velikost textu

New functionalized nucleic acids for application in chemical biology

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
New functionalized nucleic acids for application in chemical biology
Název v češtině:
Nové funkcionalizované nukleové kyseliny pro aplikaci v chemické biologii
Typ:
Disertační práce
Autor:
Ing. Pavel Kielkowski, Ph.D.
Školitel:
prof. doc. Ing. Michal Hocek, DSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc.
prof. Ing. Jitka Moravcová, CSc.
Id práce:
84117
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra organické chemie (31-270)
Program studia:
Organická chemie (P1402)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
31. 10. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Abstrakt Tato práce je zaměřena na syntézu modifikovaných 2’-deoxyribonukleosid trifosfátů, jejich inkorporaci do DNA a aplikaci v chemické biologii. Byla vyvinuta syntéza “douhlavých” nukleosidů a nukleosid trifosfátů, které obsahují ethynylový nebo propargylový můstkem mezi dvěmi bázemi. (Cytosin-5-yl)ethynyl, 3-(cytosin-1-yl)prop-1-yn-1-yl a 3-(5- fluorcytosin-1-yl)prop-1-yn-yl substituované pyrimidiny a 7-deazaadeniny 2’- deoxyribonukleosidů a nukleosid trifosfátů byly připraveny palladiem katalyzovanou cross- coupling reakcí ve vodném prostředí. Tyto 2’-deoxyribonukleosid trifosfáty obsahující dvě nukleobáze jsou dobrými substráty pro DNA polymerasy v primer extension reakci a PCR a tudíž vhodné pro přípravu DNA s cytosinem nebo 5-fluorcytosinem ve velkém žlábku, která tak napodobuje nukleobázi vyjmutou ven z DNA dvoušroubovice. Byla také vyzkušena metoda pro testování inhibice DNA methyltransferáz. Dále, bylo vyvinuto přechodné chránění DNA proti štěpení restrikčními endonukleázami (RE) za pomocí (trialkylsilyl)ethynyl modifikované DNA. Bylo dokázáno, že všechny připravené (trialkylsilyl)ethnyl-modifikované 7-deaza-2’-deoxyadenosin trifosfáty se inkorporují do DNA KOD XL polymerásou v primer extension reakci a nebo pomocí PCR. Podmínky potřebné pro odchránění trialkylsilylové chránicí skupiny byly optimalizovány na nukleosid monofosfátech. Rovněž byla testována schopnost (trialkylsiyl)ethynyl modifikované DNA chránit tuto DNA proti štěpení RE. Zjistili jsme, že DNA chráněná (triethylsilyl)ethynylovou skupinou nepodléhá štěpení pomocí RE, po odchránění triethylsilylové skupiny amoniakem výsledná ethynyl modifikovaná DNA již štěpena RE je. Tento 7-(triethylsilyl)ethynyl-7- deaza-2’-deoxyadenosin trifosfát byl také použit při přípravě genu částečně chráněného proti štěpení RE. Pro přípravu byla použita vlastní nová metoda založená na PCR. V genu neobsažené nemodifikované sekvence byly dále použity pro klonování do plasmidu, jenž byl následně replikován v E. coli a použit pro produkci proteinu. A konečně, série 7- substituovaných 7-deazaadenin a 5-substituovaných cytosin 2’-deoxyribonukleosid trifosfátů byla testována v přímé kompetitivní inkorporaci (s jejich přirozenými analogy) do DNA pomocí celé řady DNA polymeras. K analýze byla použita metoda založená na štěpících vlastnostech RE. Ukázalo se, že 7-aryl-7-deaza-2’-deoxyadenosin trifosfáty jsou lepšími substráty pro DNA polymerasy než přirozená dATP, protože mají větší afinitu k aktivnímu místu polymerasy. Zmíněná zjištění byla dále potvrzena měřením kinetik a modelováním. 5
Abstract v angličtině:
Abstract This work is focused on the synthesis of the modified 2’-deoxyribonucleoside triphosphates, their incorporation into DNA and use in chemical biology applications. The synthetic routes to the double-headed nucleosides and nucleotide triphosphates in which the two nucleobases were connected via ethynyl or propargyl linker has been developed. (Cytosin-5-yl)ethynyl, 3-(cytosin-1-yl)prop-1-yn-1-yl and 3-(5-fluorocytosin-1-yl)prop-1-yn- 1-yl derivatives of pyrimidine and 7-deazaadenine 2’-deoxyribonucleosides and nucleoside triphosphates were prepared by aqueous palladium-catalyzed cross-coupling reactions. The double-headed modified nucleoside triphosphates were good substrates for DNA polymerases suitable for primer extension and PCR construction of DNA bearing linked cytosine or 5- fluorocytosine in the major groove mimicking the flliped-out nucleotide. The assay for the testing of the inhibition of DNA methyltransferases was developed. Next, the transient protection of DNA against cleavage by restriction endonucleases (REs) using (trialkylsilyl)ethynyl modified DNA was developed. A series of 7-(trialkylsilyl)ethynyl-7- deaza-2’-deoxyadenosine triphosphates was prepared and they were shown to be incorporated into DNA by primer extension and/or PCR using KODXL polymerase. The deprotection conditions of the trialkylsilyl protecting groups were optimized on model nucleoside monophospahtes. The ability to protect the DNA against cleavage by REs by using (trialkylsilyl)ethynyl modifications was tested. It was found that the (triethylsilyl)ethynyl- protected DNA resists the cleavage by RE, but after it is treated with NH3, the resulting deprotected ethynyl-modified DNA is fully cleavable by the REs. This 7- (triethylsilyl)ethynyl-7-deaza-2’-deoxyadenosine triphosphate was also used in a PCR-based synthesis of a gene internally protected against cleavage by restriction endonucleases. The unmodified flanking regions were cleaved for cloning into a plasmid which was replicated by E. coli, and used for protein production. Finally, a series of 7-substituted 7-deazaadenine and 5-substituted cytosine 2′-deoxyribonucleoside triphosphates were tested for their competitive incorporations (in the presence of their natural counterparts) into DNA by several DNA polymerases by using analysis based on cleavage by restriction endonucleases. 7-Aryl-7- deaza-2’-deoxyadenosine triphosphates were shown to be more efficient substrates than dATP because of their higher affinity for the active site of the enzyme, as proved by kinetic measurements and calculations. 4
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Ing. Pavel Kielkowski, Ph.D. 13.71 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Ing. Pavel Kielkowski, Ph.D. 90 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Ing. Pavel Kielkowski, Ph.D. 88 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Ing. Pavel Kielkowski, Ph.D. 5.47 MB
Stáhnout Posudek vedoucího prof. doc. Ing. Michal Hocek, DSc. 535 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc. 152 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Ing. Jitka Moravcová, CSc. 302 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 622 kB