velikost textu

Metabolismus karcinogenního o-nitroanisolu a jeho metabolitu o-nitrofenolu a environmentalních polutantů 2-nitrobenzanthronu a 3-nitrobenzanthronu

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Metabolismus karcinogenního o-nitroanisolu a jeho metabolitu o-nitrofenolu a environmentalních polutantů 2-nitrobenzanthronu a 3-nitrobenzanthronu
Název v angličtině:
Metabolism of carcinogenic o-nitroanisol and its metabolite o-nitrophenol and two environmental pollutants 2-nitrobenzanthrone and 3-nitrobenzanthrone
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Martina Svobodová, Ph.D.
Školitel:
prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Gustav Entlicher, CSc.
RNDr. Pavel Souček, CSc.
Id práce:
84612
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
13. 9. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA KATEDRA BIOCHEMIE Metabolismus karcinogenního o-nitroanisolu, jeho metabolitu o-nitrofenolu a environmentálních polutantů 2-nitrobenzanthronu a 3-nitrobenzanthronu Autoreferát disertační práce RNDr. Martina Svobodová Školitelka: Prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc. Praha 2010 RNDr. Martina Svobodová Úvod ÚVOD 2-Nitroanisol 2-Nitroanisol (2-methoxynitrobenzen, 2-NA, NO2 obrázek 1) je významný průmyslový polutant a silný OCH3 karcinogen vyvolávající u myší a potkanů tvorbu nádorů močového měchýře, v menší míře také nádory sleziny, jater [19, 30, 31]. a ledvin Tato sloučenina má také toxické účinky a způsobuje anémii. 2-NA je primárně používán jako Obrázek 1 prekursor při výrobě o-anisidinu (2-methoxyanilinu), Vzorec 2-nitroanisolu intermediátu, který je dále využíván v barvářském průmyslu při výrobě azobarviv. Rovněž je využíván ve farmaceutickém průmyslu jako meziprodukt při syntéze některých léčiv [30, 31]. Navzdory tomu, že 2-nitroanisol je silným karcinogenem pro hlodavce, vykazuje jen slabou mutagenní aktivitu v Amesově testu pro kmen Salmonella typhimurium. Tato karcinogenní látka vykazuje též nízkou aktivitu v cytogenetických testech. Indukuje nepatrný nárůst chromosomálních aberací a sesterských chromatidových výměn, ale pouze při vysokých koncentracích [31]. 2-Nitroanisol může být metabolisován dvěma cestami. Hlavní cestou metabolismu této sloučeniny in vivo je oxidační demethylace na 2-nitrofenol, který je vylučován z těla močí ve formě buď sulfátového konjugátu vytvořeného reakcí s fosfoadenosinfosfosulfátem katalyzovanou enzymem sulfotransferasou, nebo konjugátu [22]. s kyselinou glukuronovou vzniklého reakcí s UDP-glukuronovou kyselinou Druhou, minoritní cestou metabolismu 2-nitroanisolu, je jeho redukce na o-anisidin, která probíhá [22]. v játrech Nitroredukce 2-nitroanisolu, která je obecně považována za aktivační cestu metabolismu aromatických nitrosloučenin, byla prokázána ve studii in vivo [22]. Ve studiích in vitro bylo prokázáno, že N-(2-methoxyfenyl)hydroxylamin, který je tvořen jako redukční metabolit 2-nitroanisolu po inkubaci s jaterním cytosolem nebo xanthinoxidasou, [21, 34, 37]. tvoří kovalentní adukty s DNA Dále bylo ukázáno, že 2-nitroanisol tvoří adukty s DNA in vivo v organismu laboratorních potkanů, kteří byli premedikováni touto [37]. sloučeninou Tyto výsledky potvrzující kovalentní vazbu 2-nitroanisolu na DNA po -1- RNDr. Martina Svobodová Úvod aktivaci lidskými cytosolárními reduktasami in vitro a v organismu potkana in vivo naznačují, že 2-nitroanisol působí genotoxickým mechanismem. 3-Nitrobenzanthron 3-Nitrobenzanthron (3-NBA, 3-nitro-7H- NO2 1 3 benz[de]anthracen-7-on, obrázek 2) patřící mezi 11 10 polycyklické aromatické nitrosloučeniny je silným 4 [16] 9 mutagenem, karcinogenem pro laboratorního potkana 7 5 8 6 [20]. a podezřelým karcinogenem pro člověka Jeho O [9, genotoxicita byla prokázána v řadě testů na mutagenitu Obrázek 2 16] [2]. a potenciálem tvořit specifické adukty s DNA Výskyt Vzorec 3-nitrobenzanthronu těchto aduktů byl pozorován in vitro v buněčných kulturách a in vivo v organismu laboratorního potkana a myši [2, 3, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 27, 36]. 3-NBA se nachází ve složkách životního prostředí, byl detekován v půdě a také [24, 25, 40]. jako součást srážkových vod Jeho výskyt ve výfukových plynech byl prokázán [16]. teprve v roce 1997 3-NBA byl detekován ve výfukových plynech v rozsahu [16, 23], [16, 17] 0,1 - 24 pmol/mg v atmosféře od 1,4 do 249 fmol/m3 a v půdě v rozsahu [25, 40]. 