy jiných autorů (Michou et al. 2003). Nižší relativní zastoupení NKT lymfocytů ve FF a T lymfocytů v PB jsme zjistili u žen s úspěšnou IVF. Závěrem lze říci, že výsledky této dizertační práce potvrzují, že poruchy reprodukce při IVF jsou spojeny se změnami buněčnosti ve FF, PB i endometriu, a lze jejich diagnostiku doporučit pro predikci úspěšnosti IVF. 15 | S t r á n k a 7. POUŽITÁ LITERATURA Borini, A., Bulletti, C., Cattoli, M., Serrao, L., Polli, V., Alfieri, S. Flamigni, C.: Use of recombinant leukemia inhibitory factor in embryo implantation. Annals of the New York Academy of Sciences 828, 157- 161 (1997). Coulam, C.B. Roussev, R.G.: Correlation of NK cell activation and inhibition markers with NK cytoxicity among women experiencing immunologic implantation failure after in vitro fertilization and embryo transfer. Journal of assisted reproduction and genetics 20, 58-62 (2003). Cheung, L.P., Leung, H.Y. Bongso, A.: Effect of supplementation of leukemia inhibitory factor and epidermal growth factor on murine embryonic development in vitro, implantation, and outcome of offspring. Fertility and sterility 80 Suppl 2, 727-735 (2003). Giudice, L.C.: Genes associated with embryonic attachment and implantation and the role of progesterone. J Reprod Med 44, 165-171 (1999). King, A.: Uterine leukocytes and decidualization. Hum.Reprod.Update. 6, 28-36 (2000). Koopman, L.A., Kopcow, H.D., Rybalov, B., Boyson, J.E., Orange, J.S., Schatz, F., Masch, R., Lockwood, C.J., Schachter, A.D., Park, P.J. Strominger, J.L.: Human decidual natural killer cells are a unique NK cell subset with immunomodulatory potential. The Journal of experimental medicine 198, 1201-1212 (2003). Králíčková, M., Šíma, R., Vaněček, T., Šíma, P., Rokyta, Z., Ulčová- Gallová, Z., Suchá, R., Uher, P. Hes, O.: Leukemia inhibitory factor gene mutations in the population of infertile women are not restricted to nulligravid patients. European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology 127, 231-235 (2006). Křížan, J., Cuchalová, L., Šíma, P., Králičková, M., Madar, J. Větvička, V.: Altered distribution of NK and NKT cells in follicular fluid is associated with IVF outcome. Journal of reproductive immunology 82, 84-88 (2009). 16 | S t r á n k a Lukassen, H.G., Van Der, M.A., Van Lierop, M.J., Lindeman, E.J., Joosten, I. Braat, D.D.: The proportion of follicular fluid CD16+CD56DIM NK cells is increased in IVF patients with idiopathic infertility. J.Reprod.Immunol. 60, 71-84 (2003). Michou, V.I., Kanavaros, P., Athanassiou, V., Chronis, G.B., Stabamas, S. Tsilivakos, V.: Fraction of the peripheral blood concentration of CD56+/CD16-/CD3- cells in total natural killer cells as an indication of fertility and infertility. Fertility and sterility 80 Suppl 2, 691-697 (2003). Moffet-King, A.M.: Natural killer cells and pregnancy. Nat.Rev.Immunol. 2, 656-663 (2002) Novotný, Z., Křížan, J., Šíma, R., Šíma, P., Uher, P., Zech, N., Hütelová, R., Baborová, P., Ulčová-Gallová, Z., Šubrt, I., Ulmanová, E., Houdek, Z., Rokyta, Z., Babuska, V. Králíčková, M.: Leukaemia inhibitory factor (LIF) gene mutations in women diagnosed with unexplained infertility and endometriosis have a negative impact on the IVF outcome. A pilot study. Folia Biol (Praha) 3 (2009). Sirisathien, S., Hernandez-Fonseca, H.J., Bosch, P., Hollet, B.R., Lott, J.D. Brackett, B.G.: Effect of leukemia inhibitory factor on bovine embryos produced in vitro under chemically defined conditions. Theriogenology 59, 1751-1763 (2003). Van Den Heuvel, M.J., Peralta, C.G., Hatta, K., Han, V.K. Clark, D.A.: Decline in number of elevated blood CD3(+) CD56(+) NKT cells in response to intravenous immunoglobulin treatment correlates with successful pregnancy. Am J Reprod Immunol 58, 447-459 (2007). 