velikost textu

Immunoprotective character of polymer cytotoxic drugs

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Immunoprotective character of polymer cytotoxic drugs
Název v češtině:
Imunoprotektivní vlastnosti polymerních cytostatik
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Milada Šírová, Ph.D.
Školitel:
prof. RNDr. Blanka Říhová, DrSc.
Oponenti:
RNDr. Jaroslav Turánek, CSc.
prof. PharmDr. Miloslava Rabišková, CSc.
Id práce:
84470
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Fyziologie a imunologie (P1511)
Obor studia:
Imunologie (XIMUN)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
13. 9. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
CHARLES UNIVERSITY IN PRAGUE UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Faculty of Natural Sciences PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Dizertační práce PhD. Thesis in Immunology IMUNOPROTEKTIVNÍ VLASTNOSTI POLYMERNÍCH CYTOSTATIK Cytostatic and Immunomodulatory Properties IMMUNOPROTECTIVE CHARACTER of Polymeric Prodrugs OF POLYMER CYTOTOXIC DRUGS RNDr. Tomáš Mrkvan RNDr. Milada Šírová Školitelka : prof. RNDr. Blanka Říhová, DrSc. Sektor imunologie a gnotobiologie Supervisor: Prof. RNDr. Blanka íhová, DrSc. Mikrobiologický ústav Department of Immunology and Gnotobiology Akademie věd Microbiology Institute of České republiky Academy of Sciences of the Czech Republic Praha, květen 2010 Prague, March 2006 DOKTORSKÉ STUDIJNÍ PROGRAMY V BIOMEDICÍNĚ UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE A AKADEMIE VĚD ČESKÉ REPUBLIKY PROGRAM: IMUNOLOGIE PŘEDSEDA OBOROVÉ RADY: DOC. RNDR. VLADIMÍR HOLÁŇ, DRSC. ŠKOLICÍ PRACOVIŠTĚ: MIKROBIOLOGICKÝ ÚSTAV AVČR, V. V. I. AUTOR: MILADA ŠÍROVÁ ŠKOLITEL: PROF. RNDR. BLANKA ŘÍHOVÁ, DRSC. ŠKOLITEL KONSULTANT (BYL-LI): NE S DISERTACÍ JE MOŽNO SE SEZNÁMIT NA DĚKANÁTĚ PŘÍRODOVĚDECKÉ FAKULTY UNIVERZITY KARLOVY V PRAZE 2 OBSAH I. ÚVOD .. 3 I.1. Cílená léčba nádorových onemocnění .. 3 I.2. Nízkomolekulární protinádorová léčiva .. 3 I. 3. Léčiva směrovaná ligandem .. 4 I. 3. 1. Protilátky .. 4 tky I. 4. Vysokomolekulární systémy pro dopravu léčiv .. 5 iv I. 4. 1. Nanoterapeutika pro pasivní akumulaci .. 5 I. 4. 2. Vodorozpustné polymery jako nosiče protinádorových léčiv.. 6 iv I. 4.2. 1. Konjugáty polymeru s proteinem .. 6 I. 4. 2. 2. Konjugáty polymeru a léčiva .. 7 I. 5. Polymerní léčiva na bázi HPMA .. 7 zi I. 5. 1. Nesměrované konjugáty na bázi HPMA.. 8 MA I. 5. 2. Směrované konjugáty na bázi HPMA .. 8 zi II. CÍLE PRÁCE .. 8 LE PR III. METODY .. 9 IV. VÝSLEDKY A DISKUSE .. 9 V IV. 1. Aktivace imunitních mechanismů u pacientek léčených konjugátem na bázi HPMA s navázaným doxorubicinem a obsahujícím lidský intravenózní imunoglobulin .. 9 IV. 2. Protinádorový efekt konjugátu DoxAM-PHPMA-HuIg u nádorového modelu EL4 lymfomu ..11 IV. 3. Preklinický vývoj polymerních terapeutik na bázi HPMA ý ývoj s pH-kontrolovanou vazbou Dox..12 IV. 4. Protinádorová aktivita polymerních proléčiv s pH-kontrolovaným uvolňováním léčiva, obsahujících paklitaxel nebo docetaxel ..15 V. ZÁVĚRY ..16 Á ÁV VI. POUŽITÁ LITERATURA..31 VII. SEZNAM PUBLIKACÍ SE VZTAHEM K DIZERTAČNÍ PRÁCI ..35 1 CONTENTS I. INTRODUCTION ..18 I. 1. Targeted therapy of cancer..18 I. 2. Low-molecular weight anticancer drugs ..18 I. 3. Ligand-targeted therapies ..19 I. 3. 1. Antibodies ..19 I. 4. High-molecular-weight delivery systems ..20 I. 4. 1. Nanosized devices for passive drug targeting ..20 I. 4. 2. Water-soluble polymers as carriers for anti-cancer drugs ..20 I. 4. 2. 1. Polymer-protein conjugates ..21 I. 4. 2. 2. Polymer-drug conjugates ..22 I. 5. HPMA copolymer-bound drugs ..22 I. 5. 1. Non-targeted HPMA copolymer conjugates ..23 I. 5. 2. Targeted HPMA copolymer conjugates ..23 II. AIMS OF THE STUDY ..23 III. METHODS ..23 IV. RESULTS AND DISCUSSION..24 IV. 1. Activation of immune mechanisms in patients treated with HPMA copolymer-bound doxorubicin conjugate containing human intravenous immunoglobulin ..24 IV. 2. Anti-cancer effect of DoxAM-PHPMA-HuIg conjugate in a model of murine T cell lymphoma ..25 IV. 3. Preclinical development of HPMA-based polymer therapeutics with pH-controlled release of Dox ..27 IV. 4. Anti-cancer activity of polymer prodrugs with pH-controlled drug release, containing paclitaxel or docetaxel ..29 V. CONCLUSIONS ..30 VI. REFERENCES..31 VII. LIST OF PUBLICATIONS RELATING TO THE THESIS ..35 2 I. ÚVOD Nádorová onemocnění jsou obecným problémem všude na světě. V ekono- micky rozvinutých zemích představují druhou nejzávažnější příčinu smrti po kardiovaskulárních onemocněních, a počet onkologicky nemocných pacientů roste s rostoucím průměrným věkem obyvatelstva. Základními prostředky léčby nádorů je kombinace chirurgické léčby, oza- řování a chemoterapie. Zatímco chirurgické zásahy a ozařování jsou relativné přesné a lze jimi dosáhnout odstranění nádoru v daném místě, chemoterapie působí systémově. Při vhodné kombinaci a načasování těchto tří způsobů léčby lze dosáhnout úplného vyléčení velmi podstatné části nemocných s he- matologickými malignitami, a v menší, ovšem stále významné míře i vyléčení různých typů solidních nádorů. Většina cytostaticky/cytotoxicky působících léčiv, které se dnes běžně po- užívají, působí na intenzivně se dělící buňky. Tento neselektivní charakter chemoterapeutik má za následek zvýšenou toxicitu vůči normálním rychle proliferujícím buňkám. To znamená, že tato léčiva je nutné používat v sub- optimálních dávkách, a to vede k vývoji (mnohočetné) resistence vůči lékům, metastatickému šíření nádoru, a nakonec až k selhání léčby. K tomu, aby se dosáhlo lepších výsledků léčby je třeba vyvinout nové léčebné strategie. Vývoj se ubírá zhruba třemi směry. Za prvé, sofistikovaný výzkum genomu a proteo- mu je schopen vyhledávat nové vhodné molekulární cíle specifické pro nádory. Za druhé, vytvářejí se systémy dopravující léčiva (drug delivery systems) buď tak, aby se dosáhlo přesnější „dopravy“ léčiva do zvolených cílových tkání a buněk a naopak se snížila koncentrace léčiva v místech potenciálního poško- zení (normálních tkání), nebo aby se dosáhlo koncentrace léčiva dostatečně vysoké pro vyvolání léčebného efektu v příslušné lokalizaci po delší dobu. Zatřetí, velká pozornost je věnována vypracovávání strategií, které posílí pro- tinádorovou odpověď imunitního systému. I.1. Cílená léčba nádorových onemocnění Cílenou léčbou se rozumí takové strategie léčby, které jsou založeny na rozdí- lech mezi buňkami nádorovými a normálními („molekulární cíle léčby“), nebo na rozdílech mezi zdravými tkáněmi a tkáněmi s maligním procesem. Cílená léčba využívá několik typů léčiv a strategií a) malé molekuly blokující enzymy působící pouze v nádorových buňkách b) cílená – směrovaná léčiva s využitím specifického ligandu c) vysokomolekulární systémy pro dopravu léčiv. I.2. Nízkomolekulární protinádorová léčiva Reprezentantem tohoto typu léčiv je imatinib mesylát (Gleevec/Glivec), selektivně působící kompetitivní inhibitor BCR-ABL tyrozin kinázy, která 3 je konstitutivně aktivována v nádorových buňkách chronické myeloidní leukémie (CML), Klinické využití imatinibu významně zlepšilo výsledky léčby pacientů s CML, jelikož u většiny z nich (90 %) lze dosáhnout úplné hematologické remise [1]. I přesto se ale u některých pacientů objevují mu- tace BCR-ABL genu, takže imatinib se přestane vázat na tyrozin kinázu. Byla vyvinuta nová generace inhibitorů, jako např. nilotinib a dasatinib, které se mohou vázat i na některé mutované formy tyrozin kinázy, a vyvolávají lepší léčebný efekt [2]. Další nízkomolekulární léčiva působí cíleně na receptor pro epidermální růstový faktor (rodina EGFR), např. gefitinib a erlotinib, oba inhibitory ak- tivního místa tyrozin kinázy EGFR/ErbB1/Her1. lapatinib je inhibitor půso- bící na dva cíle, EGFR/ErbB1/Her1 a ErbB2/Her2/Neu. U naprosté většiny nádorových onemocnění se ovšem vyskytují četné ab- normality, které by bylo potřeba najednou postihnout léčbou tak, aby bylo dosaženo významného léčebného účinku. Je velmi málo pravděpodobné, že léčiva (jako je imatinib mesylát), která jsou specificky cílena vůči produktu jednoho (nádorově specifického) genu budou významněji účinná v léčbě více typů nádorových onemocnění. I. 3. Léčiva směrovaná ligandem Léčiva směrovaná za pomoci ligandu neboli aktivně směrovaná léčiva za- kládají svůj účinek na rozdílu v expresi cílových molekul mezi nádorovými a normálními buňkami. Ligand nebo protilátka (tedy směrovací struktura) se specificky váže na příslušnou strukturu přítomnou na nádorové buňce. To znamená, že takováto směrovaná terapie může vést ke zvýšenému selektiv- nímu efektu protinádorových léčiv. Prvními takto využívanými směrovacími strukturami byly protilátky, ale využívají se i další proteiny, lektiny, peptidy nebo aptamery. I. 3. 