4,3 - 4211 fmol/g 3-NBA pravděpodobně vzniká majoritně nedokonalým spalováním nafty. V menší míře může 3-NBA vznikat také reakcí parentálního [16, polycyklického uhlovodíku s oxidy dusíku z atmosféry, zejména v přítomnosti ozonu 17]. Jeho genotoxické účinky mohou představovat vysoké riziko především pro [18, 28, profesionální řidiče, pracovníky garáží či benzínových stanic, mechaniky a horníky 29, 33]. [5, 7, 8, 35]. Biotransformace 3-NBA probíhá zejména redukční cestou V první (derivatizační) fázi biotransformace je nitro-skupina (-NO2) 3-NBA nejprve redukována přes nitrosoderivát na N-hydroxylamin (-NHOH). Na katalýze této reakce participuje [7], zejména cytosolární enzym NAD(P)H:chinon oxidoreduktasa v menší míře také [1, 13] [8]. xanthinoxidasa a mikrosomální NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasa (POR) Vzniklý N-hydroxylamin je velmi nestabilní a rozpadá se na nitréniový ion, který buď sám nebo po přeměně na karbéniový ion reaguje s nukleofilními centry DNA za tvorby [2, 3]. specifických aduktů Ve druhé fázi biotransformace dochází ke konjugaci -2- RNDr. Martina Svobodová Úvod N-hydroxylaminu s aktivním sulfátem či acetátem, která usnadňuje tvorbu nitréniového iontu. Tyto reakce jsou v lidském organismu katalyzovány N,O-acetyltransferasami (NAT1 a NAT2) a sulfotransferasami (SULT1A1 a SULT1A2) [5, 7]. 2-Nitrobenzanthron 2-Nitrobenzanthron (2-NBA, 2-nitro-7H- NO2 2 benz[de]anthracen-7-on, obrázek 3) je další polycyklická 1 3 aromatická nitrosloučenina vyskytující se jako polutant 11 10 4 znečištěného ovzduší. Tento izomer 3-NBA byl 9 5 detekován ve znečištěném ovzduší v koncentracích až 7 8 6 70x vyšších než v případě 3-NBA. 2-NBA vzniká O převážně procesy probíhajícími v atmosféře, zatímco Obrázek 3 Vzorec 2-nitrobenzanthronu 3-NBA, vyskytující se zejména ve výfukových plynech, je tvořen spalovacími procesy [32, 39]. Genotoxicita obou izomerů byla testována v řadě studiích in vitro a in vivo v organismu laboratorního potkana. Z těchto experimentů vyplývá, že i 2-NBA může [4, 26]. vytvářet adukty s DNA V porovnání s 3-NBA je však u 2-NBA schopnost tvorby aduktů s DNA jen velmi nízká. Proto je 2-NBA považován za sloučeninu slabě toxickou [4, 38]. Navzdory této skutečnosti, vysoká koncentrace 2-NBA v ovzduší by mohla znamenat vysoké zdravotní riziko pro lidskou populaci. -3- RNDr. Martina Svobodová Cíl disertační práce CÍL DISERTAČNÍ PRÁCE Cílem předkládané disertační práce bylo rozšíření současných znalostí v oblasti studia metabolismu karcinogenních aromatických nitrosloučenin, konkrétně průmyslového polutantu 2-nitroanisolu a dvou environmentálních polutantů 2-nitrobenzanthronu a 3-nitrobenzanthronu. V rámci disertační práce byly řešeny následující problematiky: • Příprava a charakterizace 2,5-dihydroxynitrobenzenu jako metabolitu 2-nitroanisolu • Metabolismus 2-nitroanisolu cytochromy P450 jaterních mikrosomů potkana • Metabolismus 2-nitroanisolu potkaními a lidskými cytochromy P450 • Metabolismus 2-nitrofenolu potkaními a lidskými cytochromy P450 • Studium kinetiky oxidace 2-nitrofenolu cytochromem P450 2E1 • Studium metabolismu a aktivace environmentálních polutantů 2-nitrobenzanthronu a 3-nitrobenzanthronu -4- RNDr. Martina Svobodová Výsledky a diskuse VÝSLEDKY A DISKUSE Předkládaná disertační práce přispívá k rozšíření znalostí v oblasti metabolismu karcinogenních aromatických nitrosloučenin, konkrétně průmyslového polutantu 2-nitroanisolu a dvou environmentálních polutantů, 2-nitrobenzanthronu a 3-nitrobenzanthronu, ohrožujících lidskou populaci. Nejdůležitější poznatky zjištěné v disertační práci lze shrnout následovně: Charakterizován byl dosud neznámý metabolit 2-nitroanisolu, který je tvořen vedle 2-nitrofenolu a 2,6-dihydroxynitrobenzenu. Tímto metabolitem je 2,5-dihydroxynitrobenzen Na základě srovnání chromatografických vlastností neznámého metabolitu 2-NA se syntetizovaným standardem a s použitím „ko-chromatografické“ analýzy s inkubační směsí byl tento metabolit identifikován jako 2,5-dihydroxynitrobenzen (obrázek 4). 40.0 2 - 7.468 3 - 8.571 WVL:254 nm 2-NA Absorbance 25.0 4 - 10.617 1 - 6.534 2-NP 12.5 0.0 2,6-DNB 2,5-DNB -10.0 0.