17 | S t r á n k a SEZNAM PUBLIKACÍ DOKTORANDA V TOMTO USPOŘÁDÁNÍ: 1. publikace in extenso (podkladem dizertace) a) s IF Novotný, Z., Křížan, J., Šíma, R., Šíma, P., Uher, P., Zech N, Hütelová R, Baborová P, Ulčová-Gallová Z, Šubrt I, Ulmanová E, Houdek Z, Rokyta Z, Babuška V, Králíčková M.: Leukaemia inhibitory factor (LIF) gene mutations in women diagnosed with unexplained infertility and endometriosis have a negative impact on the IVF outcome. A pilot study. Folia Biol (Praha).55, 92-97 (2009) IF 0,978 Křížan, J., Váchalová, L., Šíma, P., Králíčková, M., Madar, J., Větvička, V.: Follicular fluid relative distribution of NK and NKT cells is associated with in vitro fertilization outcome. J Reprod Immunol. 82, 84-88 (2009) IF 2,519 b) bez IF Králíčkova, M., Šíma, R., Martínek, P., Vaněček, T., Ulčová- Gallová, Z., Šíma, P., Křížan, J., Kališ, V., Štěpán, Jr., Štěpán, J., Rokyta, Z., Uher, P. Hes, O.: The leukemia inhibitory factor gene mutations in the population of infertile women: the heterozygote transition G to A on the position 3400 does not affect the outcome of the infertility treatment. Česká gynekologie/Česká lékařská společnost J. Ev 72, 293-298 (2007). 18 | S t r á n k a 2. publikace in extenso (bez vztahu k dizertaci) a) s IF Králíčková, M., Ulčová-Gallová, Z., Š., Vaněček, T., Šíma, P., Křížan, J., Suchá, R., Uher, P., Hes, O., Novotný, Z., Rokyta, Z., Větvička, V.: Association of the leukemia inhibitory factor gene mutation and the antiphospholipid antibodies in the peripheral blood of infertile women. Folia Microbiol (Praha) 52, 543-548 (2007) IF 0,978 Větvička, V., Dvořák, B., Větvičková, J., Richter, J., Křížan, J., Šíma, P. Yvin, J.C.: Orally administered marine (1-->3)-beta-D- glucan Phycarine stimulates both humoral and cellular immunity. International journal of biological macromolecules 40, 291-298 (2007). IF 2,366 b) bez IF 19 | S t r á n k a
Abstract v angličtině:
Charles University in Prague Faculty of Natural Sciences Summary of Ph.D. thesis The role of LIF gene mutations and the relative distribution of NK cells, NKT and T lymphocytes in follicular fluid and blood of women with different history of infertility Jiří Křížan Prague 2010 Doctoral degree programs in biomedicine Charles University in Prague and the Academy of Sciences of the Czech Republic Programme: Biomedicine Chairman of the Subject Board: Doc. RNDr. Vladimír Holáň, Dr.Sc. Place of study: Institute of Microbiology, v.v.i., Academy of the Czech Sciences Vídeňská 1083, 142 20 Prague 4 phone: +420 296 442 318 Autor: Mgr. Jiří Křížan Supervisor: RNDr. Petr Šíma, CSc. The dissertation can be found at Dean's Office Faculty of Charles University in Prague 1|Page CONTENTS Contents 2 Summary 3 1. Introduction 5 2. Hypotheses and aims 6 3. Material and methods 7 Material: 7 Methods: 8 4. Results 10 5. Discussion 12 6. Conclusion 15 7. References 16 Bibliography of Autor: 18 1. papers in extenso (thesis background) 18 2. papers in extenso (without regard to thesis) 19 2|Page SUMMARY The aim of the dissertation thesis "The role of LIF gene mutations and the relative distribution of NK cells, NKT, and T lymphocytes in follicular fluid and blood of women with different history of infertility" was to determine whether a diagnosed cause of infertility is directly related to some of LIF gene mutations, which could be reflected in changes in relative distribution of immunocompetent cell subpopulations and in the expression of certain surface markers. Detection of LIF mutations was performed by temperature gradient gel electrophoresis. The relative distribution of subsets of NK cells, NKT and T lymphocytes in follicular fluid and peripheral blood were determined by flow cytometry. In the group of infertile women repeatedly undergoing IVF the changes in the relative distribution of immunocompetent cell markers CD3, CD16, and CD56 in the endometrium have been determined Fifteen infertile women with LIF mutations enrolled in this study represent the largest group that was monitored until now. We confirmed that LIF mutation at position 3400 is not the cause of their infertility. Results suggest that women with LIF mutation show the lowest success rate of IVF in diagnosis endometriosis