velikost textu

Význam transportních proteinů pro ochranu plodu

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Význam transportních proteinů pro ochranu plodu
Název v angličtině:
Importance of Transporter Proteins for Fetal Protection
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Lenka Hahnová
Školitel:
Prof.PharmDr. František Štaud, Ph.D.
Oponenti:
prof. RNDr. Pavel Anzenbacher, DrSc.
Prof. MUDr. Vladimír Geršl, CSc.
Id práce:
84472
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Farmakologie a toxikologie (DFX)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
30. 3. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
SOUHRN Dizertační práce Mgr. Lenka Hahnová (roz. Cygalová) Placenta představuje jedinečné spojení mezi matkou a plodem zajišťující řadu funkcí nezbytných pro správný průběh těhotenství a vývoj jedince. Jednou z hlavních funkcí placenty je výměna plynů, přívod živin do plodu a odvod jeho metabolických zplodin. Mimoto plní placenta také roli endokrinní, metabolickou a především ochrannou, jelikož matka je v průběhu těhotenství vystavována, ať už nevědomě či záměrně, celé škále pro plod toxických látek. Dříve se předpokládalo, že fyziologickou bariéru mezi cirkulacemi matky a plodu tvoří pouze buněčné vrstvy syncytiotrofoblast a endotel fetálních kapilár. Nedávno však bylo zjištěno, že kromě této mechanické složky disponuje placenta i ochrannou složkou aktivní, která je realizována působením efluxních transportérů a biotransformačních enzymů lokalizovaných v polarizované vrstvě syncytiotrofoblastu. Efluxní transportéry jsou membránové proteiny, které jsou díky své afinitě k ATP schopny aktivně vypumpovávat velké množství různorodých molekul ven z buňky. Dosud nejlépe prostudovanými lékovými efluxními transportéry jsou P-glykoprotein (P-gp) a „breast cancer resistance protein“ (BCRP), které významným způsobem ovlivňují kinetiku transportu látek přes placentu. Hlavním cílem této dizertační práce bylo studium exprese placentárních transportérů Bcrp a P-gp a jejich vlivu na transport farmak přes placentu. V první práci jsme s využitím metod RT-PCR, Western blottingu a imunohistochemie prokázali přítomnost Bcrp v terminální potkaní placentě i buněčné linii HRP-1. Při paralelním testování P-gp jsme popsali značnou expresi v placentě, avšak v placentárních buňkách HRP- 1 nebyl tento transportér detekován. Přítomnost Bcrp v buněčné linii HRP-1 jsme potvrdili i na úrovni funkční s využitím inhibitorů Ko143 a GF120918. Jejich účinkem jsme pozorovali zvýšení akumulace fluorescenčně značeného substrátu BODIPY FL prazosinu do buněk o více než 100%. Stejně tak byla touto akumulační studií prokázána absence efluxní aktivity P- gp, což potvrdilo jeho nedetekovatelnost na úrovni mRNA a proteinu. Dále jsme v této práci studovali vliv Bcrp na transplacentární prostup modelového substrátu cimetidinu s využitím metody duálně perfundované potkaní placenty. Sledování transportu látky ve směru materno- fetálním a feto-maternálním prokázalo značnou asymetrii, která byla částečně snížena přidáním BCRP inhibitorů fumitremorginu C a GF120918, a zcela eliminována při vysokých koncentracích cimetidinu. Tato práce přinesla dva základní poznatky týkající se protektivní role BCRP v placentě, a to že