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 12.5 13.8 15.0 16.3 17.5 18.8 19.9 Čas [min] Obrázek 4 Separace metabolitů 2-nitroanisolu tvořených mikrosomy jater králíka premedikovaného fenobarbitalem s přidaným 2,5-DNB pomocí HPLC. Byly identifikovány cytochromy P450 zodpovědné za tvorbu jednotlivých metabolitů 2-nitroanisolu Pro studium živočišných cytochromů P450 participujících na oxidaci 2-NA a tvorbě jeho metabolitů byly použity systémy mikrosomální frakce potkanů premedikovaných známými induktory jednotlivých cytochromů P450 a rekombinantní potkaní a lidské cytochromy P450 exprimované v SupersomechTM. Výsledky získané s potkaními enzymy byly -5- RNDr. Martina Svobodová Výsledky a diskuse srovnány s výsledky nalezenými pro oxidaci 2-nitroanisolu lidskými cytochromy P450. Zjistili jsme, že v obou biologických druzích jsou tvořeny stejné metabolity (obrázek 5) a že na oxidaci 2-nitroanisolu se v obou případech podílí především CYP2E1, 1A1 a dále v menší míře cytochromy P450 podrodin 2B, 2C a 2D (obrázek 5). 8 A 2-NP 8 B 2-NP Množství metabolitů tvořených z 2-NA 2,5-DNB Množství metabolitů tvořených z 2-NA 7 7 2,5-DNB 2,6-DNB 2,6-DNB 6 6 (pmol/min/pmol CYP) (pmol/min/pmol CYP) 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 1A1 2A2 2B2 2C6 2C11 2C12 2C13 2D1 2D2 2E1 3A1 3A2 1A1 1A2 1B1 2A6 2B6 2C8 2C9 2C19 2D6 2E1 3A4 Obrázek 5 Metabolismus 2-nitroanisolu rekombinantními potkaními (A) a lidskými (B) cytochromy P450. Hodnoty jsou průměrem tří nezávislých měření a znázorněné chyby představují směrodatné odchylky ze tří stanovení. 2,5-Dihydroxynitrobenzen je jediným metabolitem oxidace 2-nitrofenolu Zjistili jsme, že 2-nitrofenol je oxidován pouze na jeden metabolit, 2,5-dihydroxynitrobenzen. Dále byla srovnávána efektivita cytochromů P450 jednotlivých živočišných druhů (člověka, potkana, králíka a myši) oxidovat 2-NP (obrázek 6). Z testovaných živočišných systémů byly v oxidaci 2-nitrofenolu nejúčinnější enzymy lidské, následované enzymy potkaními. 0.6 Množství tvořeného 2,5-DNB [pmol/min/pmol CYP] 0.5 0.10 0.05 0.00 Lidské Lidské Potkaní Králičí Myší mužské ženské Mikrosomy Obrázek 6 Množství tvořeného 2,5-DNB z 2-NP (1 mM) lidskými, potkaními, králičími a myšími jaterními mikrosomy. Hodnoty jsou průměrem tří nezávislých měření a znázorněné chyby -6- RNDr. Martina Svobodová Výsledky a diskuse představují směrodatné odchylky ze tří stanovení. Identifikace jednotlivých cytochromů P450 participujících na oxidaci 2-nitrofenolu Pro studium jednotlivých cytochromů P450 zodpovědných za oxidaci 2-NP byly použity izolované mikrosomální frakce potkanů premedikovaných známými induktory jednotlivých cytochromů P450. Pro další přiblížení byly využity rekombinantní potkaní a lidské cytochromy P450 v heterologních expresních systémech (SupersomyTM) a v neposlední řadě byl zkoumán také vliv specifických inhibitorů jednotlivých cytochromů P450. Výsledky získané ve studii s potkaními cytochromy P450 byly opět srovnávány s výsledky získanými s enzymy lidskými. Také v těchto studiích bylo zjištěno, že v obou biologických druzích vzniká tentýž metabolit. Na oxidaci 2-NP se v obou případech podílejí nejvíce cytochrom P450 2E1 a cytochromy P450 podrodiny 3A, 2A, 2C a 2D (obrázek 7 a obrázek 8, str. 8). 10 A 10 B Množství tvořeného 2,5-DNB Množství tvořeného 2,5-DNB 8 8 [pmol/min/pmol CYP] (pmol/min/pmol CYP) 6 6 4 4 2 2 0 0 1A1 1A2 2A1 2A2 2B1 2C6 2C112C12 2C13 2D1 2D2 2E1 3A1 3A2 1A1 1A2 1B1 2A6 2B6 2C8 2C9 2C19 2D6 2E1 3A4 Potkaní cytochromy P450 Lidské cytochromy P450 Obrázek 7 Metabolismus 2-nitrofenolu rekombinantními potkaními (A) a lidskými (B) cytochromy P450. Hodnoty jsou průměrem tří nezávislých měření a znázorněné chyby představují směrodatné odchylky ze tří stanovení. -7- RNDr. Martina Svobodová Výsledky a diskuse CYP2E1 CYP3A4 CYP2A6 CYP2C CYP2D6 CYP2B6 Obrázek 8 Příspěvky jednotlivých lidských cytochromů P450 na oxidaci 2-NP v lidských jaterních mikrosomech 2-Nitrofenol je detoxifikačním metabolitem karcinogenního 2-nitroanisolu Mikrosomální subcelulární frakce jater člověka, potkana, králíka a myši nekatalyzuje nitroredukci 2-nitrofenolu na N-(2-hydroxyphenyl)hydroxylamin nebo o-aminofenol jak za aerobních, tak i anaerobních podmínek. Nebyly detekovány žádné adukty tvořené přeměnou 2-NP lidskými jaterními mikrosomy a cytosoly s DNA (obrázek 9). A B C D E F 2 1 3 Obrázek 9 Autoradiografie aduktů 2-NP tvořených in vitro s DNA po aktivaci 2-NP lidskými jaterními mikrosomy za anaerobních podmínek (A, B), lidským jaterním cytosolem za anaerobních podmínek (C, D), in vivo v DNA močového měchýře potkanů premedikovaných 2-NA (E), v dGp po reakci s N-(2-methoxyphenyl)hydroxylaminem (F). Vzorky E a F byly použity jako pozitivní kontroly. Metoda značení 32P s použitím nukleasy P1 byla použita při analýzách (A, C a E), standardní metoda značení 32P za snížené koncentrace ATP u analýz (B, D a F). Kinetika oxidace 2-nitrofenolu potkaním a lidským cytochromem P450 je obdobná Oxidace 2-nitrofenolu