1. PROTILÁTKY Od té doby, kdy Köhler a Milstein popsali monoklonální protilátky (mAb) [3], je k dispozici již značný počet protilátek specifických vůči „nádorově spe- cifickým“ antigenům (exprimovaným pouze na nádorových buňkách), nebo vůči „nádorově asociovaným“ antigenům (které jsou většinou exprimovány i na normálních buňkách, a jejich exprese u nádorové populace buněk je buď patologicky zvýšena, nebo deregulována). Počáteční potíže vyplývající z imunogenicity myších mAb podávaných lidem (zejména tvorba lidských anti-myších protilátek, HAMA), a snížená schopnost myších mAb spouštět na protilátkách závislé efektorové mecha- nismy v lidských buňkách (tj. na protilátkách závislá cytotoxicita, ADCC, nebo komplementem zprostředkovaná cytotoxicita, CDC) byly v podstatě 4 vyřešeny vývojem chimerických, humanizovaných a plně lidských protilátek [4]. Nyní se v praxi využívá už přes 20 terapeutických mAb, mnohé z nich v léčbě maligních onemocnění. Jako příklady můžeme jmenovat rituximab (anti-CD20), trastuzumab (anti-ErbB2/Her2/Neu) cetuximab (anti-), nebo bevacizumab (anti-VEGF). Výhodou použití terapeutických protilátek je možná synergie s chemoterapií, takže léčba může postihovat nádorové buňky dvěma nezávislými prostředky. Ab reagující s molekulami přítomnými na nádorových buňkách lze konju- govat nebo fúzovat na úrovni DNA s různými dalšími molekulami a získat tak produkty s dalšími funkcemi. Takové „vyzbrojené“ Ab mohou vyvolávat lepší léčebnou odezvu než původní “nevyzbrojené“ Ab. • Imunotoxiny jsou konjugáty sestávající z molekuly (subjednotky) vysoce účinného toxinu a internalizující Ab, nebo jiného ligandu (např. cytokinu) • Konjugáty protilátek s léčivem (imunokonjugáty) většinou využívají léči- vo s vysokou cytotoxicitou, které je navázáno na molekulu Ab nebo její frag- ment • Radioimunoterapie používá konjugáty Ab s vhodným radionuklidem, tak- že cílové buňky jsou zabíjeny radioaktivním zářením • Protilátkami řízená terapie využívající enzym a proléčivo (antibody-direc- ted enzyme-prodrug therapy, ADEPT) je dvoustupňový proces, kdy se nejpr- ve aplikuje konjugát Db s enzymem, který se hromadí v nádoru, pak se apli- kuje nízkomolekulární proléčivo, které je přeměněno v aktivní léčivo účinkem enzymu lokalizovaného v nádoru I. 4. Vysokomolekulární systémy pro dopravu léčiv Tyto systémy jsou založeny na rozdílech v biochemických a fyziologických vlastnostech normální a nádorové tkáně. Vyvíjejí se a testují různé systémy pro dopravu nízkomolekulárních léčiv, které buď fyzikálně, nebo (typičtěji) chemicky vážou dané léčivo na nějaký vysokomolekulární nosič. Vysokomolekulární prostředky pro dopravu léčiv se hromadí v tkáni solid- ních nádorů díky tzv. EPR (Enhanced Permeability and Retention) efektu, který popsali Matsumura a Maeda [5]. Vaskulatura v nádorech je více pro- stupná pro makromolekuly než je vaskulatura v normálních tkáních. Nádory navíc mají velmi sporou lymfatickou drenáž (nebo téměř chybí). Makromole- kuly tedy mohou snadno prostupovat do intersticia v nádorech, ale akumulují se zde, protože nejsou odstraňovány lymfatickými cestami. EPR efekt je závis- lý na molekulové hmotnosti (Mw) a velikosti daných makromolekul. I. 4. 1. NANOTERAPEUTIKA PRO PASIVNÍ AKUMULACI Existuje celá řada vysokomolekulárních systémů, které jsou založeny bud na ko- loidních partikulích, nebo využívají vodorozpustné polymery jako nosiče léčiv. 5 Nejčastěji využívanými vysokomolekuárními systémy dopravy léčiv jsou dendrimery, lipozómy, emulze a pevné lipidové nanočástice, dále micely a další spontánně se formující nanočástice, a také polymerní nanočástice. I. 4. 2. VODOROZPUSTNÉ POLYMERY JAKO NOSIČE PROTINÁDOROVÝCH LÉČIV Konjugace léčiv s vysokomolekulárními polymery může být výhodná z něko- lika důvodů: • Udílí vodorozpustnost i léčivům, která mají vysoce hydrofobní charakter. Tím lze dosáhnout vyšší biologické dostupnosti léčiva a vhodné distribuce v organismu. • Chrání léčivo alespoň dočasné před vazbou na sérové proteiny, před en- zymatickým rozštěpením nebo proti odklízecímu efektu. V důsledku toho se významně zvyšuje poločas léčiva v organismu i jeho biologická dostupnost, a zároveň je omezeno vylučování ledvinami • Polymerní konjugáty se akumulují v solidní nádorové tkáni díky EPR efek- tu. Navíc lze využít i směrování, protože konjugáty mohou nést také směrující strukturu, která specificky rozpoznává cílovou molekulu na nádorové buňce • Konjugace významně ovlivňuje kinetiku léčiva v těle. Dosahuje se vyššího nahromadění v žádaném místě (v nádoru) a redukuje se vstup léčiva do nor- málních tkání. To omezuje nežádoucí systémovou toxicitu příslušného nízko- molekulárního léčiva. • Konjugace léčiva a nosiče mění také osud léčiva na buněčné úrovni. Většina nízkomolekulárních léčiv vstupuje do buněk rychle (minuty) přes plasmatic- kou membránu. Polymerní konjugáty se do buněk obvykle dostávají pomaleji endocytickou cestou [6]. Endocytóza může alespoň částečně obejít eflux léčiv zprostředkovaný P-glykoproteinem, a tak se zabraňuje vzniku (mnohočetné) resistence. Jako nosiče léčiv se využívají přirozeně se vyskytující i syntetické polymery. Syntetické polymery mají ve srovnání s biopolymery některé výhody, jako je např. možnost cíleně ovlivňovat složení a strukturu polymerního nosiče, mož- nost zavádět různé funkční skupiny, které umožňují navázání léčiva, nebo vel- mi nízká imunogenicita. Koncept použití vysokomolekulárních polymerů jako nosičů léčiv navrhl Ringsdorf už v roce 1975 [7]. Od té doby byla vyvinuta a studována celá řada polymerů, nesoucích buď protein, nebo nízkomolekulární léčivo. I. 4.2. 1. Konjugáty polymeru s proteinem Do této kategorie spadají dva hlavní typy konjugátů: pegylované proteiny a SMANCS. • Pegylované proteiny: princip konjugace bílkovin a poly(etylen glyko- lu) (PEG) popsali v roce 1977 Davis a Abuchowski [8], a od té doby se 6 používá termínu „pegylace“. Konjugace proteinu a PEGu a) zvyšuje roz- pustnost a stabilitu proteinu, redukuje jeho imunogenicitu a antigenicitu b) zabrání rychlému vyloučení malých proteinů renální cestou, u velkých proteinů sníží jejich odstraňování vazbou na receptory v retikuloendoteliál- ním systému, a c) prodlužuje poločas v plasmě. PEG samotný je netoxický a neimunogenní. Pegylace se uplatnila u řady peptidů a proteinů, zejména enzymů a cyto- kinů. Některé jsou využívány v klinické praxi (např. adenosin deamináza, L-asparagináza, interferony, erytropoietin, kolonie-stimulující faktory). • SMANCS je konjugát neokarcinostatinu (NCS) a poly(styren-ko-maleinové kyseliny) (SMA), nazývaný SMANCS [9,10]. Jeho Mw je 16 kda, ale protože se nekovalentně váže na albumin, chová se jako protein o vysoké Mw kolem 80 kDa. Ve srovnání s NCS má konjugát některé významné farmakologické výhody, zejména prodloužený biologický poločas, zvýšené hromadění v ná- dorové tkáni, a sníženou systémovou toxicitu. SMANCS byl povolen v Ja- ponsku pro léčbu hepatocelulárního karcinomu [11]. I. 4. 2. 2. Konjugáty polymeru a léčiva Podobně jako u ostatních vysokomolekulárních systému pro dopravu léčiv, cílem u těchto konjugátů je dosáhnout a) lepšího směrování léčiva do nádo- rové tkáně, b) redukovat nežádoucí toxicitu tím, že se omezí přístup léčiva do míst možného poškození, a c) překonání mechanismů, které mohou vést k resistenci na léčiva. Většina těchto až dosud studovaných konjugátů využívala rutinně používa- ná protinádorová léčiva. Různé konjugáty byly testovány, některé z nich už obdržely povolení pro klinické využití, např. PEG, poloxamer-188, poly(lak- tid-ko-glykolid,), PLGA, nebo poly(α-glutamová kyselina), PGA. I. 5. Polymerní léčiva na bázi HPMA N N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid (HPMA) je jeden z nejvíce prostudova- ných syntetických polymerů využívaných jako nosiče léčiv. Homopolymer (HPMA) vyvinul Kopeček se spolupracovníky na Ústavu makromolekulární chemie AVČR [12,13]. Později byly zavedeny do struktury homopolymeru funkční skupiny tak, aby to umožnilo konjugaci polymeru s různými léčivy a také směrujícími strukturami [14]. Spojka GlyPheLeuGly (GFLG) byla vy- brána proto, že umožňuje odštěpení léčiva pouze v uvnitř buněk aktivitou lysozomálních proteáz [15,16]. Preklinické testy prokázaly biokompatibilitu homopolymeru (HPMA) i ko- polymeru (PHPMA), dále to, že je netoxický a neimunogenní [17]. Podobně jako u pegylace, vazba proteinů na HPMA kopolymer snižuje imunogenicitu příslušného proteinu [18,19]. Studium bio- a imunokompatibility konjugátů 7 na bázi HPMA bylo od počátku spojeno se jménem B. Říhové – přehled viz. [20]. Pro přípravu polymerních konjugátů na bázi HPMA byla použita už celá řada nízkomolekulárních léčiv, např. chlorin e6, derivát elipticinu, puromycin, wortmanin, geldanamycin, camptothecin, metotrexát a jeho deriváty, paklita- xel, 5-fluorouracil, TNP-470, cyklosporin A, a několik léčiv ze skupiny antra- cyklinů: epirubicin, daunorubicin a doxorubicin. Polymerní konjugáty na bázi HPMA mohou vázat léčivo buď enzymaticky štěpitelnou (amidickou) vazbou [21,22], nebo pomocí vazby štěpitelné v zá- vislosti na pH [23,24]. Oba typy konjugátů se pasivně akumulují v tkáni so- lidních nádorů díky EPR efektu. Byly připraveny i konjugáty směrované, a to s amidickou i hydrazonovou (pH-závislou) vazbou léčiva. I. 5. 1. NESMĔROVANÉ KONJUGÁTY NA BÁZI HPMA Prvním konjugátem tohoto typu byl konjugát obsahující doxorubicin (Dox) navázaný enzymaticky štěpitelnou vazbou přes GFLG spojku (DoxAM-PHP- MA, také nazývaný PK1 FCE28068). Konjgát vstoupil do klinického tes- tování, fáze I v roce 1984 [22], a později pokročil ještě do fáze II [25]. Byla prokázána pasivní akumulace v nádoru prostřednictvím EPR efektu [27], a také určitý klinický účinek u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC), kolorektálním a mamárním karcinomem. Klinicky byly testovány i další konjugáty na bázi HPMA, nesoucí jiná léči- va, např. paklitaxel, camptothecin, nebo platináty. I. 5. 