and idiopathic infertility. This suggests that in these women the success of IVF is also affected by other factors, such as changes in the distribution of certain immunocompetent cell populations or changes of their functional expression induced after interaction with the products of alleles of the LIF or another, yet unknown mechanisms (higher age in these groups could be also taken into consideration). The results of this study suggest that determined changes in the distribution of NK cells, NKT and T lymphocytes in follicular 3|Page fluid could be more important for infertility diagnosis and prediction of IVF success than the peripheral blood testing. We also determined that in proliferative endometrium of all infertile women were lower numbers of immunocompetent cells bearing the markers CD3, CD16, and CD56. This finding could be used for diagnostic purposes, as well. 4|Page 1. INTRODUCTION Opinions on the immune system are constantly evolving. Among defense against pathogens and immune surveillance, the immune system plays an important regulatory (e.g. it regulates menstrual cycle and pregnancy in cooperation with nervous and endocrine system). Egg maturation and its fate after fertilization is determined by humoral and cellular composition of FF (including immune cells and surrounding supporting cells of cumulus), hormones and neurotransmitters, but also the products of gene mutations encoding LIF cytokine. Genetic determination and any imbalance between humoral and cellular components are reflected in fertility disorders. 5|Page 2. HYPOTHESES AND AIMS The aim of the dissertation thesis was to determine whether a diagnosed cause of infertility is directly related to some of the LIF gene mutations, which could be reflected in changes in relative distribution of the main immunocompetent cell subpopulations. For this purpose, an analysis of mutations in the LIF using temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), and relative distribution of subsets of NK cells, NKT and T lymphocytes by flow cytometry in FF and PB was performed. In the endometrium of infertile women undergoing repeatedly IVF the changes in the expression of immunocompetent cell markers CD3, CD16 and CD56 were determined. 6|Page 3. MATERIAL AND METHODS Material: 96-well microtiter plates with round bottom (Dynex Inc. USA.) Tube (Alpha Inc., UK), sterile 15 ml centrifuge tubes (Roth Inc. USA.) Polybond film (Whatman), tube for blood (K3EDTA) (Vacuette ®) DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany), Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE / Applied Biosystems, Foster City, CA) Chemicals for preparation of solutions: Acryl-Glide (Amresco), chemicals (Lachema s.r.o., ČR) HCl, KCL, Na2HPO4 . 12 H2O, NaCl, NaH2PO4 . 2 H2O, NaHCO3, NaOH, NaN3, gelatine, NH4Cl, KHCO3, Na2EDTA, MOPS, bromphenol blue, glycerole, acrylamide, TEMED, APS, ethanol, formaldehyde, AgNO3, HNO3, acetic acid Solutions: phosphate buffer (10xPBS), for flow cytometry, for flow cytometry lyzis buffer (10xACK), for TGGE (50x MOPS buffer), TGGE (10x loading buffer), for TGGE (40 % acrylamide (37,5 AA: 1 bisAA), for acrylamide gel TGGE (8 % AA, 6 M urea), polymerase chain reaction (PCR) Instruments: analytical scales (Precise Instrument AG, Switzerland), FACS LSR II (Becton Dikinson, SJ, USA) UV laminar box (Jouan Inc.., France), light microscope (Carl-Zeiss, Germany), Universal refrigerated centrifuge (Hermle AG , France), PCR cycler, TGGE (biometry, Goettingen, Germany) ABI Prism 310 Avant (PE / Applied Biosystems) 7|Page Methods: Controlled ovarian hyperstimulation was carried out by gonadotrophic hormone administration in combination with agonists or antagonists of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) (Lukassen et al. 2003). This procedure was modified in response to hyperstimulation of each woman. For isolation of DNA from cells for analysis of the LIF was used DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to standard