vykazovala v obou biologických druzích kinetiku Michaelise a Mentenové. Byly nalezeny také podobné hodnoty Michaelisovy konstanty Km a maximální rychlosti reakce Vmax (tabulka 1, str. 9). -8- RNDr. Martina Svobodová Výsledky a diskuse Tabulka 1 Hodnoty Vmax a Km oxidace 2-NP potkaním a lidským CYP2E1 Vmax Km [pmol/min/pmol CYP] [mM] potkaní CYP2E1 16,2 0,35 lidský CYP2E1 29,5 0,21 3-Nitrobenzanthron je studovanými enzymovými systémy aktivován za tvorby aduktů s DNA Pomocí metody „32P-postlabeling“ byla detekována tvorba aduktů 3-NBA aktivovaného lidskými jaterními cytosoly, lidskými jaterními mikrosomy, lidskou NQO1, xanthinoxidasou a lidskou NADPH:CYP reduktasou s DNA (obrázek 10). 2-NBA nebyl na rozdíl od 3-NBA stejnými enzymovými systémy a za stejných experimentálních podmínek aktivován, nebyly nalezeny žádné jeho adukty s DNA (obrázek 10). lidská NQO1 lidské jaterní lidské jaterní lidské primární cytosoly mikrosomy hepatocyty A B C D 2-NBA E 1 F 1 G 1 H 5 5 5 5 1 4 4 2 4 4 3-NBA 2 2 3 2 3 3 7 3 Obrázek 10 Autoradiografický profil aduktů s DNA tvořených 100 µM 2-NBA (A-C) a 100 µM 3-NBA(E–G) po aktivaci rekombinatní lidskou NQO1 (A a E), lidskými jaterními cytosoly (B a F), lidskými jaterními mikrosomy (C a G) a v primární kultuře lidských hepatocytů za přítomnosti 1 µM 2-NBA (D) nebo 3-NBA (H). Autoradiografy byly získány metodou 32P-postlabeling. Skvrna aduktu 1 = dA-N6-3-ABA, skvrna aduktu 3 = dG-N2-3-ABA, skvrna aduktů 4/5 = dG-C8-N-3-ABA. -9- RNDr. Martina Svobodová Výsledky a diskuse 3-Nitrobenzanthron je lidskou NQO1 redukován na 3-aminobenzanthron 3-NBA je lidskou NQO1 přeměňován za tvorby jednoho metabolitu, 3-ABA. Redukce 3-NBA lidskou NQO1 je závislá na koncentraci tohoto enzymu, na době inkubace a také na koncentraci 3-NBA jako substrátu lidské NQO1. Redukce probíhá klasickou hyperbolickou kinetikou odpovídající kinetice Michaelise a Mentenové (obrázek 11). 2-NBA není ve srovnání s 3-NBA lidskou NQO1 redukován, není tedy pravděpodobně substrátem NQO1. 10 A 2.0 B 9 1.8 Množství přeměněného 3-NBA Množství vytvořeného 3-ABA 8 1.6 7 1.4 6 1.2 [nmol] [nmol] 5 1.0 4 0.8 3 0.6 2 0.4 1 0.2 0 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Koncentrace 3-NBA [μ Μ] Koncentrace 3-NBA [μ Μ] Obrázek 11 Závislost množství přeměněného 3-NBA (A) a vytvořeného 3-ABA (B) rekombinantní lidskou NQO1 na koncentraci 3-NBA. Hodnoty jsou průměrem tří nezávislých měření a znázorněné chyby představují směrodatné odchylky ze tří stanovení. Rozdílná orientace 2-nitrobenzanthronu a 3-nitrobenzanthronu v aktivním centru NQO1 diktuje efektivitu jejich redukce Oba izomery nitrobenzanthronu se vážou do aktivního místa NQO1 s podobnou vazebnou afinitou. Orientace obou izomerů NBA v aktivním místě NQO1 je však rozdílná (obrázek 12, str. 11), což má za následek větší vzdálenost nitro-skupiny 2-NBA k vodíku vázanému na N5 isoalloxazinového kruhu FAD než je tomu u 3-NBA. Takové prostorové uspořádání je méně příhodné pro přenos vodíku na nitro-skupinu, a tedy i pro redukci 2-NBA. -10- RNDr. Martina Svobodová Výsledky a diskuse Obrázek 12 Vazebné orientace molekuly 2-NBA a 3-NBA v aktivním centru NQO1 vycházející z výpočtů molekulárního modelování. Orientace umožňují přenos vodíku z N5 isoalloxazinového kruhu FAD na nitro-skupinu 3-NBA (Ba a Bb) a 2-NBA (Aa a Ab). Dvě možné formy redukovaného isoaloxazinového kruhu (ionizovaný enolát a protonovaný enol) vázané do aktivního místa NQO1 jsou označeny indexem a a b. Oba NBA ligandy jsou orientovány paralelně k flavinové prostetické skupině. 2-NBA nebo 3-NBA jsou na obrázku znázorněny tučnými čarami, FAD kofaktor středně tučnými čarami a aminokyselinové zbytky vzdálené do 5,5 Å od ligandu tenkými linkami. 2-Nitrobenzanthron inhibuje tvorbu aduktů 3-nitrobenzanthronu s DNA 2-NBA způsobil pokles metabolické aktivace 3-NBA vedoucí k tvorbě aduktů 3-NBA aktivovaného lidskou NQO1 s DNA (obrázek 13). Získané výsledky naznačují, že oba izomery se vážou do aktivního místa lidské NQO1 s podobnou afinitou a soutěží o totéž vazné místo v enzymu. 600 Množství 3-NBA-DNA aduktu 500 [RAL x 10-8] 400 300 200 100 0 50 100 150 200 250 300 Koncentrace 2-NBA [μM] Obrázek 13 Vliv 2-NBA (10, 30, 300 µM) na tvorbu aduktů 3-NBA (30 µM) aktivovaného lidskou NQO1 s DNA. Hodnoty jsou průměrem tří nezávislých měření a znázorněné chyby představují směrodatné odchylky ze tří stanovení. -11- RNDr. Martina Svobodová Výsledky a diskuse Předkládaná disertační práce přináší originální vědecké výsledky. Část těchto výsledků byla již také publikována formou časopiseckých publikací v renomovaných vědeckých periodikách. Takto bylo publikováno 7 prací, které jsou součástí disertační práce jako přílohy 1-7. Práce byla podporována grantovou agenturou České republiky (grant 303/09/0472) a grantovou agenturou Ministerstva školství a tělovýchovy České republiky(granty MSM 0021620808 a 1M0505). -12-