2. SMĔROVANÉ KONJUGÁTY NA BÁZI HPMA Konjugáty na bázi HPMA byly postupně připraveny jako specificky směrované různými směrovacími strukturami, jako je glalaktosamin, další ligandy které se vážou na nádorové buňky (např transferin nebo folát), protilátky nebo peptidy. Galaktosaminem směrovaný konjugát (také označovaný jako PK2; FCE28069) vstoupil do fází I/II klinického testování jako léčivo pro terapii hepatocelulárního karcinomu (galaktosamin se váže na asialoglykoproteino- vý receptor, který je vysoce exprimován na nádorových buňkách, ale také se vyskytuje na normálních hepatocytech). Nebyla pozorována vyšší akumulace tohoto konjugátu v nádorové tkáni ve srovnání s normální jaterní tkání, a dal- ší klinické testování bylo ukončeno. II. CÍLE PRÁCE Hlavním cílem studie bylo přispět k vývoji polymerních proléčiv na bázi HPMA určených k léčbě nádorových onemocnění. Tento záměr byl rozdělen do několika dílčích cílů a kroků: 8 1. Přispět k provedení pilotní klinické studie, do níž byly zahrnuty pacientky s generalizovaným karcinomem mléčné žlázy, zejména testovat aktivitu přiro- zených zabíječských buněk 2. Prostudovat protinádorovou aktivitu konjugátu DoxAM-PHPMA-HuIg, který byl navržen pro klinickou studii, v experimentálním myším nádorovém modelu 3. Přispět k preklinickému vývoji DoxHYD-PHPMA konjugátů s vazbou léčiva závislou na pH, zejména prostudovat vztah fyzikálně-chemických vlastností konjugátů a protinádorové účinnosti in vivo 4. Ověřit protinádorovou účinnost konjugátů na bázi HPMA, které nesou paklitaxel nebo docetaxel navázaný vazbou závislou na pH III. METODY Všechny studované konjugáty byly syntetizovány v Laboratoři biomedicinál- ních polymerů, Ústav makromolekulární chemie AVČR, v.v.i. Syntéza a charakterizace konjugátů na bázi HPMA byla popsána v něko- lika publikacích – přehled viz. [28,29]. Nový typ konjugátů vázajících pakli- taxel (PTX) nebo docetaxel (DTX) jako biologicky aktivní léčivo je popsán v poslední publikaci (sekce IV. 4.). Základem testování protinádorových účinků konjugátů byly myší modely s využitím transplantovatelných nádorů: T buněčný lymfom EL4 (C57BL/6, H-2b, samci i samice), karcinom mléčné žlázy 4T1 (BALB/c, H-2d, samice), B buněčný lymfom 38C13 (C3H/He, H-2y, samice), a B buněčná leukémie BCL1 (BALB/c, H-2d, samice). Pilotní klinická studie byla započata v roce 2000 a provedena v Praze, ve Fakultní nemocnici v Motole. Proběhla se informovaným písemným souhla- sem pacientek. Testování biochemických, hematologických a imunologických markerů (využívaných v linické praxi) prováděla akreditovaná laboratoř (Agi- lab, Praha). Detailní popisy všech metod jsou uvedeny v jednotlivých publikacích, které jsou součástí disertační práce. IV. VÝSLEDKY A DISKUSE IV. 1. Aktivace imunitních mechanismů u pacientek léčených konjugátem na bázi HPMA s navázaným doxorubicinem a obsahujícím lidský intravenózní imunoglobulin Konjugát s lineární polymerní kostrou na bázi HPMA, k níž bylo připojeno léčivo - doxorubicin (Dox), a lidský imunoglobulin (HuIg) prostřednictvím tetrapeptidové spojky GLFG, byl vytvořen se záměrem použít jej pro kli- 9 nické testování. Jde o vysokomolekulární konjugát (Mw 500 až 100 kDa), pasivně směrovaný do nádorové tkáně EPR efektem [5,30]. Předpkladem bylo, že malá část polymerního konjugátu by mohla být směrována i aktiv- ně, jelikož lidské imunoglobuliny (autologního původu, nebo intravenózní imunoglobulin) mohou obsahovat i takové protilátky, které reagují s anti- geny exprimovanými na nádorových buňkách. Experimentální i klinické studie skutečně ukázaly, že samotný intravenózní imunoglobulin může mít protinádorový efekt. Konjugát byl testován v pilotní klinické studii v Praze u pacientek s gene- ralizovaným karcinomem mléčné žázy. Podobný konjugát s epirubicinem byl ale v už léčbě použit dříve, a to u jedné pacientky s generalizovaným angio- sarkomem v roce 1992. Klinická studie prokázala, že konjugát DoxAM-PHPMA-HuIg byl v v krev- ním oběhu stabilní, doba cirkulace byla významně prodloužena, a nebyl imu- nogenní. Nepozorovali jsme žádnou tvorbu protilátek proti konjugátu ani proti imunoglobulinu samotnému [31]. Podání konjugátu bylo velmi dobře snášeno i po opakovaném podávání (až 5 dávek) všemi pacientkami (dosud 9). Byla zaznamenána částečná klinická odpověď nebo stabilizace nemoci , a tento stav trval po dobu několika měsíců. Kvalita života se u pacientek v dů- sledku léčby významně zvýšila. Během léčby jsme monitorovali širokou paletu biochemických, hematolo- gických a imunologických parametrů. Hodoty řady nádorových markerů se posunuly k normálu nebo se úplně dostaly do normálního rozmezí. V průbě- hu léčby vzrostly počty CD4+, CD8+, a CD16+56+ buněk. Testovali jsme aktivitu přirozených zabíječů (NK) a lymfokiny-aktivova- ných zabíječských buněk (LAK). Jako cílové buňky byly použity K562 (citlivé vůči NK), Raji a Daudi (citlivé vůči LAK buňkám). Přizpůsobili jsme meto- du JAM testu [32] tak, abchom mohli detekovat NK a LAK aktivitu v malém vzorku nesrážlivé periferní krve. U několika pacientek jsme nalezli zvýšení NK a LAK aktivity v závislosti na aplikaci léčby, s maximem 3 dny po podání léčby. Tento nález svědčí pro aktivaci imunologických protinádorových me- chanismů [31]. Stimulační vliv konjugátu DoxAM-PHPMA-HuIg byl naznačen našimi dřívějšími výsledky, kterými jsme dokumentovali zvýšenou aktivitu NK ě ěj buněk u athymických myší s lidským metastazujícím kolorektálním karci- nomem SW 620 po podání 5 dávek nesměrovaného konjugátu DoxAM-PHP- MA (PK1; FCE28068) [33]. Myši léčené konjugátem PK1 měly zpomalený růst nádorů a prodloužené přežití ve srovnání s neléčenými kontrolami, ale léčbou nebylo možno dosáhnout úplného vyléčení. V pozdějších experi- ě ěj mentech jsme prokázali, že podmínkou úplného vyléčení je intaktní imu- nitní systém [34]. 10 Publikace: Říhová B., Strohalm J., Prausová J., Kubáčková K., Jelínková M., Rozpri- mová L., Šírová M., Plocová D., Etrych T., Šubr V., Mrkvan T., Kovář M., Ulbrich K. (2003) Cytostatic and immunomobilizing activities of polymer- bound drugs: experimental and clinical data J. Control. Rel. 91: 1-16 Říhová B., Strohalm J., Kubáčková K., Jelínková M., Hovorka, O., Kovář, M., Plocová, D., Šírová, M., Šťastný M., Rozprimová L., Ulbrich K. (2002) Acquired and specific immunological mechanisms co-responsible for efficacy of polymer-bound drugs. J. Control. Rel. 78: 97-114 IV. 2. Protinádorový efekt konjugátu DoxAM-PHPMA-HuIg u nádorového modelu EL4 lymfomu Abychom získali další údaje o protinádorové aktivitě konjugátu DoxAM- -PHPMA-HuIg, byla provedena podrobná studie s použitím několika my- ších nádorových modelů. Předpokládali jsme, že jako hlavní mechanis- mus se uplatní přímý cytotoxický vliv konjugátu na nádorové buňky, kte- rý je umožněn akumulací konjugátu v nádorové tkáni vlivem EPR efektu [5,30]. Konjugát DoxAM-PHPMA-HuIg měl in vitro jen mírný cytostatický vliv na nádorové buňky EL4. Nesměrovaný konjugát DoxAM-PHPMA (PK1; FCE28068) byl ještě méně aktivní. Volný Dox inhiboval buněčnou proliferaci při koncentraci o 3 řády nižší než byla koncentrace léčiva vázaného v konju- gátech (s obsahem HuIg nebo bez něj) [34]. Naopak, konjugát DoxAM-PHPMA-HuIg měl vysokou protinádorovou ak- tivitu při léčbě již rozvinutých nádorů EL4 u imunokompetentních myší kme- ne C57BL/6 (B/6; H-2b). U výzmaného počtu léčených myší lze dosáhnut úplného vyléčení v závislosti na dávce a režimu léčby. V následujících poku- sech jsme využili další syngenní nádorové modely, melanom B16-F10 (B/6; H-2b), B buněčný lymfom 38C13 (CšH/He, H-2y), a karcinom mléčné žlázy 4T1 (BALB/c, H-2d). Při léčbě B lymfomu 38C13 a mamárního karcinomu H-2d 4T1 byl protinádorový efekt konjugátu menší než u lymfomu EL4, ale přesto se část myší úplně vyléčila [35]. U melanomu B16-F10 bylo možno dosáhnout významně prodlouženého přežití v důsledku zpomalení růstu nádorů, ale ne- zaznamenali jsme úplné vyléčení [34]. Kompletní vyléčení nebylo nikdy možné u imunodeficitních nu/nu myší s nádorem EL4, nebo s jinou B buněčnou leukémií BCL1 [36]. Regrese ná- dorů po léčbě je závislá především na nádorově specifických CD8+ buňkách, jak jsme prokázali testem neutralizace nádorových buněk in vivo (Winnův test) [34]. 11 Po úplném vyléčení myší po léčbě konjgátem DoxAM-PHPMA-HuIg násle- duje vývoj dlouhodobé resistence proti danému nádoru, a to u významného počtu vyléčených jedinců. U těchto resistentních myší nevyrostou žádné ná- dory po podání další letální dávky stejných nádorových buněk, již bez léčby. Podíl resistentních jedinců je v obráceném poměru k efektu léčby prvního ná- doru [34]. Stejný vztah byl dokumentován také v případě, kdy byl lymfom EL4 vyléčen podáním konjugátu s pH-citlivou vazbou léčiva [37], i po léčbě nesměrovaným konjugátem DoxAM-PHPMA (PK1) [38]. Resistence byla do- kumentována také u dalších nádorových modelů, jako je leukémie BCL1 po léčbě konjugátem směrovaným specifickou protilátkou B1 [36], nebo u meta- stazujícího mamárního karcinomu 4T1 (Šírová, nepublikováno). Ukazujeme, že resistence je nádorově specifická [3], a její vývoj je závislý na dostatečně velkém kvantu nádorových antigenů [39]. Resistence byla vždy dokumento- vána jen u myší léčených konjugáty na bázi HPMA, které nepoškozují imu- nitní systém. Publikace: Šírová M. Strohalm J., Šubr V., Plocová D., Rossmann P., Mrkvan T., Ul- brich K., Říhová B. (2007) Treatment with HPMA copolymer-based doxo- rubicin conjugate containing human immunoglobulin induces long-lasting systemic anti-tumour immunity in mice. Cancer Immunol. Immunother. 