protocol. Altogether, five sections of the LIF gene (two intronic-exon of the exons 1 and 2, and exon 3, which was divided into three sections, including intron junction). PCR products were analyzed by temperature gradient gel electrophoresis (TGGE). Positive samples from TGGE were sequenced on ABI Prism 310 (PE / Applied Biosystem, Foster City, USA). To determine the relative distribution of populations of NK cells, NKT and T lymphocytes was used FC BD ™ LSR II. Phenotypic analysis of FF and PB cells was performed in one step, six color staining (CD3 PE A750, EXBIO, Vestec, Prague, CZ; PB CD16 ™, BD Pharmingen, San Diego, California, USA, MO CD45, Caltag Laboratories, Burlingame, California , USA, and CD56 APC EXBIO, Vestec, Prague, CZ and dead cells were labeled with PI, Sigma Aldrich, St.. Louis, Missouri, USA) on the day of sampling from women undergoing IVF. The data were analyzed by a computer commercial software relevant and statistically evaluated by FlowJo software. In women with impaired fertility was hysteroscopy and endometrial biopsy performed with using mAB markers CD3, CD16 and CD56 to identify major immunocompetent cell populations. The control group consisted of fertile women, who underwent displastic conization due to changes in the cervix. 8|Page Endometrial samples for the determination of immunocompetent cells have been provided by Šikl’s pathological-anatomical institute of the University Hospital in Pilsen. 9|Page 4. RESULTS The presence of mutations in the LIF group of infertile women was significantly higher in comparison with fertile women (p <0.01). In women with LIF mutations with diagnosis II IVF success rate was 3% compared with other groups of infertility (IVF success rate of 17% endometriosis, EM; 17% of polycystic ovarial syndrome, PCOS; success rate of IVF in hyperprolactinemia and andrologic factor, AF 100%). These results show that in infertile women LIF gene mutations which are not exclusively connected to women with primary infertility and women with a diagnosis of II, are statistically significantly (p <0.05) more frequent than in healthy women, Comparing groups A and B (mutation LIF), and C and D (without mutation LIF) did not show a statistically significant difference. However, when comparing the success of pregnancy in groups A and B, we found a statistically significant difference (p = 0.01). Women diagnosed with fertility disorders (group C) had a statistically significant reduction of the immunoregulatory NK cells (p <0.05) and NKT lymphocytes (p <0.05) in FF when compared with the control group (AF). The relative distribution of CD122 and CD161 markers was not changed comparing groups C and D, as well as A and B. Relative distribution of cell populations bearing these markers were comparable in the FF and PB. The greatest success IVF was achieved in women with AF, where 19% of women became pregnant, the other groups were less successful (tubal factor, TF 9%; ovarial factor, OF 6%; EM 6% and idiopathic infertility, IN 0%). 10 | P a g e Women who did not become pregnant after IVF (group A) showed a statistically significant increase in relative distribution of immunoregulatory NK cells and NKT lymphocytes and statistically insignificant increase in the relative distribution of T lymphocytes in FF compared with women who became pregnant after IVF (group B). Relative distribution of other cell populations was not changed. Women in group A showed a statistically significant increase in T lymphocytes in PB compared to group B. The relative distribution of other cell populations was not influenced. In women with a diagnosis of infertility the percentage of CD3+, CD16+ and CD56+ cells was generally higher than in control women. Insignificant increase of CD3+ cells (infertile 6.6%, control 10.1%) was observed. The differences in expression of CD16+ and CD56+ cell markers between control and infertile women were not found. Women with proliferative endometrium had the percentage of CD3+, CD16+, and CD56+ cells insignificantly higher than women with nonproliferative endometrium. 