Abstract v angličtině:
CHARLES UNIVERSITY IN PRAGUE FACULTY OF SCIENCE DEPARTMENT OF BIOCHEMISTRY Metabolism of carcinogenic o-nitroanisole, its metabolite o-nitrophenol and environmental pollutants 2-nitrobenzanthrone and 3-nitrobenzanthrone Summary of PhD Thesis RNDr. Martina Svobodová Supervisor: Prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc. Prague 2010 RNDr. Martina Svobodová Introduction INTRODUCTION 2-Nitroanisole 2-Nitroanisole (2-methoxynitrobenzene, 2-NA, NO2 figure 1) is an important industrial pollutant and a strong OCH3 carcinogen for rodents causing neoplastic transformation in the urinary bladder and, to a lesser extent, in the spleen, [19, 30, 31]. liver and kidney 2-NA is also a toxic compound, causing anemia. 2-NA is used primarily as a precursor in Figure 1 the synthesis of o-anisidine (2-methoxyaniline), which is an The structure of 2-nitroanisole intermediate in the production of many azo dyes. This compound is used in pharmaceutical industry as an intermediate in the synthesis of some medicaments [30, 31]. In spite of potent rodent carcinogenicity of 2-NA, this chemical is weakly mutagenic in the Ames test with the Salmonella typhimurium. This carcinogen also exhibits a low activity in cytogenetic tests. It induces a slight increase in chromosomal aberration and in sister chromatid exchanges, but only at high concentrations [31]. 2-nitroanisole may be metabolized in two different pathways. The major route of 2-NA metabolism in vivo is oxidative demethylation to 2-nitrophenol, which appears in urine predominantly as a sulfate conjugate generated by the reaction with phosphoadenosinephosphosulfate catalyzed by sulfotransferase or a conjugate with [22]. glucuronic acid generated by the reaction with UDP-glucuronic acid Another metabolic pathway involves reduction to 2-methoxyaniline (o-anisidine). At blood concentrations at which the metabolism and elimination of 2-NA are linear, o-anisidine is a minor metabolite formed in liver. This 2-NA nitroreduction, considered generally as an activation pathway for aromatic nitro compounds, was also clearly documented in the in vivo study [22]. Recently, it was shown that N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine is formed as a reduction metabolite of 2-NA after incubation with animal and human hepatic cytosol and buttermilk xanthine [22]. oxidase, and binds covalently to DNA in vitro Furthermore, it was demonstrated that [37]. 2-NA generates DNA adducts in vivo in rats treated with this chemical These results, -1- RNDr. Martina Svobodová Introduction confirming 2-NA covalent binding to DNA after activation by human cytosolic reductases in vitro and in rats in vivo, indicate a genotoxic mechanism of 2-nitroanisole carcinogenicity. 3-Nitrobenzanthrone 3-Nitrobenzanthrone (3-NBA, 3-nitro-7H- NO2 1 benz[de]anthracen-7-on, figure 2) a polycyclic 11 3 aromatic nitro compound, is a strong mutagen, 10 4 [16] carcinogen for rodent and suspected 9 5 7 [20]. carcinogen for human Its genotoxicity was 8 6 O [9, 16] demonstrated in many tests for mutagenicity Figure 2 and by the fact, it has a potential to form specific The structure of 3-nitrobenzanthrone [2]. DNA adducts These adducts were detected in vitro in cell cultures and in vivo in rat and mouse [2, 3, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 27, 36]. [24, 3-NBA occurs in natural elements, it was detected in soil and also in rainwater 25, 40]. Its presence in exhaust fumes was demonstrated in 1997 [16]. 