56: 35-47 IV. 3. Preklinický vývoj polymerních terapeutik na bázi HPMA s pH-kontrolovanou vazbou Dox Biologické testy ukázaly zásadní rozdíl v mechanismu působení mezi kon- jugáty, kde je léčivo vázáno amidickou vazbou, a konjugáty s pH-závislou vazbou léčiva. pH-citlivá vazba zajištuje rychlé uvolnění léčiva při sníženém pH (5-6). Znamená to, že Dox může být uvolňován z polymerního nosiče do- konce extracelulárně v intersticiu nádoru (pH v nádorovém mikroprostředí je nižší než v mikroprostředí normálních tkání), ale především se uvolňuje intracelulárně v pozdních endozómech a lysozómech. Byla prokázána loka- lizace Dox do jádra po uvolnění z polymerního nosiče uvniř buněk [40,41]. Naopak bylo prokázáno, že uvolnění léčiva z polymeru nemusí představovat striktní podmínku aktivity konjugátů na bázi HPMA, kde léčivo ja navázáno amidickou vazbou [42-44]. Konjugáty s hydrazonovou vazbou léčiva prokázaly vysokou cytotoxickou aktivitu vůči řadě nádorových linií in vitro [24,45,29]. Významné je, že vysoká cytotoxicita byla nalezena i u linie buněk s nízkým počtem lysozómů [46]. Značná protinádorová aktivity byla dokumentována in vivo [24,47] u několika 12 nádorových modelů. Akumulace v nádoru, prodloužená doba cirkulace a T/B poměr (tumor-to blood) zvyšující se s časem svědčí pro to, že konjugát byl pasivně akumulován v nádoru EPR efektem. V první publikaci ukazujeme, že konjugát DoxHXD-PHPMA může induko- vat i úplné vyléčení již rozvinutých nádorů EL4 u významného podílu léče- ných myší. Jedna dávka konjugátu (75 mg Dox eq./kg) injikovaná mezi dny 8 a 10 po inokulaci nádorových buněk s.c. navodila kompletní vyléčení u všech myší., a zároveň nebyla zaznamenána žádná nežádoucí toxicita. Specifická protinádorová imunitní odpověď se vyvinula v závislosti na účinnosti léčby. I zde byl dokumentován stejný vztah mezi efektivitou léčby prvního nádoru a podílem resistentních jedinců. V druhé publikaci prezentujeme vliv modifikace konjugátu přidáním pozitivně nebo negativně nabitých skupin nebo hydrofobního substitu- entu (oleoyl) do postranních řetězců polymeru [48]. Záměrem bylo zís- kat konjugáty s větším hydrodynamickým poloměrem a proto také vyšší akumulaci v nádorové tkáni. Přítomnost nabitých skupin může způsobit zvětšení hydrodynamického poloměru tak, že konjugát „bobtná“ díky ele- krostatickým repulsním interakcím, nebo samovolným uspořádáním krat- ších polymerních řetězců do micel. Obsah nabitých skupin zavedených do polymeru (méně než 8 mol%) byl pravděpodobně příliš nízký na to, aby způsobil významné zvětšení hydrodynamického poloměru. Konjugát obsahující oleoylové skupiny tvořil stabilní micely s úzkou distribucí ve- likostí. Všechny tyto konjugáty při všech testovaných koncentracích měly postatně vyšší terapeutickou účinnost než volný Dox. Konjugát s negativně nabitými GFLG skupinami vykazoval mírně vyšší protinádorovou účinnost v modelu EL4 in vivo než nemodifikovaný konjugát DoxHXD-PHPMA. U konjugátu tvo- řícího micely (tj. u konjugátu s oleoylovými skupinami) se projevila nežádou- cí toxicita při podání vysoké dávky (1×25 mg Dox eq./kg), a ta byla patrná i při snížené dávce konjugátu (1×15 mg Dox eq./kg). Další série konjugátů obsahovala hydrofobní substituenty dodecylu, ole- oylu a cholesterylu [49]. Tyto konjugáty ve vodě tvořily micely nebo stabil- ní asociáty s velkým hydrodynamickým poloměrem (RH až 18 nm), a proto jsme mohli předpokládat lepší akumulaci do nádorové tkáně vlivem EPR efektu [5]. Konjugáty substituované cholesterylovými skupinami spontán- ně tvořily supramolekulární struktury s největším RH (9–18 nm). Takový konjugát měl vysoký protinádorový efekt i při snížených dávkách (1×10 a 1×5 mg Dox eq./kg). V důsledku léčby se u vyléčených jedinců vyvinula resistence proti nádoru stejně, jako to bylo pozorováno při léčbě lineárním , pozorov konjugátem DoxHXD-PHPMA. Účinnost konjugátu substituovaného chole- sterylovými skupinami byla vyšší než účinnost nesubstituovaného konju- 13 gátu, tento konjugát měl také pomalejší úbytek z krve (blood clearance) než lineární polymerní konjugát, a byla potvrzena i jeho vyšší akumulace v nádoru. Dále je popsán jiný konjugát na bázi HPMA, přizpůsobený ke zvýšené pa- sivní akumulaci do nádorové tkáně [50], tvořený polymerní kostrou kopoly- meru HPMA, která nese štěpy tvořené podobnými, ovšem semitelechelickými polymerními řetězci. Polymerní řetězce vážou Dox hydrazonovou vazbou. U tohoto konjugátu jsme prokázali zvýšenou akumulaci v tumoru, a také zvýše- nou účinnost in vivo při léčbě nádorů 38C13 a EL4. V poslední publikaci je popsáno preklinické hodnocení lineárních konju- gátů na bázi HPMA s pH-kontrolovaným uvolňováním Dox, s použitím my- ších modelů [51]. Testovali jsme konjugáty s různým obshem vázaného léči- va (Dox). Obsah vázaného léčiva je důležitý parametr ve vztahu k účinnosti léčby. Nejvyšší protinádorový efekt byl zaznamenán u konjugátů s obsahem léčiva kolem 10 wt%. Konjugáty s vyšším obsahem vázaného léčiva měly sní- ženou účinnost in vivo. Tato nízká účinnost konjugátů s vysokým obsahem vá- zaného léčiva (16-22 wt%) se dá vysvětlit nižší biologickou dostupností léčiva in vivo, která vyplývá z vyšší hydrofobicty konjugátu. Prokázali jsme také, že obsah volného Dox, který je pravidelně přítomen v preparátech (obvykle je nižší než 0,2 % celkového obsahu léčiva vázaného v konjugátu) se pohybuje ve zcela bezpečných mezích, protože obsah vol- ného Dox minimálně do 4,6 % neměl žádný vliv na účinnost léčby ani na projevy nespecifické toxicity. Tyto konjugáty indukovaly kompletní vyléčení léčených myší a následný vývoj resistence proti nádoru, stejně, jako to bylo prokázáno dříve. Ani při použití vysoké dávky konjugátu DoxHXD-PHPMA (75 mg Dox eq./kg) nebyla zaznamenána myelosuprese ani poškození orgá- nů. Publikace: Mrkvan T., Šírová M., Etrych T, Chytil P., Strohalm J., Plocová D., Ulbrich K., Říhová B. (2005) Chemotherapy based on HPMA copolymer conjugates with pH-controlled release of doxorubicin triggers anti-tumor immunity. J. Control. Rel. 110: 119-129 Chytil P., Etrych T., Koňák Č., Šírová M., Mrkvan T., Říhová B., Ulbrich K. (2006) Properties of copolymer-doxorubicin conjugates with pH-controlled activation. Effect of polymer chain modification. J. Control. Rel. 115: 26-36 Chytil P., Etrych T., Koňák Č., Šírová M., Mrkvan T., Bouček J. Říhová B., Ulbrich K. (2008) New HPMA copolymer-based drug carriers with covalently 14 bound hydrophobic substituents for solid tumour targeting. J. Control. Rel. 127: 121-130 Etrych T., Chytil P., Mrkvan T., Šírová M., Říhová B., Ulbrich K. (2008) Con- jugates of doxorubicin with graft HPMA copolymers for passive tumor tar- geting. J. Control. Rel. 132: 184-92 Šírová M., Mrkvan T., Etrych T., Chytil P., Rossmann P., Ibrahimová M., Kovář L., Ulbrich K., Říhová B. (2010) Preclinical evaluation of linear HPMA-doxorubicin conjugates with pH-sensitive drug release: anti-tumor efficacy, safety, and immunomodulating activity in murine model. Pharm. Res. 27: 200-208 IV. 4. Protinádorová aktivita polymerních proléčiv s pH-kontrolovaným uvolňováním léčiva, obsahujících paklitaxel nebo docetaxel Taxany, např. paklitaxel (PTX) a docetaxel (DTX), jsou moderní protinádo- rová léčiva s vysokou klinickou účinností při léčbě různých typů solidních nádorů i některých hematologických malignit. Hlavní překážkou jejich vyu- žití v praxi je velmi nízká rozpustnost ve vodě, a ovšem i systémová toxicita, která je víceméně typické pro nízkomolekulární protinádorová léčiva. Postup- ně bylo vyvinuto několik vysokomolekulárních systémů pro dopravu těchto léčiv, např. lipozómy, nanočástice, nebo polymerní proléčiva, kde je vyřešen problém nízké vodorozpustnosti [52,53]. Většina těchto systémů ale ukázala jen omezenou terapeutickou účinnost, nebo byl zaznamenán výskyt závaž- ných vedlejších účinků. Paklitaxel připravený ve formě nanočástic s vnějším obalem tvořeným albuminem je povolen pro léčbu metastazujícího karcino- mu mléčné žlázy pd názvem Abraxane (ABI-007) od roku 2006 [54]. Popisujeme syntézu, chrakterizaci a výsledky základního biologického tes- tování konjugátů obsahujících PTX nebo DTX. Protinádorová účinnost byla testována in vivo pomocí syngenních myších nádorových modelů T buněčné- ho lymfomu EL4 a mamárního karcinomu 4T1. Myší nádor 4T1 je považo- ván za vhodný model lidského karcinomu mléčné žlázy, a je charakterizován nízkou imunogenicitou a omezenou léčitelností. Podobně jako konjugáty na bázi HPMA s Dox navázaným pH-sensitivní vazbou, i konjugáty s PTX nebo DTX prokázaly vysokou protinádorovou účinnost in vivo. Jejich terapeutic- ký účinek převyšoval efekt dosažitelný podáním příslušného volného léčiva, a přitom nevykazoval závažnější systémovou toxicitu. Významné je, že konju- gáty s PTX a DTX indukovaly i kompletní regresi nádoru a vyvolávaly vývoj resistence proti nádoru, tedy ukazovaly stejné cenné vlastnosti typické pro konjugáty na bázi HPMA, které obsahují Dox. 15 V. ZÁVĔRY 1. Konjugát na bázi HPMA s navázaným doxorubicinem a autologním nebo lidským intravenózním imunoglobulinem byl testován při léčbě pacientek s generalizovaným karcinomem prsu, které nereagovaly na žádnou dostupnou konvenční léčbu. Podání konjugátu se vyznačovalo velmi dobrou snášenlivos- tí u všech pacientek. Značná část biochemických a imunologických markerů onemocnění, které před léčbou měly patologické hodnoty, vykázala po léčbě zlepšení směrem k normálním hodnotám. Bylo zaznamenáno zlepšení klinic- kého stavu pacientek, a kvalita života během léčby i po ní byla vysoká. Podání konjugátu DoxAM-PHPMA-HuIg pacientkám v klinické studii vedlo ke zvýšení aktivity NK a LAK v periferní krvi v závislosti na léčbě. Lidský in- travenózní imunoglobulin tak ukazuje použitelnost pro pasivní/aktivní smě- rování konjugátů na bázi HPMA při léčbě různých typů solidních nádorů. Zvýšená NK aktivita detekovaná v periferní krvi svědčí o aktivaci imunit- ních odpovědi proti nádoru v důsledku podání konjugátu DoxAM-PHPMA- -HuIg. 2. Konjugát DoxAM-PHPMA-HuIg prokázal významnou protinádorovou ak- tivitu u několika myších nádorových modelů. Konjugát indukuje kompletní regresi již dobře vyvinutých nádorů, v závislosti na dávce a léčebném režimu Předpokladem úplné regrese nádoru je funkční imunitní systém. U imuno- kompetentních myší se po léčbě vyvíjí dlouhodobá resistence proti nádoru. Vývoj resistence je ve vztahu k použité dávce léčiva a účinnosti léčby. Tato dvojí protinádorová aktivita, tj. přímý protinádorový efekt a vyývoj resisten- ce proti nádoru, je pravděpodobně nejdůležitější vlastností léčby konjugátem DoxAM-PHPMA-HuIg. Tento konjugát je potenciálně využitelný pro léčbu různých typů solidních nádorů. Léčba je účinná, bezpečná, nemá závažnější nežádoucí efekty typické pro nízkomolekulární protinádorové léky, a má pravděpodobně také imuno- modulační vliv, který příznivě ovlivňuje výsledek léčby. 