11 | P a g e 5. DISCUSSION Most ETs were unsuccessful in women with the II diagnosis. All women diagnosed with infertility (PCOS, AF, hyperprolactinaemia), except one, became pregnant after the first ET. It appears that in women with EM and especially women with II mutations, there are also other factors in addition to LIF mutation that prevent successful implantation. These results confirm the obtained data of success rate per cycle of IVF (a very low success rate of IVF in diagnosis II 3% and low IVF success rate of diagnosis of EM 17%). The success rate of IVF per cycle in women diagnosed with PCOS (17%) is comparable to women diagnosis with EM. In women diagnosed with hyperprolactinaemia and AF, the success rate of IVF was 100%. Results show minimal impact of LIF mutation on success of IVF in women with the diagnosis of hyperprolactinemia and AF. The failure of IVF in women with II and EM diagnoses in comparison to the other groups may be also attributed to their higher age (the maximum age variance of 8 years). These results demonstrate that LIF mutations have an impact on the course of nidation, early embryogenesis and the success of IVF. Therefore, supplementation of media with wild type LIF and other growth factors is considered as a promising direction for IVF (Cheung et al. 2003; Sirisathien et al. 2003). There is an evidence that the mutated LIF influences development and blastocyst morphology (Cheung et al. 2003; Sirisathien et al. 2003). Therefore, the substitution of LIF was used in infertile women during IVF (Borin et al. 1997; Giesse et al. 1999). However, our results show that mutation in the LIF is not critical to the success of IVF. We found them also among women who were diagnosed with early abortion (Králíčková et 12 | P a g e al. 2006). It can be assumed, that the mutated LIF affect the course of embryo-maternal communication during nidation and in the later stages of embryogenesis. A possible justification for the success IVF is the regulation of nidation by other factors, especially cytokines that are produced by lymphocytes in the endometrium of women with LIF mutations. During the menstrual cycle, the endometrial lymphocytes undergo morphological and biochemical changes that promote successful nidation and the maintenance of pregnancy (Moffet-King 2002). Our results show that the success of IVF in women with mutations in the LIF depends on the type of infertility diagnosis. The lowest success rate of IVF is achieved in women with diagnosis II and EM (Buchanan et al. 2009). It can be explained by the differences in relative distribution of NK cells and their functional changes after interaction with the products of alleles of the LIF or yet unknown mechanisms. Significant decrease was detected in relative distribution of immunoregulatory NK cells in women with failed IVF in FF. This finding is consistent with the results of studies that have attributed an important role in endometrial decidualization to this subpopulation of NK cells (King 2000). The diagnostic determination could be important for prediction the success of IVF (Coulam and Roussev 2003). The relative distribution of NKT lymphocytes increased in women with unsuccessful IVF in FF (Křížan et al. 2009). Contrary to published data, the increased relative amount of NKT lymphocytes in PB is an indication of recurrent miscarriage or implantation failure (Van den Heuvel et al. 2007). It has not been published papers concerned with NKT lymphocytes in FF. Therefore, it is not possible to compare our results with other findings. The numbers of T lymphocytes were reduced in women with failed IVF in PB (significantly) and 13 | P a g e in FF (insignificantly). T lymphocytes may be considered as another factor indicating the success of IVF. Statistically significant reduction was found in the relative distribution of immunoregulatory NK cells and NKT lymphocytes in women