transportér nejen redukuje prostup substrátů z matky do plodu, ale také aktivně odstraňuje léčiva v cirkulaci plodu již přítomná. Přestože ochranná aktivita Bcrp v placentě na konci březosti byla první studií potvrzena, stále nebylo zřejmé, zda je transportér Bcrp přítomen v placentě experimentálního zvířete po celou dobu březosti a zda se jeho exprese a funkce v návaznosti na gestační období mění. V naší další práci jsme tudíž sledovali expresi placentárního Bcrp v průběhu březosti potkana na úrovni mRNA a pozorovali signifikantně vyšší množství Bcrp transkriptů v 15. než v 12., 18. a 21. dni. V další části této studie jsme ve fetální tkáni kvantifikovali sedminásobně vyšší expresi Bcrp mRNA ke konci gestace v porovnání s 12. dnem. Ochrannou roli placentárního a fetálního Bcrp jsme zkoumali sledováním množství modelového Bcrp substrátu cimetidinu ve fetální tkáni po infuzní aplikaci do krve matky. Ve 12. dni gestace jsme pozorovali desetinásobně vyšší expozice plodu cimetidinu vzhledem k ostatním sledovaným dnům. Navíc srovnání postinfuzní hladiny substrátu v plodu odhalilo podstatně nižší průnik do mozku než do celkové fetální tkáně. Tyto poznatky podpořily naši hypotézu, že rostoucí exprese Bcrp ve fetální tkáni může s postupujícím těhotenstvím posilovat protektivní roli placenty před látkami pro vyvíjející se plod potenciálně toxickými. Překrývající se substrátová specifita a podobná tkáňová distribuce transportérů P-gp a BCRP naznačují také jejich společnou úlohu na detoxikačních procesech placenty, proto jsme se rozhodli naši další práci zaměřit na posouzení efektu P-gp a Bcrp na transplacentární farmakokinetiku (PK) jejich substrátů. S využitím specifických inhibitorů, koncentrační škály modelových látek a PK výpočtů na modelu duálně perfundované potkaní placenty jsme potvrdili účinek P-gp a Bcrp ve smyslu omezení materno-fetálního (mf) a urychlení feto- maternálního (fm) transportu. Otázku, zda počet transportérů zapojených do transferu látky může ovlivnit její transplacentární PK, jsme se pokusili zodpovědět aplikací duálního substrátu P-gp a BCRP – BODIPY FL prazosinu (BP) na náš model perfundované potkaní placenty. Navzdory očekávání byl však u BP poměr clearance ve fm a mf směru (4,0) nejnižší mezi sledovanými látkami (cimetidin – 24,6; rhodamin 123 - 11,0; glyburid - 11,2). Obdobných výsledků bylo dosaženo také při testování eliminace týchž substrátů z kompartmentu plodu s využitím recirkulace fetálního rezervoáru, což naznačilo, že vliv fyzikálně-chemických vlastností, zejména liposolubility, může převážit nad efektem proteinů P-gp a Bcrp na transplacentární transport BP. Tuto hypotézu jsme v naší studii potvrdili PK modelováním. Ze vztahu mezi pasivním/aktivním transportem a liposolubilitou vyplynulo, že vzestup rozpustnosti látky v tucích zvyšuje pasivní difuzi a zároveň snižuje účinnost lékových transportérů. Závěrem lze konstatovat, že výsledky našich studií potvrzují expresi a funční aktivitu Bcrp a P-gp v placentě potkana a kvantifikují vliv těchto efluxních transportérů na ochranu a detoxikaci plodu. Z poslední studie je však zřejmé, že relativní efektivita efluxních transportérů v transplacentární farmakokinetice může být limitována dalšími faktory, jako je lipofilita sledovaných molekul.