3. Preklinické studie biologických vlastností polymerních konjugátů na bázi HPMA, s léčivem navázaným pH-sensitivní vazbou dokládají, že účinná polymerní proléčiva jsou výsledkem racionálních postupů při je- jich vývoji. Parametry, jako je obsah navázaného léčiva, Mw konjugátu, substituce postranních řetězců různými skupinami a stabilita vazby kterou je léčivo připojeno k polymerní kostře jsou klíčové a určují fyzikálně che- mické parametry, a následně i biologickou aktivitu daného konjugátu. Re- lativně jednoduchá syntéza konjugátu DoxHYD-PHPMA a jeho významná terapeutická bezpečnost, účinnost, a schopnost indukovat úplné vyléčení již vyvinutých nádorů činí z tohoto konjugátu slibného kandidáta pro kli- nické testování. 16 4. Navázání hydrofobních léčiv PTX a DTX na polymerní nosič na bázi HPMA přes hydrazonovou a pH-závislou vazbu vedlo k získání polymerních proléčiv s vynikající rozpustností ve vodě a vodných roztocích. Tyto konjugá- ty mají přesvědčivou protinádorovou aktivitu u myších nádorových modelů a indukovaly úplnou regresi plně rozvinutých nádorů lymfomu EL4 a ma- márního karcinomu 4T1. U obou modelů jsme prokázali vývoj protinádorové resistence, závislý na předešlé léčbě. Výsledky demonstrují vysokou účinnost, bezpečnost, a imunomodulační kapacitu již dříve prokázanou u různých typů konjugátů na bázi HPMA s na- vázaným Dox jakožto bioaktivním léčivem. To opět poukazuje na potenciální vynikajíci použitelnost konjugátů na bázi HPMA při léčbě solidních nádorů. 17
Abstract v angličtině:
I. INTRODUCTION Cancer is a serious health problem worldwide. In economically developed countries, it is a second most frequent cause of death after cardiovascular dis- eases, and the number of oncological patients continuously increases with the increasing age of population. The mainstay of cancer therapy is combination of surgery, radiation and chemotherapy. Whilst surgery and radiation are relatively precise and suitable to achieve a local control over the tumor, chemotherapy exerts a systemic ef- fect. These three modalities, when properly combined and sequenced, can cure a substantial number of hematological cancers and a smaller, but still significant subset of various solid tumors. Most cytostatic/cytotoxic drugs that are now in common use target the cells with high proliferation rate. The non-selective character of chemotherapy leads to increased toxicities towards normal rapidly proliferating cells. This means that the drugs have to be used at suboptimal doses, leading to development of (multi)drug resistance, metastatic disease and, eventually, to failure of the therapy. Innovative therapeutic strategies need to be developed in order to achieve better treatment outcome. For that purpose, several approaches are be- ing applied. First, sophisticated genomic and proteomic research could identify appropriate tumor-specific molecular targets. Second, drug delivery systems (DDS) are being designed to bring the drug more precisely to the desired tis- sues and cells, and keep them away from the sites of potential damage, and/or to maintain the therapeutic concentration of the drug at the relevant sites for longer periods of time. Third, great effort is devoted to elaborate immune-based therapeutic strategies, harnessing the host anti-cancer immune responses. . I. 1. Targeted therapy of cancer Targeted therapy is a term concerning with treatment strategies exploiting either molecular differences between cancer and normal cells („molecular tar- gets“), or differences between healthy and cancer-associated tissues. The tar- geted therapies include several types of agents and strategies: (a) small mol- ecules blocking enzymes specifically acting in cancer cells, (b) ligand-targeted therapies, and (c) high-molecular-weight (HMW) drug delivery systems. I. 2. Low-molecular weight anticancer drugs A representative of this class of drugs is imatinib mesylate (Gleevec/Glivec), a se- lective competitive inhibitor of BCR-ABL tyrosine kinase, which is constitutively active in chromic myeloid leukemia (CML) cells. The clinical use of imatinib sig- nificantly improved therapeutic outcome in patients with CML, as most of them (90 %) achieve a complete hematological remission [1]. However, mutations in 18 the BCR-ABL gene still occur in some patients, so that the tyrosine kinase is no longer being able to bind imatinib. New generation of inhibitors was developed; e.g. nilotinib and dasatinib are able to bind at least some of the mutated variants of the tyrosine kinase, and show improved clinical efficacy [2]. Other LMW agents target epidermal growth factor receptor (EGFR fam- ily), such as gefitinib, and erlotinib, both inhibiting the tyrosine-kinase active site of EGFR/ErbB1/Her1. Lapatinib is a dual inhibitor of EGFR/ErbB1/ Her1 and ErbB2/Her2/Neu. Unfortunately, in most cancers there are multiple abnormalities that should be targeted to achieve a clinically relevant therapeutic effect. It is extremely unlikely that drugs (such as imatinib mesylate) targeting a single (cancer-spe- cific) gene product will be active against a major fraction of tumors. I. 3. Ligand-targeted therapies The ligand-targeted therapy or active targeting relies on differences in ex- pression of the targeted molecules between cancer and normal cells. The lig- and or antibody (i.e. targeting moiety) specifically binds the relevant struc- ture on the cancer cell. Thus, ligand-targeted therapies could be a successful means of improving selective effect of anti-cancer drugs. Antibodies were the first targeting moieties utilized for these therapies, but other proteins, lectins, peptides, or aptamers are used as well. I. 3. 1. ANTIBODIES A high number of antibodies specific either to “tumor-specific” antigens (ex- pressed solely on cancer cells) or to “tumor-associated” antigens (normal cel- lular constituents that could be overexpressed or their expression is deregu- lated in cancer cells) was generated since monoclonal antibodies (mAb) were described by Köhler and Milstein [3]. Initial problems with immunogenicity of the murine mAbs in human patients (namely formation of human anti-mouse antibodies, HAMA), and limited abil- ity of the murine mAbs to trigger Ab-dependent effector functions (such as antibody-dependent cellular cytotoxicity, ATCC, and complement-dependent cytotoxicity, CTC) were virtually solved by invention of chimeric, humanized, or fully human Abs [4]. More than 20 therapeutic antibodies are now approved for treatment, many of them for malignant diseases. Rituximab (anti-CD20), trastuzumab (anti-ErbB2/Her2/Neu), cetuximab (anti-), or bevacizumab (anti- VEGF) could be named as examples. An added advantage of using therapeutic mAb is a possible synergy between the antibody and chemotherapeutic agents, so that the cancer cells could be targeted in two independent ways. Abs reacting with tumor-associated molecules could be conjugated or fused on the DNA level with a range of molecules to introduce additional functions. 19 These “armed” antibodies could show better therapeutic performances than their “naked” counterparts. • Immunotoxins are conjugates composed of extremely potent toxins or toxin subunits linked to an internalizing antibody or other ligand (e.g. cytokine). • Ab-drug conjugates (immunoconjugates) use (more potent) drugs that are bound to the Ab or Ab fragment • Radioimmunotherapy employs conjugates of Ab with appropriate radionu- clide to kill the target cells by radiation. • Antibody-directed enzyme-prodrug therapy (ADEPT) is a two-step ap- proach, in which an Ab-enzyme conjugate is first applied to localize the en- zyme in the tumor, and LMW prodrug is then administered that is converted to an active drug by the activity of the targeted enzyme. I. 4. High-molecular-weight delivery systems These drug delivery systems are based on biochemical and physiological dif- ferences between tumor and normal tissue. Various delivery systems for con- ventional LMW cytotoxic drugs are being developed and tested. They either physically entrap their drug payload, or (more typically) the drug is cova- lently bound to a HMW carrier. HMW delivery devices passively accumulate in the solid tumor tissue due to Enhanced Permeability and Retention (EPR) effect described by Matsumu- ra and Maeda [5]. Tumor vasculature is more permeable for macromolecules than that in normal tissues. Moreover, there is very restricted or almost absent lymphatic drainage in the tumors. Thus, macromolecules can easily enter the interstitial space and accumulate there, because they are not dissipated by the defective lymphatic drainage. The EPR effect is molecular weight (Mw) and size-dependent. I. 4. 1. NANOSIZED DEVICES FOR PASSIVE DRUG TARGETING A number of different HMW delivery strategies were developed, exploring ei- ther colloidal delivery vehicles, or water-soluble polymers as the drug carriers. The most frequently used nanosized delivery devices are dendrimers, liposo- mes, emulsions and solid lipid nanospheres, micelles and other self-assembling nanoparticles, and polymer nanoparticles. I. 4. 