with diagnoses of all types of infertility compared with women without any infertility diagnosis in FF. In the literature, the changes in the relative distribution of NK cells, NKT and T lymphocytes in FF are not associated with any disorder of infertility. Only reduction of the relative numbers of immunoregulatory NK cells in PB is connected with recurrent miscarriages (Michou et al. 2003). The increased relative amount of cytotoxic NK cells is associated with II and the failure of nidation (King 2000, Koopman et al. 2003; Lukassen et al. 2003). Therefore, it can be again concluded that the establishment of immunoregulatory NK and cytotoxic NK cells can predict the success of IVF. 14 | P a g e 6. CONCLUSION Until now, six different mutations of LIF were described, one of which (in non-coding region) in women without reproductive disorders. LIF mutation alone does not cause infertility; it is only one factor reducing the reproductive competence at the time of nidation as well as during pregnancy. We also found that LIF mutations are not solely tied to nulligravid women (primarily infertile) as was previously assumed, but may also occur with other infertility diagnoses. It turned out that most mutations are present in women with diagnoses of EM and II, which was associated with the lowest success rate of IVF. Since the LIF mutations in a population of infertile women are not so common, their determination is for prediction of IVF success less important, however; it can be very useful for studying the causes of infertility. LIF mutations may induce immunological changes, which could affect the balance of processes that regulate pregnancy in an unknown way. Higher relative distribution of immunoregulative NK cells in FF was found in women with AF and women who succeeded in IVF, which is in agreement with the findings of other authors (Michou et al. 2003). The lower relative distribution of NKT lymphocytes in FF and T lymphocytes in PB was found in women with successful IVF. In conclusion, the results of this dissertation thesis show that the reproductive disorders in IVF are associated with changes in cellularity in FF, PB, and endometrium, and their diagnosis can be recommended for prediction of IVF success. 15 | P a g e 7. REFERENCES Borini, A., Bulletti, C., Cattoli, M., Serrao, L., Polli, V., Alfieri, S. Flamigni, C.: Use of recombinant leukemia inhibitory factor in embryo implantation. Annals of the New York Academy of Sciences 828, 157- 161 (1997). Coulam, C.B. Roussev, R.G.: Correlation of NK cell activation and inhibition markers with NK cytoxicity among women experiencing immunologic implantation failure after in vitro fertilization and embryo transfer. Journal of assisted reproduction and genetics 20, 58-62 (2003). Cheung, L.P., Leung, H.Y. Bongso, A.: Effect of supplementation of leukemia inhibitory factor and epidermal growth factor on murine embryonic development in vitro, implantation, and outcome of offspring. Fertility and sterility 80 Suppl 2, 727-735 (2003). Giudice, L.C.: Genes associated with embryonic attachment and implantation and the role of progesterone. J Reprod Med 44, 165-171 (1999). King, A.: Uterine leukocytes and decidualization. Hum.Reprod.Update. 6, 28-36 (2000). Koopman, L.A., Kopcow, H.D., Rybalov, B., Boyson, J.E., Orange, J.S., Schatz, F., Masch, R., Lockwood, C.J., Schachter, A.D., Park, P.J. Strominger, J.L.: Human decidual natural killer cells are a unique NK cell subset with immunomodulatory potential. The Journal of experimental medicine 198, 1201-1212 (2003). Králíčková, M., Šíma, R., Vaněček, T., Šíma, P., Rokyta, Z., Ulčová- Gallová, Z., Suchá, R., Uher, P. Hes, O.: Leukemia inhibitory factor gene mutations in the population of infertile women are not restricted to nulligravid patients. European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology 127, 231-235 (2006). Křížan, J., Cuchalová, L., Šíma, P., Králičková, M., Madar, J. Větvička, V.: Altered distribution of NK and NKT cells in follicular fluid is associated with IVF outcome. Journal of reproductive immunology 82, 84-88 (2009). 