3-NBA was detected in [16, 23], exhaust fumes in range from 0.1 to 24 pmol/mg in the atmosphere from [16, 17] [25, 40], 1.4 to 249 fmol/m3 and in soil in range from 4.3 to 4211 fmol/g which suggests that 3-NBA is mainly generated by imperfect combustion of diesel fuel. 3-NBA may also arise from reaction of parental polycyclic hydrocarbon with nitrogen oxides in [16, 17]. the atmosphere (especially when ozone is present), however, to a lesser extent Its genotoxicity may pose a high risk, especially to professional drivers, garage and gas stations personnel, auto mechanics and miners [18, 28, 29, 33]. Biotransformation of 3-NBA occurs namely in a reductive way [5, 7, 8, 35]. In the first biotransformation phase, the nitro group (-NO2) of 3-NBA is firstly reduced to N-hydroxylamine (-NHOH). This reaction is catalyzed by cytosolic enzyme [7] [1, 13] NAD(P)H:quinone oxidoreductase and, to a lesser extent, by xanthinoxidase and [8]. microsomal NADPH:cytochrome P450 oxidoreductase (POR) The generated N- hydroxylamine is very unstable and splits into nitrenium ion, which either alone or after [2, 3]. conversion to carbenium ion reacts with nucleophilic centers of DNA In the second phase of biotransformation, N-hydroxylamine is conjugated with active sulfate or acetate, -2- RNDr. Martina Svobodová Introduction which facilitates creation of nitrenium ion. N, O-acetyltransferases (NAT1 and NAT2) and sulfotransferases (SULT1A1 and SULT1A2) catalyze these reactions in human body [5, 7]. 2-Nitrobenzanthrone NO2 2-Nitrobenzanthrone (2-NBA, 2-nitro- 2 7H-benz[de]anthracen-7-on, figure 3) is another 1 3 11 polycyclic aromatic nitro compound, that occurs 10 4 as a pollutant in air pollution. This isomer of 9 5 7 3-NBA was detected in polluted air in 8 6 O concentrations up to 70x higher than in the case Figure 3 of 3-NBA. 2-NBA is generated primarily by The structure of 2-nitrobenzanthrone processes occurring in the atmosphere, while 3-NBA occurring especially in the exhaust fumes is formed from combustion processes [32, 39]. Genotoxicity of both isomers was tested in several in vitro and in vivo studies in rats. These experiments suggest that the 2-NBA is capable of producing DNA adducts as [4, 26]. well In comparison with 3-NBA, the ability of 2-NBA-DNA adducts formation is [4, 38]. very low, therefore, the 2-NBA is regarded as slightly toxic compound Despite this fact, high concentrations of 2-NBA in the air may pose substantial health risk to human population. -3- RNDr. Martina Svobodová Aim of the study AIM OF THE STUDY The aim of this study is to extend our knowledge on the metabolism of the carcinogenic aromatic nitro compounds, specifically industrial pollutant 2-nitroanisole and two environmental pollutants 2-nitrobenzanthrone and 3-nitrobenzanthrone. The objectives of this work are as follows: • To prepare and characterize 2,5-dihydroxynitrobenzene as a metabolite of 2-nitroanisole that is formed from this compound besides 2-nitrophenol and 2,6-dihydroxynitrobenzene • To evaluate metabolism of 2-nitroanisole by cytochromes P450 in rat microsomes • To investigate metabolism of 2-nitroanisole by rat and human cytochromes P450 • To examine 2-nitrophenol metabolism by rat and human cytochromes P450 • To study kinetics of 2-nitrophenol oxidation by cytochromes P450 2E1 • To elucidate metabolism and activation of environmental pollutants 2-nitrobenzanthrone and 3-nitrobenzanthrone -4- RNDr. Martina Svobodová Results and discussion RESULTS AND DISCUSSION The results shown in this study extend our knowledge on the metabolism of carcinogenic aromatic nitro compounds, especially industrial pollutant 2-nitroanisole and two environmental pollutants 2-nitrobenzanthrone and 3-nitrobenzanthrone endangering the human population. The main results of this work are summarized as follows: 2,5-Dihydroxynitrobenzene was identified as a metabolite of 2-nitroanisole that is formed from this compound besides 2-nitrophenol and 2,6-dihydroxynitrobenzene On the basis of comparison of chromatographic properties of the unknown 2-NA metabolite and the synthetics standard and with the use of co-chromatography with incubation mixture this metabolite was characterized as 2,5-dihydroxynitrobenzene (figure 4). 40.0 2 - 7.468 3 - 8.571 WVL:254 nm 2-NA Absorbance 25.0 4 - 10.617 1 - 6.534 2-NP 12.5 0.0 2,6-DNB 2,5-DNB -10.0 0.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 12.5 13.8 15.0 16.3 17.5 18.8 19.9 Time [min] Figure 4 The separation of 2-NA metabolites formed by rabbit hepatic microsomes with added 2,5- DNB by means of HPLC. Individual cytochromes P450 responsible for generation of individual 2-nitroanisole metabolites were identified In order to identify the role of specific CYP enzymes in the oxidation pathway of 2-nitroanisole to its metabolites we used hepatic microsomal fractions of rat pretreated with known inductors of individual cytochromes P450 and recombinant rat and human cytochromes P450 in SupersomesTM. The results that involved rat enzymes were compared with those found for 2-nitroanisole oxidation by human CYPs. The same metabolites are -5- RNDr. Martina Svobodová Results and discussion formed in both biological species (figure 5, pg. 6). The CYP 2E1 and 1A1 enzymes were the most efficient in metabolism of 2-NA to 2-NP. Among other CYPs tested in this study, CYP2B, 2C and 2D were also capable of oxidizing 2-NA, but to a lesser extent (figure 5). 