2. WATER-SOLUBLE POLYMERS AS CARRIERS FOR ANTI-CANCER DRUGS The conjugation of the drug to a HMW polymer carrier may offer several advantages: • Provides water-solubility to the drug, even if the drug has a highly hydro- phobic character. Therefore, better availability and a proper distribution is guaranteed 20 • Protects the drug at least temporarily from binding to serum proteins, en- zymatic cleavage or scavenging processes. As a result, serum half-life and bio- availability of the drug are greatly extended, whilst renal clearance is mini- mized due to high Mw of the conjugate • Polymer conjugates passively accumulate in the solid tumor tissue by EPR effect. Moreover, a targeting moiety could be incorporated into the conjugate that specifically binds the recognized molecule on the target cell. • The conjugation significantly affects the whole body pharmacokinetics, re- sulting in better targeting of the conjugate to the desired site (tumor) and reduced access to normal tissues. This limits the systemic toxicity of the par- ent LMW drug. • Drug conjugation also changes the fate of the drug at the cellular level. Many LMW drugs enter the cells rapidly (within minutes) by passage across the plasma membrane. The polymer conjugates are usually taken into cells more slowly by facilitated endocytic route [6]. The endocytosis of the drug at least partially bypasses the P-glycoprotein-mediated drug efflux what results in overcoming the (multi)drug resistance. For the conjugation of drugs, both naturally occurring and synthetic pol- ymers are utilized. The synthetic polymers offer some advantages over the biopolymers, such as tuneable composition and structure, possibility to in- troduce various functional groups to enable conjugation of drugs, and low or virtually absent immunogenicity. The concept of using polymers as drug carriers was suggested already by Ringsdorf in 1975 [7]. A number of polymers were studied since then, carry- ing either proteins, or LMW cytotoxic drugs. I. 4. 2. 1. Polymer-protein conjugates Two main types of conjugates fall into this category: Pegylated proteins, and SMANCS. •Pegylated proteins: The principle of conjugation of a protein with poly(ethylene glycol) (PEG) was proposed by Davis and Abuchowski in 1977 [8] since termed „pegylation“. The conjugation of a protein with PEG (a) increases solubility and stability of the protein, and reduces its immunogenicity and antigenicity (b) prevents the rapid renal clearance of smaller proteins and receptor-mediated clearance of larger proteins by reticuloendothelial system, and (c) prolongs the plasma half-life. PEG itself is non-toxic and non-immunogenic. Pegylation was applied to different peptides and proteins, namely enzymes or cytokines, and several are used in clinical practice (e.g. adenosine deaminase, L-asparaginase, interferons, erythropoietin, and colony-stimulating factors). • SMANCS is a conjugate of neocarzinostatin (NCS), and poly(styrene-co- -maleic acid) (SMA), named SMANCS [9,10]. Mw of SMANCS is 16 kDa, 21 but it binds non-covalently to albumin, thus in vivo behaves like a large protein of about 80 kDa. Compared to NCS, the conjugate showed several consider- able pharmacological advantages, namely extension of biological half-life, en- hanced tropism for tumor tissue, and decreased toxic side effects. SMANCS was approved in Japan for treatment of hepatocellular carcinoma [11]. I. 4. 2. 2. Polymer-drug conjugates As with other HMW delivery systems, the clinical aim of polymer-drug con- jugates is to achieve (a) improved drug targeting to the tumor tissue, (b) re- duction of the unwanted toxicity by limiting access of the drug to the sites of toxicity, and (c) overcoming the mechanisms leading to drug resistance. Most of these conjugates studied so far trade on anti-cancer drugs routinely used in clinical practice. Various types of polymers were tested, some of them are already approved for clinical use: PGA, poloxamer-188, poly(lactide-co- -glycolide), PLGA). I. 5. HPMA copolymer-bound drugs N N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide (HPMA) is one of the most studied syn- thetic polymers used as drug carrier. The HPMA homopolymer was devel- oped at the institute of Macromolecular Chemistry by Kopeček and co-work- ers [12,13]. Further development led to introduction of functional groups to the homopolymer, in order to enable conjugation of various drugs and later also targeting moieties [14]. GlyPheLeuGly (GFLG) spacer was designed to release the drug only intracellularly by the action of lysosomal proteases [15,16]. Preclinical tests proved biocompatibility of the HPMA homopolymer and copolymer (PHPMA), no inherent toxicity and absence of immunogenicity [17]. Similarly to PEG, binding of proteins to HPMA copolymer decreases the immunogenicity of the protein [18,19]. Studying of bio- and immunocom- patibility of the HPMA-based conjugates has been associated with the name of B. Říhová since the very beginning – for review see [20]. The HPMA copolymer conjugates incorporated a number of LMW anti- cancer agents, such as chlorin e6, ellipticin derivative, puromycin, wortmanin, geldanamycin, camptothecin, methotrexate and its derivatives, paclitaxel, 5- flourouracil, TNP-470, cyclosporin A, platinates, and several anthracyclines: epirubicin, daunorubicin, and doxorubicin. The HPMA copolymer conjugates were prepared binding the drug either via enzymatically-cleavable bond [21,22], or via a pH-sensitive linkage [23,24]. Both types of conjugates are passively accumulated in solid tumor tissue by the EPR effect. Targeted HPMA copolymer conjugates were prepared, both binding the drug via amide bond, or via a hydrazone (pH-sensitive) linkage. 22 I. 5. 1. NON-TARGETED HPMA COPOLYMER CONJUGATES The first conjugate in this class was a conjugate containing doxorubicin (Dox) bound via the enzymatically-cleavable bond through the GFLG linker (DoxAM- (Dox PHPMA, also named PK1; FCE28068) [22]. The conjugate entered the clinical trial phase I in 1994 [25] and later on proceeded to phase II [26]. Its passive accu- mulation by EPR effect was documented [27], and some clinical activity in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC), colorectal, and breast carcinoma. HPMA copolymer conjugates containing other drugs, such as paclitaxel, camptothecin, or platinates, were also tested in clinical trials. I. 5. 2. TARGETED HPMA COPOLYMER CONJUGATES HPMA-based copolymer conjugates have been specifically targeted by several targeting moieties, such as galactosamine, other ligands binding to the tumor cells (such as transferrin or folate), antibodies, and peptides. Galactosamine-targeted conjugate entered the clinical trials phase I/II (also called PK2; FCE28069) as treatment for hepatocellular carcinoma (galactos- amine binds to asialoglycoprotein receptor that is overexpressed on cancer cells, but is present also on normal hepatocytes). Higher accumulation of the conju- gate in the tumor was not seen, and further clinical trials were abandoned. II. AIMS OF THE STUDY General aim of the study was to contribute to the development of HPMA- based polymer prodrugs for cancer treatment. This was divided into several specific aims and steps: 1. To contribute to the pilot clinical study in patients suffering from general- ized breast cancer by testing of cytotoxic activity of natural killer cells 2. To examine anti-tumor efficacy of the DoxAM-PHPMA conjugate contain- ing human immunoglobulin (DoxAM-PHPMA-HuIg), that was designed for the pilot clinical study, in an experimental murine tumor model 3. To contribute to the preclinical development of the DoxHYD-PHPMA copol- ymer conjugate with pH-controlled release of the drug, namely to determine correlations between physico-chemical parameters and in vivo anti-tumor ef- ficacy of the DoxHYD-PHPMA conjugates 4. To evaluate in vivo anti-tumor efficacy of HPMA-based polymer prodrugs with pH-controlled activation containing paclitaxel and docetaxel III. METHODS All the studied conjugates were synthesized at the Institute of Macromolecu- lar Chemistry, ASCR, v.v.i. , Laboratory of Biomedicinal Polymers. 23 The synthesis and characterization of the HPMA copolymer conjugates was described in several papers: for review see [28,29]. New types of HPMA-based conjugates containing paclitaxel (PTX) and docetaxel (DTX) as the bioactive agent are described in the last paper – thesis section III. 4. Testing of anti-cancer effects of the HPMA copolymer conjugates was per- formed using syngeneic murine models of transplantable tumors. EL4 T cell lymphoma (C57BL/6, H-2b; both male and female mice), 4T1 mammary car- cinoma (BALB/c, H-2d; female mice), 38C13 B cell lymphoma (C3H/He, H- 2y; female mice) and BCL1 leukemia. (BALB/c, H-2d; female mice). The pilot clinical study was performed starting 2000 in Prague, Faculty Hospital Motol. The patients signed an informed consent. Testing of the bio- chemical, hematological, and immunological markers during the treatment was done by an authorized laboratory, (Agilab, Prague.) All methods in detail are described in the original papers which are part of the thesis. IV. RESULTS AND DISCUSSION IV. 1. Activation of immune mechanisms in patients treated with HPMA copolymer-bound doxorubicin conjugate containing human intravenous immunoglobulin A conjugate consisting of a linear HPMA-based polymer backbone, to which drug (Dox) and human immunoglobulin (HuIg) are bound via a tetrapeptide GFLG linker (DoxAM-PHPMA-HuIg), has been designed with the aim of using in hu- (Dox man patients. The conjugate has high Mw (usually 500 to 1000 kDa) and thus it is passively targeted to solid tumors by EPR effect [5,30]. As an assumption, a small fraction of the conjugate could potentially be actively targeted, because the pool of human immunoglobulins (either autologous or human intravenous immunoglobulin) could contain antibodies reacting with antigens expressed on tumor cells. Experimental and clinical studies demonstrated that the intravenous immunoglobulin itself can exert beneficial therapeutic effect in cancer treatment. The conjugate has been tested in a pilot clinical trial in Prague in patients with generalized breast cancer. However, similar HPMA-based conjugate con- taining epirubicin and autologous immunoglobulin was tested in a patient suf- fering