16 | P a g e Lukassen, H.G., Van Der, M.A., Van Lierop, M.J., Lindeman, E.J., Joosten, I. Braat, D.D.: The proportion of follicular fluid CD16+CD56DIM NK cells is increased in IVF patients with idiopathic infertility. J.Reprod.Immunol. 60, 71-84 (2003). Michou, V.I., Kanavaros, P., Athanassiou, V., Chronis, G.B., Stabamas, S. Tsilivakos, V.: Fraction of the peripheral blood concentration of CD56+/CD16-/CD3- cells in total natural killer cells as an indication of fertility and infertility. Fertility and sterility 80 Suppl 2, 691-697 (2003). Moffet-King, A.M.: Natural killer cells and pregnancy. Nat.Rev.Immunol. 2, 656-663 (2002) Novotný, Z., Křížan, J., Šíma, R., Šíma, P., Uher, P., Zech, N., Hütelová, R., Baborová, P., Ulčová-Gallová, Z., Šubrt, I., Ulmanová, E., Houdek, Z., Rokyta, Z., Babuska, V. Králíčková, M.: Leukaemia inhibitory factor (LIF) gene mutations in women diagnosed with unexplained infertility and endometriosis have a negative impact on the IVF outcome. A pilot study. Folia Biol (Praha) 3 (2009). Sirisathien, S., Hernandez-Fonseca, H.J., Bosch, P., Hollet, B.R., Lott, J.D. Brackett, B.G.: Effect of leukemia inhibitory factor on bovine embryos produced in vitro under chemically defined conditions. Theriogenology 59, 1751-1763 (2003). Van Den Heuvel, M.J., Peralta, C.G., Hatta, K., Han, V.K. Clark, D.A.: Decline in number of elevated blood CD3(+) CD56(+) NKT cells in response to intravenous immunoglobulin treatment correlates with successful pregnancy. Am J Reprod Immunol 58, 447-459 (2007). 17 | P a g e BIBLIOGRAPHY OF AUTOR: 1. papers in extenso (thesis background) a) with IF Novotný, Z., Křížan, J., Šíma, R., Šíma, P., Uher, P., Zech N, Hütelová R, Baborová P, Ulčová-Gallová Z, Šubrt I, Ulmanová E, Houdek Z, Rokyta Z, Babuška V, Králíčková M.: Leukaemia inhibitory factor (LIF) gene mutations in women diagnosed with unexplained infertility and endometriosis have a negative impact on the IVF outcome. A pilot study. Folia Biol (Praha).55, 92-97 (2009) IF 0,978 Křížan, J., Váchalová, L., Šíma, P., Králíčková, M., Madar, J., Větvička, V.: Follicular fluid relative distribution of NK and NKT cells is associated with in vitro fertilization outcome. J Reprod Immunol. 82, 84-88 (2009) IF 2,519 b) without IF Králíčkova, M., Šíma, R., Martínek, P., Vaněček, T., Ulčová- Gallová, Z., Šíma, P., Křížan, J., Kališ, V., Štěpán, Jr., Štěpán, J., Rokyta, Z., Uher, P. Hes, O.: The leukemia inhibitory factor gene mutations in the population of infertile women: the heterozygote transition G to A on the position 3400 does not affect the outcome of the infertility treatment. Česká gynekologie/Česká lékařská společnost J. Ev 72, 293-298 (2007). 18 | P a g e 2. papers in extenso (without regard to thesis) a) with IF Králíčková, M., Ulčová-Gallová, Z., Š., Vaněček, T., Šíma, P., Křížan, J., Suchá, R., Uher, P., Hes, O., Novotný, Z., Rokyta, Z., Větvička, V.: Association of the leukemia inhibitory factor gene mutation and the antiphospholipid antibodies in the peripheral blood of infertile women. Folia Microbiol (Praha) 52, 543-548 (2007) IF 0,978 Větvička, V., Dvořák, B., Větvičková, J., Richter, J., Křížan, J., Šíma, P. Yvin, J.C.: Orally administered marine (1-->3)-beta-D- glucan Phycarine stimulates both humoral and cellular immunity. International journal of biological macromolecules 40, 291-298 (2007). IF 2,366 b) without IF 19 | P a g e
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Jiří Křížan, Ph.D. 2.73 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Jiří Křížan, Ph.D. 732 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Jiří Křížan, Ph.D. 805 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Věra Jonáková, DrSc. 95 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Zuzana Kročová, Ph.D. 116 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 747 kB
Stáhnout Errata Mgr. Jiří Křížan, Ph.D. 1.48 MB