Abstract v angličtině:
SUMMARY Doctoral thesis Mgr. Lenka Hahnová (Cygalová) Placenta, which represents a unique link between the mother and fetus, fulfills many functions essential for normal course of pregnancy and uncomplicated development of the fetus. Nutrient supply, gas exchange and metabolic waste product removal belong to its main roles. In addition, placenta serves as an endocrine, metabolic, immune and protective organ, since during pregnancy mother may be, either unconsciously or deliberately, exposed to a wide range of substances toxic for the fetus. Originally, it was supposed that the physiological barrier between maternal and fetal circulation is created only by cellular layers of syncytiotrophoblast and endothelium of fetal capillaries. However, it has been demonstrated that besides this mechanical component of protection, activity of drug efflux transporters and metabolic enzymes localized in the polarized syncytiotrophoblast layer contribute considerably to the protective function of placental barrier. Efflux transporters are ATP dependent membrane proteins capable of actively removing different molecules out of cells. So far, the best described drug efflux transporters are P-glycoprotein (P-gp) and breast cancer resistance protein (BCRP), significantly affecting kinetics of transplacental passage of various substances. The main goal of this work was to study the expression of placental transporters Bcrp and P-gp and their effect on the transport of drugs across the placenta. In the first study the presence of Bcrp in the rat term placenta and placental cell line HRP-1 was demonstrated by RT-PCR, Western blotting and immunohistochemistry. Simultaneously, we detected the expression of P-gp in the rat placenta but not in HRP-1 cell line. We confirmed the presence of Bcrp in the HRP-1 cells also functionally using inhibitors, Ko143 and GF120918, which increased accumulation of a fluorescent BCRP substrate BODIPY FL prazosin to the cells by more than 100%. Consistently with the results of expression studies no activity of P-gp was observed in the HRP-1 cell line. Furthermore, we investigated the impact of Bcrp on the transplacental transfer of a model substrate cimetidine using dually perfused rat placenta. We observed a considerable asymmetry between the materno-fetal and feto-maternal transport of the substrate, which was partly decreased by BCRP inhibitors fumitremorgin C and GF120918 and entirely eliminated at high cimetidine concentrations. This study clearly demonstrated that BCRP not only reduces the passage of drugs from the mother to the fetus but also actively removes the drug already present in fetal blood, even against concentration gradient. Although we described the protective activity of placental Bcrp at the end of gestation, its expression and function in the earlier stages of gestation remained unclear. In our following study, therefore, we analyzed the expression of placental Bcrp mRNA during the course of pregnancy in rat and observed significantly higher amount of Bcrp transcripts on gestation day (gd) 15 compared to gd 12, 18 and 21. In the next part of this study we quantified a 7-fold higher level of Bcrp mRNA in fetal tissues at the end of gestation compared to the 12th gd. Furthermore, we studied the function of placental and fetal Bcrp by fetal exposure to a model substrate, cimetidine, infused to the maternal circulation. The relative amount of drug that penetrated to the fetus was highest on gd 12 and decreased to one tenth thereafter. Moreover, we have revealed much lower penetration of cimetidine to the brain compared to the whole fetal tissue. Our results indicate that increasing expression of Bcrp in fetal tissues can strengthen the protective role of placental Bcrp as pregnancy proceeds. Overlapping substrate specificity and similar tissue distribution shared by P-gp and BCRP suggest their common role in detoxication processes of the placenta. Therefore, in the final study we aimed to evaluate the effect of P-gp and Bcrp on the transplacental pharmacokinetics (PK) of their substrates using the model of dually perfused rat placenta. Specific inhibitors, various concentrations of model substrates and PK modeling have been applied to assess the efficacy of these proteins to hinder maternal-to-fetal (mf) and accelerate fetal-to-maternal (fm) transport. Using a dual substrate of P-gp and BCRP, BODIPY FL prazosin (BP), we tried to answer the question whether the number of transporters involved in the transfer of a substance is reflected in its transplacental PK. Contrary to our expectations, however, the ratio of BP clearances between fm and mf direction (4.0) was the lowest among all tested substances (cimetidine – 24.6; rhodamine – 11.0; glyburide – 11.2). When testing the elimination of the same substrates from the fetal compartment by fetal reservoir recirculation, similar results were obtained, suggesting that effect of physical-chemical properties, especially liposolubility, can outweigh the impact of P-gp and Bcrp on the transplacental transport of BP. This hypothesis was confirmed in our study by PK modeling. Based on the relationship between passive/active transport and liposolubility we conclude that a rise in lipid solubility increases the passive diffusion and, at the same time, decreases the efflux transporter effectiveness. In conclusion, the results of our studies confirm expression and functional activity of Bcrp and P-gp in the rat placenta and quantify the role of these transporters in fetal protection and detoxication. However, the last study indicates that the relative effectiveness of efflux transporters in transplacental pharmacokinetics may be limited by other factors, such as drug lipid solubility.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Lenka Hahnová 10.88 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Lenka Hahnová 171 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Lenka Hahnová 154 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Prof.PharmDr. František Štaud, Ph.D. 374 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Pavel Anzenbacher, DrSc. 127 kB
Stáhnout Posudek oponenta Prof. MUDr. Vladimír Geršl, CSc. 127 kB