from generalized angiosarcoma already in 1992. The clinical study proved that the DoxAM-PHPMA-HuIg conjugate was stable during the circulation in the bloodstream, showed significantly pro- longed circulation time, and was non-immunogenic. No antibody formation reacting with the conjugate of with the immunoglobulin itself [31] was ob- served. The administration of the conjugate was well tolerated even at repeat- ed administrations (up to 5 doses) in all patients (9 so far). Partial clinical re- 24 sponse or stabilization of the disease lasting for months was recorded. Quality of life in all the patients considerably improved as a result of the treatment. A broad array of hematological, biochemical and immunological parame- ters was monitored. Many tumor-related markers normalized during the treat- ment, and others improved. Increase in CD4+, CD8+, CD16+56+ cell numbers was recorded during the treatment course. NK and lymphokine-activated killer (LAK) activity was tested using a func- tional cytotoxic assay, with K562 (NK sensitive), Raji and Daudi (LAK sensi- tive) cells as targets. We adopted the JAM test [32] in order to detect the NK and LAK activity in a small sample of full peripheral blood. Increase of NK and LAK activity triggered by the Dox-HPMAAM-HuIg administration was Dox-HPMA detected in several patients, peaking on day 3 following the treatment. The finding is suggestive of activation of anti-cancer immune mechanisms [31]. The stimulatory effect of the DoxAM-PHPMA-HuIg conjugate was marked by Dox our previous finding that NK activity increased in athymic nude mice bearing hu- man metastatic colorectal carcinoma SW 620 following 5 doses of non-targeted Dox DoxAM-PHPMA (PK1, FCE 28068) conjugate [33]. The PK1-treated mice had moderately retarded tumor growth and prolonged survival time relative to un- treated controls, but the treatment obviously could not lead to a complete cure. In our later experiments with DoxAM-PHPMA-HuIg conjugate, we documented Dox the necessity of the intact immune system for complete tumor regression [34]. Publications: Říhová B., Strohalm J., Prausová J., Kubáčková K., Jelínková M., Rozpri- mová L., Šírová M., Plocová D., Etrych T., Šubr V., Mrkvan T., Kovář M., Ulbrich K. (2003) Cytostatic and immunomobilizing activities of polymer- bound drugs: experimental and clinical data J. Control. Rel. 91: 1-16 Říhová B., Strohalm J., Kubáčková K., Jelínková M., Hovorka, O., Kovář, M., Plocová, D., Šírová, M., Šťastný M., Rozprimová L., Ulbrich K. (2002) Acquired and specific immunological mechanisms co-responsible for efficacy of polymer-bound drugs. J. Control. Rel. 78: 97-114 IV. 2. Anti-cancer effect of DoxAM-PHPMA-HuIg conjugate in a model of murine T cell lymphoma In order to obtain additional data on anti-cancer activity of the DoxAM-PHP- MA-HuIg conjugate, extensive investigation using several murine models was performed. We assumed that the main mechanism is a direct cytotoxic effect of the conjugate against cancer cells, facilitated by passive accumulation of the drug in the solid tumor due to the EPR effect [5,30]. 25 In vitro, only a moderate cytostatic effect of the DoxAM-PHPMA-HuIg was detected upon in EL4 lymphoma cells. Non-targeted conjugate DoxAM- PHPMA (PK1, FCE 28068) was rather less effective than the HuIg-contain- ing conjugate. Free Dox inhibited the cell proliferation at a 3 orders lower concentration than the PHPMA conjugates, both with or without HuIg [34]. In contrast, the DoxAM-PHPMA-HuIg conjugate proved to be highly effective in Dox treating established EL4 tumors in immunocompetent C57BL/6 (B/6; H-2b) mice. A complete cure of EL4 tumors of was achieved in a substantial number of animals, depending on the dose and treatment regime. Further experiments exploring other murine syngeneic tumors, such as B16-F10 melanoma (B/6 mice; H-2b), 38C13 B cell lymphoma (C3H/N mice; H-2k), and 4T1 mammary carcinoma (Balb/c mice; H-2d) showed various efficacy of the DoxAM-PHPMA-HuIg conjugate. In 38C13 B Dox cell lymphoma and 4T1 mammary carcinoma, the efficacy was less prominent than in EL4 lymphoma, but we also achieved some complete tumor regressions [35]. A significant prolongation of survival time due to reduction of the tumor growth was found in B16-F10 melanoma, but no complete cure was recorded [34]. Complete cure was never seen in immunodeficient nude mice bearing EL4 lymphoma [34], or BCL1 leukemia [36]. The treatment-related tumor regres- sion largely depends on the CD8+ tumor-specific T cells, as was shown by in vivo tumor neutralization (Winn’s assay) [34]. The complete cure of mice induced by the DoxAM-PHPMA-HuIg treatment Dox is followed by development of long-term anti-tumor resistance in a significant proportion of the survivors. The resistant mice do not develop any tumor upon second challenge with a lethal dose of the same tumor cells without any therapy. The proportion of resistant animals inversely reflects the efficacy of the treat- ment [34]. The same relationship was documented when the EL4-bearing mice were treated with Dox conjugate with pH-controlled release of the drug [37], or with non-targeted DoxAM-PHPMA (PK1) conjugate [38]. The resistance was Dox also documented in other murine tumor models, such as BCL1 leukemia model using treatment with B1 mAb-targeted conjugate [36] and in mice cured from metastatic breast carcinoma 4T1 (Šírová, unpublished data). We show that the resistance is tumor-specific [34], and its development depends on the sufficient quantity of tumor-derived antigens [39]. The resistance was only documented in mice treated with PHPMA conjugates that do not impair the immune system. Publication: Šírová M. Strohalm J., Šubr V., Plocová D., Rossmann P., Mrkvan T., Ulbrich K., Říhová B. (2007) Treatment with HPMA copolymer-based doxorubicin conjugate containing human immunoglobulin induces long-lasting systemic anti-tumour immunity in mice. Cancer Immunol. Immunother. 56: 35-47 26 IV. 3. Preclinical development of HPMA-based polymer therapeutics with pH-controlled release of Dox Biological examinations showed striking differences in the sense of mecha- nisms of action when compared with conjugates binding the drug via amide bond. The pH-sensitive bond ensures fast release of the drug at low pH (pH 5-6). It means that Dox could be released from the polymer even extracellu- larly in the tumor interstitium (pH in the tumor microenvironment is lower than that in normal tissues), but release of the drug occurs predominantly intracellularly in late endosomes and lysosomes. It was proved that free Dox localized to nuclei. [40,41]. On the contrary, the release of the drug from the polymer backbone may not be a strict requirement in the HPMA copolymer conjugate in which the drug is bound via amide bond [42-44]. The conjugate with the hydrazone bond proved remarkably high cytotoxic- ity in a panel of tumor cell lines in vitro [24,45,29], importantly including those with limited content of lysosomes [46]. Considerable ant-tumor activity was demonstrated in vivo [24,47] in several murine models. Accumulation in tumor, prolonged circulation time and tumor-to-blood (T/B) ratio increasing with time imply that the conjugate passively accumulates in tumor by EPR effect. In the first paper, we have shown that the DoxHYD-PHPMA conjugate could induce even a complete eradication of established EL4 lymphoma tumors in a significant proportion of mice. A single dose of 75 mg Dox eq./kg injected between days 8 – 10 post tumor inoculation could induce a complete tumor regression in all the treated mice, and no side toxicity was recorded. Specific anti-cancer immune response (anti-tumor resistance) evolved in relation to the therapy. Again, we documented the inverse relationship between the tu- mor treatment efficacy and development of tumor resistance. In the second publication, modification by adding positively or negatively charged chemical groups or a hydrophobic substituent (oleoyl group) to the side chains of the polymer is described [48]. The aim was to achieve conju- gates with higher hydrodynamic radii and thus higher accumulation in the tumor tissue. The presence of charged groups could cause an increase of the hydrodynamic radius either by swelling of conjugate coils due to electrostatic repulsions or by self-assembly of shorter polymers into polymer micelles. The introduction of the charged groups (less than ~ 8 mol %) was probably too small to significantly increase the hydrodynamic radius, whilst the conjugate containing the oleoyl groups formed stable micelles with a narrow size distri- bution. All the conjugates demonstrated significantly higher therapeutic efficacy than free Dox at any dosage tested. The conjugate containing negatively charged GFLG sequences had moderately better anti-tumor activity in vivo in the EL4 lymphoma model than the unmodified DoxHYD-PHPMA conjugate. 