8 A 8 B Rate of 2-nitroanisole metabolites formed 2-NP Rate of 2-nitroanisole metabolites formed 2-NP 7 2,5-DNB 7 2,5-DNB 2,6-DNB 2,6-DNB 6 6 (pmol/min/pmol CYP) (pmol/min/pmol CYP) 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 1A1 2A2 2B2 2C6 2C11 2C12 2C13 2D1 2D2 2E1 3A1 3A2 1A1 1A2 1B1 2A6 2B6 2C8 2C9 2C19 2D6 2E1 3A4 Figure 5 Metabolism of 2-nitroanisole by recombinant rat (A) and human (B) cytochromes P450. The values are averages and standard deviations of triplicate incubations. 2-Nitrophenol is oxidized by microsomal cyochromes P450 only to 2,5-dihydroxynitrobenzene 2-Nitrophenol is oxidized only to one metabolite, 2,5-dihydroxynitrobenzene. The efficiency of cytochromes P450 of individual animal species (human, rat, rabbit and mouse) to oxidize 2-NP was compared (figure 6, pg. 7). Among tested animal species human CYPs followed by rat CYPs were the most efficient in 2-NP oxidation. -6- RNDr. Martina Svobodová Results and discussion 0.6 Rate of 2,5-DNB formation 0.5 [pmol/min/pmol CYP] 0.10 0.05 0.00 Human Human Rat Rabbit Mouse male female Microsomes Figure 6 Rate of 2,5-DNB formation from 1 mM 2-NP by human, rat, rabbit and mouse hepatic microsomes. The values are averages and standard deviations of triplicate incubation. Identification of individual cytochromes P450 involved in 2-nitrophenol oxidation In order to resolve which human cytochromes P450 are able to oxidize 2-nitrophenol, three experimental approaches were employed: (i) microsomes of rat pretreated with known inductors of individual CYPs, (ii) heterologous expression systems (SupersomesTM) and (iii) selective inhibition of CYPs. The results with rat enzymes were again compared to those found for 2-NP oxidation by human CYPs. The same metabolite is, as in the case of 2-NA, formed in both biological species. CYP2E1 followed by CYPs of 3A, 2A, 2C and 2D subfamilies were the most efficient to oxidize 2-NP (figure 7 and figure 8, pg. 8). -7- RNDr. Martina Svobodová Results and discussion 10 A 10 B Rate of 2,5-DNB formation 8 8 Rate of 2,5-DNB formation [pmol/min/pmol CYP] [pmol/min/pmol CYP] 6 6 4 4 2 2 0 0 1A1 1A2 2A1 2A2 2B1 2C6 2C112C12 2C13 2D1 2D2 2E1 3A1 3A2 1A1 1A2 1B1 2A6 2B6 2C8 2C9 2C19 2D6 2E1 3A4 Rat cytochromes P450 Human cytochromes P450 Figure 7 Oxidation of 2-NP to 2,5-DNB by recombinant rat (A) and human (B) cytochromes P450. The values are averages and standard deviations of triplicate incubation. CYP2E1 CYP3A4 CYP2A6 CYP2C CYP2D6 CYP2B6 Figure 8 The contributions of individual human CYPs to 2-NP oxidation in human hepatic microsomes 2-Nitrophenol is a detoxication metabolite of carcinogenic 2-nitroanisole Nitroreduction of 2-NP to N-(2-hydroxyphenyl)hydroxylamin or 2-aminofenol was not detected in human, rat, rabbit and mouse hepatic microsomes even under aerobic and anaerobic conditions. No reactive species binding to DNA generated during the 2-NP metabolism by human hepatic microsomes and cytosols after incubation with DNA were detected (figure 9). A B C D E F 2 1 3 32P-labeled Figure 9 Autoradiographic profiles of DNA adducts in calf thymus DNA formed by 2-NP activated with human hepatic microsomes under anaerobic conditions (A, B), with human -8- RNDr. Martina Svobodová Results and discussion hepatic cytosol under the same conditions (C, D), in DNA of urinary bladder of rats treated with 2-NA (E) and in dGp reacted with N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine (F). Samples E and F were used as positive controls. The nuclease P1 version of the 32P-postlabeling assay was used for analysis shown in panels (A, C and E), the standard procedure under ATP-deficient conditions for that in panels (B, D and F). Kinetics of 2-nitrophenol oxidation by rat and human cytochrome P450 is identical Oxidation of 2-NP to 2,5-DNB by CYP2E1 exhibits the Michaelis-Menten kinetics in both biological species. The values of Michaelis constant (Km) and maximum reaction rate (Vmax) were similar as well (table 1). Table 1 The values of Vmax a Km for 2-NP oxidation by rat and human CYP2E1 Vmax Km [pmol/min/pmol CYP] [mM] rat CYP2E1 16,2 0,35 human CYP2E1 29,5 0,21 Activation of 3-nitrobenzanthrone by studied enzymatic systems to species forming DNA adducts Using