27 Side toxicity was seen in the conjugate forming micelles (i.e. conjugate con- taining oleoyl groups) at a high dose (2×25 mg Dox eq./kg), and was still ap- parent at a low dose (1×15 mg Dox eq./kg). Another series of conjugates was prepared containing hydropho- bic substituents, such as dodecyl, oleoyl, and cholesteryl [49]. The conjugated formed micelles or stable associates with high hydrody- namic radii (RH up to18 nm) in water, thus improved passive accu- mulation due to the EPR effect was supposed [5]. Conjugates substi- tuted with cholesteryl groups formed self-assembling supramolecular structures with the highest RH (9–18 nm). High anti-tumor effect was produced by the conjugate bearing cholesteryl groups even at low- er dosages (1×10 and 2×5 mg Dox eq./kg). Tumor resistance devel- oped in the cured mice similarly as was previously shown in the linear DoxHYD-PHPMA conjugate. The efficacy of the cholesteryl-substituted conjugate was higher than that of the DoxHYD-PHPMA conjugate without substitution, the conjugate had slower blood clearance than the linear one, and also showed increased accumulation than the linear conjugate. Another HPMA copolymer suitable for enhanced passive accumulation in tumor is described [50], formed by HPMA copolymer backbone grafted with similar but semitelechelic HPMA copolymer chains. The copolymer chains bind Dox via the pH-sensitive hydrazone bond. Accentuated accumulation by EPR effect was shown in this conjugate, as well as increased in vivo anti- tumor efficacy in 38C13 B cell lymphoma and EL4 T cell lymphoma models. In the last publication, preclinical evaluation of the linear HPMA-based copolymer conjugate with pH sensitive release of Dox in murine models is described [51]. We have tested conjugates with different content of the bound drug (Dox). It is an important parameter in in relation to the efficacy of the treatment. The best anti-tumor effects were produced with the conjugates containing ~ 10 wt% of the bound Dox. The conjugates with higher drug con- tent showed decreased in vivo efficacy. The low in vivo efficacy of conjugates with the high drug amount (16–22 wt%) could be explained by lower in vivo biavailability of the drug, resulting from the more hydrophobic character of the conjugate. We also showed that free doxorubicin, that is regularly present in the conjugate preparations (usually less than 0.2 wt% relative to total drug content) is by far safe, and content of the free dug up to 4.6 % had no impact on the efficacy of the treatment and acute toxicity. Indeed, the conjugates induced complete cure of the treated animals, followed by in- ductin of anti-tumor resistance. No myelosuppression or organ damage was observed even at high dose of the DoxHYD-PHPMA- conjugate (75 mg Dox eq./kg). 28 Publications: Mrkvan T., Šírová M., Etrych T, Chytil P., Strohalm J., Plocová D., Ulbrich K., Říhová B. (2005) Chemotherapy based on HPMA copolymer conjugates with pH-controlled release of doxorubicin triggers anti-tumor immunity. J. Control. Rel. 110: 119-129 Chytil P., Etrych T., Koňák Č., Šírová M., Mrkvan T., Říhová B., Ulbrich K. (2006) Properties of copolymer-doxorubicin conjugates with pH-controlled activation. Effect of polymer chain modification. J. Control. Rel. 115: 26-36 Chytil P., Etrych T., Koňák Č., Šírová M., Mrkvan T., Bouček J. Říhová B., Ulbrich K. (2008) New HPMA copolymer-based drug carriers with covalently bound hydrophobic substituents for solid tumour targeting. J. Control. Rel. 127: 121-130 Etrych T., Chytil P., Mrkvan T., Šírová M., Říhová B., Ulbrich K. (2008) Con- jugates of doxorubicin with graft HPMA copolymers for passive tumor tar- geting. J. Control. Rel. 132: 184-92 Šírová M., Mrkvan T., Etrych T., Chytil P., Rossmann P., Ibrahimová M., Kovář L., Ulbrich K., Říhová B. (2010) Preclinical evaluation of linear HPMA-doxo- rubicin conjugates with pH-sensitive drug release: anti-tumor efficacy, safety, and immunomodulating activity in murine model. Pharm. Res. 27: 200-208 IV. 4. Anti-cancer activity of polymer prodrugs with pH-controlled drug release, containing paclitaxel or docetaxel Taxanes, such as paclitaxel PTX) and docetaxel (DTX) are modern anti-can- cer agents that demonstrated their clinical efficacy in the treatment of various solid tumors and some hematological malignancies. The main drawback in their practical utility is their very low water solubility, and, indeed, systemic toxicity that is otherwise typical for LMW anti-cancer drugs. Several HMW delivery systems developed over time, such as liposomes, nanoparticles, or polymer prodrugs, overcome the problem of low water solubility [52,53]. However, most of these formulations showed limited anti-cancer efficacy or induced serious side effects. Paclitaxel prepared in the form of nanoparticles with albumin outer shell received its approval for treatment of metastatic breast cancer as Abraxane (ABI-007) in 2006 [54]. We describe synthesis, characterization and results of preliminary biologi- cal testing of conjugates containing PTX or DTX. The anti-cancer efficacy was 29 tested in two syngeneic tumor models: EL4 lymphoma, and 4T1 mammary carcinoma. The 4T1 model is considered a model of human breast cancer dis- ease, characterized by low immunogenicity and modest curability. Similarly as HPMA copolymer conjugates with Dox bound via pH-sensitive bond, the conjugates containing PTX or DTX demonstrated significant anti-tumor ac- tivity in vivo. Their treatment effect highly out-performed that attainable with the free drug. Moreover, no side toxicity was recorded. Most notably, PTX and DTX-containing conjugates induced complete tumor regression together with development of anti-tumor resistance, the valuable characteristic of Dox- containing HPMA-based conjugates. V. CONCLUSIONS 1. We used HPMA copolymer-bound doxorubicin conjugate containing au- tologous or human intravenous immunoglobulin for treatment of patients with generalized breast cancer, who were refractory to conventional treatment. The administration of the conjugate was well tolerated in all the patients. A considerable proportion of biochemical and immunological markers having pathological values before the treatment normalized or improved as a result of the therapy. Clinical improvement was recorded, and quality of life of all the treated patients was very good. Administration of DoxAM-PHPMA-HuIg conjugate to the patients led to treatment-dependent increase in NK and LAK activity in peripheral blood. Human intravenous immunoglobulin proved its applicability for passive/ac- tive targeting of the HPMA-based copolymer conjugate in human patients for treatment of solid tumors. Enhancement of the NK activity detected in peripheral blood supports the possibility of activation of anti-tumor immune responses induced by the treat- ment with DoxAM-PHPMA-HuIg. 2. DoxAM-PHPMA-HuIg conjugate exerts substantial anti-tumor effect in sever- Dox al murine tumor models. The conjugate can induce a complete tumor regression of established solid tumors, depending on the treatment dose, and regime. An intact immune system is a prerequisite for the complete tumor regression. Long- term tumor-specific resistance develops in immunocompetent mice, which is related to the treatment dose and efficacy. This dual anti-cancer activity, i.e. the direct anti-cancer efficacy together with the induction of tumor resistance, is probably the most important feature of the DoxAM-PHPMA-HuIg treatment. Dox The conjugate represents a potential cancer treatment for a variety of solid tumors. It is effective, safe, devoid of most side effects characteristic for LMW cytotoxic drugs, and endowed by immunomodulatory effects further enhanc- ing its activity. 30 3. The preclinical study of biological characteristics of HPMA copolymer conjugates with the drug bound via pH-sensitive bond illustrates that efficient polymer conjugates are products of a rational design. Parameters such as con- tent of the bound drug, Mw of the conjugate, substitution of side chains by various substituents, and the structure and stability of the bond that binds the drug to the polymer backbone are key parameters determining the physico- chemical characteristics, and subsequently biological activity of the conjugate. A relatively simple synthesis of the linear DoxHYD-PHPMA conjugate and its remarkable therapeutic safety, efficacy, and ability to induce a complete tumor regression of established tumors made the conjugate a promising candidate for clinical trials. 4. Binding of hydrophobic agents such as PTX and DTX to HPMA- based polymer backbone via pH-sensitive hydrazone bond produced conjugates with excellent water solubility. These conjugates showed con- vincing anti-tumor capacity in murine models and induced a complete regression of established EL4 lymphoma or 4T1 mammary carcinoma tumors. The treatment-related tumor resistance developed in a signifi- cant proportion of the cured animals both in EL4 lymphoma and 4T1 carcinoma. The results substantiate the remarkable safety, effectiveness, and immu- nomodulatory capacity previously demonstrated in several HPMA-based conjugates containing Dox as the bioactive agent. This again points to the high prospective clinical applicability of the HPMA copolymer conjugates in treatment of solid tumors. VI. POUŽITÁ LITERATURA / REFERENCES 1. Druker BJ, et al. (2006) Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 355: 2408-2417. 2. Weisberg E, et al. (2007) Beneficial effects of combining nilotinib and imat- inib in preclinical models of BCR-ABL+ leukemias. Blood 109: 2112-2120. 3. Kohler G, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-497. 4. Presta LG (2008) Molecular engineering and design of therapeutic anti- bodies. Curr Opin Immunol 20: 460-470. 5. Matsumura Y, Maeda H (1986) A new concept for macromolecular thera- peutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res 46: 6387-6392. 6. Duncan R, et al. (2005) Polymer-drug conjugates: towards a novel approach for the treatment of endrocine-related cancer. Endocr Relat Cancer 12 Suppl 1: S189-199. 31
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Milada Šírová, Ph.D. 7.31 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Milada Šírová, Ph.D. 282 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Milada Šírová, Ph.D. 111 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jaroslav Turánek, CSc. 109 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. PharmDr. Miloslava Rabišková, CSc. 99 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 559 kB