the 32P-postlabeling method we detected the DNA adducts formed after activation of 3-NBA by human hepatic cytosols, human hepatic microsomes, human NQO1, butter milk xanthinoxidase and human NADPH:CYP reductase. In contrast to the results with 3-NBA, no 2-NBA-derived DNA adducts were identified under the same experimental conditions with any of these enzymatic systems (figure 10, pg. 10). -9- RNDr. Martina Svobodová Results and discussion human NQO1 human hepatic human hepatic human primary cytosols microsomes hepatocytes A B C D 2-NBA E 1 F 1 G 1 H 5 5 5 5 1 4 4 2 4 4 3-NBA 2 2 3 2 3 3 7 3 Figure 10 Autoradiographic profiles of DNA adducts generated by 100 μM 2-NBA (A-C) and 100 μM 3-NBA (E-G) after activation with recombinant human NQO1 (A, E), human hepatic cytosols (B, F), human hepatic microsomes (C, G) and in primary cultures of human hepatocytes (HL 21 hepatocyte sample) treated with 1 μM 2-NBA (D) or 3-NBA (H) using 32P-postlabeling. Spot 1, dA-N6-3-ABA; spot 3, dG-N2-3-ABA; spots 4/5, dG-C8-N-3-ABA. 3-Nitrobenzanthrone is reduced by human NQO1 to 3-aminobenzanthrone 3-NBA is metabolized by human NQO1 to one reductive metabolite, 3-ABA. The reduction of 3-NBA depended on concentration of NQO1 and 3-NBA and was time- dependent as well. The reaction exhibited Michaelis-Menten kinetics (figure 11). In contrast, no 2-ABA was found to be generated by human NQO1. 10 A 2.0 B 9 1.8 Amount of transformed 3-NBA Amount of generated 3-ABA 8 1.6 7 1.4 6 1.2 [nmol] [nmol] 5 1.0 4 0.8 3 0.6 2 0.4 1 0.2 0 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 3-NBA [μ Μ] 3-NBA [μ Μ] Figure 11 The dependence of 3-NBA reduction (A) and production of 3-ABA (B) by recombinant human NQO1 on 3-NBA concentration. The values are averages and standard deviations of triplicate incubation. -10- RNDr. Martina Svobodová Results and discussion The different orientation of 2-nitrobenzanthrone and 3-nitrobenzanthrone in the active site of NQO1 dictates their reduction Both izomers of nitrobenzanthrone bind to the active site of NQO1 with the similar binding affinities. The orientations of the two NBA isomers in the active site are different (figure 12), however, resulting in a greater distance of the nitro group of 2-NBA to the hydrogen on N5 of the isoalloxazine ring of FAD than that of 3-NBA. These spatial arrangements favor a hydride transfer to the nitro group of 3-NBA but not to that of 2-NBA. Figure 12 The binding orientations resulting from molecular docking calculations enabling the hydrogen transfer from N5 of isoalloxazine ring of FAD to the nitro group of 3-NBA (Ba,Bb) but less to that of 2-NBA (Aa,Ab) are shown docked to the active site of human NQO1. The two possible forms of reduced isoalloxazine ring – ionized enolate and protonated enol - bound to the NQO1 active site are labeled with subscript a and b, respectively. Both NBA ligands are positioned parallel to the flavin prosthetic group. 2-NBA or 3-NBA, FAD cofactor and amino acids residues within 5.5 Å from ligand are rendered as bold sticks, and sticks and lines, respectively. 2-Nitrobenzanthrone inhibits formation of DNA adducts generated by 3-nitrobenzanthrone 2-NBA inhibited the formation of the 3-NBA-DNA adducts (figure 13, pg. 12). This result indicates that 2-NBA competes with 3-NBA for binding to NQO1, thereby decreasing the metabolite activation of 3-NBA to DNA adduct forming intermediates. -11- RNDr. Martina Svobodová Results and discussion 600 500 3-NBA-DNA adducts [RAL x 10-8] 400 300 200 100 0 50 100 150 200 250 300 2-NBA [μM] Figure 13 Effect of 2-NBA (10, 30, 300 µM) on DNA adduct formation by 30 µM 3-NBA activated with recombinant human NQO1. The values are averages and standard deviations of triplicate incubation. A part of results of this PhD. thesis has already been published in scientific journals (see papers 1-7 in List of publications). This work was supported by the Grant Agency of the Czech Republic (grant 303/09/0472) and Ministry of Education of the Czech Republic (grants MSM 0021620808 a 1M0505). -12-
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Martina Svobodová, Ph.D. 2.07 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Martina Svobodová, Ph.D. 917 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Martina Svobodová, Ph.D. 898 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Gustav Entlicher, CSc. 76 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Pavel Souček, CSc. 1.65 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 682 kB