velikost textu

Synthesis of functionalized nucleosides and nucleotides and their incorporation into DNA

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Synthesis of functionalized nucleosides and nucleotides and their incorporation into DNA
Název v češtině:
Syntéza vybraných funkcionalizovaných nukleosidů a nukleosid trifosfátů a jejich inkorporace do DNA
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Jana Balintová, Ph.D.
Školitel:
prof. doc. Ing. Michal Hocek, DSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc.
Mgr. Martin Bartošík, Ph.D.
Id práce:
84115
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra organické chemie (31-270)
Program studia:
Organická chemie (P1402)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
19. 1. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Abstrakt Disertační práce popisuje syntézu modifikované DNA nesoucí elektrochemické aktivní značky (antrachinon, benzofurazan, azidoskupinu a nitrofenyltriazol) pro aplikaci v bioanalýze. Byla vyvinuta metoda přípravy modifikovaných trifosfátů, která je založena na vodné Suzukiho cross-couplingové reakci halogenovaných deoxynukleosid trifosfátů s arylboronovými kyselinami, na Sonogashirově cross-couplingové reakci jodovaných deoxynukleosid trifosfátů s terminálními alkyny, nebo na fosforylaci již modifikovaných nukleosidů. Enzymatická inkorporace funcionalizovaných nukleosid trifosfátů do DNA byla testována prostřednictvím primer extension experimentu a elektrochemické vlastnosti DNA nesoucí redoxní značky byly studovány pomocí cyklické a "square wave" voltametrie. Jako první byl jako elektrochemická značka testován antrachinon. Modifikované 2’-deoxynukleosid trifosfáty nesoucí antrachinon připojený přes acetylenový nebo přes propargylkarbamoylový linker v pozici 5 2’-deoxycytidin 5’-trifosfátu a v pozici 7 7-deaza-2’-deoxyadenosin-5’-trifosfátu byly připraveny pomoci Sonogashirova cross-couplingu. Deoxynukleosid trifosfáty značené antrachinonem byly inkorporovány do DNA prostřednictvím primer extension experimentu. Elektrochemické vlastnosti antrachinonem značených nukleosidů, nukleotidů a DNA byly studovány pomocí cyklické voltametrie, při které byla pozorována reverzibilní dvojice píků při -0.4 V. Kombinace dvou redukovatelných značek, antrachinonu a nitrofenylu byla testována pomocí voltametrie a poskytla jeden nerozlišený široký signál. Benzofurazan jako nová elektrochemická značka byl připojen k deoxynukleosidům a deoxynukleosid trifosfátům přímo, nebo přes acetylenový linker. Benzofurazanem značené nukleotidy byly inkorporovány do DNA prostřednictvím primer extension experimentu. Elektrochemické vlastnosti nukleosidů, nukleotidů a DNA značených benzofurazanem byly studovány pomocí cyklické voltametrie, která zobrazuje intenzívní katodický signál v oblasti -0.7 a -0.85 V. Kombinací benzofurazanu s nitrofenylem a aminofenylem jsme úspěšně vyvinuli trojpotenciálové kódování DNA bází. Kombinace benzofurazanu s nitrofenylem je vynikající pro poměrové analýzy nukleotidových sekvencí a je vhodná pro bioanalytické aplikace. Redoxní značení DNA azido skupinou, která může být chemicky transformována na nitrofenyltriazol nebo na fenyltriazol bylo využito pro elektrochemickou detekci interakce DNA-protein (protein p53). Pouze azidofenylové skupiny v úsecích DNA, které nejsou zakryty proteinem p53, byly transformovány na nitrofenyltriazoly.
Abstract v angličtině:
Abstract This PhD thesis describes the synthesis of modified DNA containing electrochemical active labels such as anthraquinone, benzofurazane, azide and nitrophenyltriazole with the application in bioanalysis. The methodology of the construction of base-modified triphosphates based on Suzuki-Miyaura coupling of halogenated deoxynucleoside triphosphates with arylboronic acids, Sonogashira coupling of dNTPs with terminal acetylenes or triphosphorylation of modified nucleosides was developed. Enzymatic incorporation of functionalized dNTPs into DNA by primer extension experiment and the electrochemical properties of DNA bearing redox labels were studied by cyclic and square- wave voltammetry. At first anthraquinone was tested as an electrochemical label. Modified 2’-deoxynucleoside triphosphates bearing anthraquinone attached through an acetylene or propargylcarbamoyl linker at 5-position of 2’-deoxycytidine 5’-triphosphate and at the 7-position of 7-deaza-2’-deoxyadenosine-5’-triphosphate were prepared by Sonogashira cross-coupling. Enzymatic incorporation of the anthraquinone-labeled dNTPs into DNA by primer extension has been developed. The electrochemical properties of the anthraquinone- labeled nucleosides, dNTPs and DNA were studied by cyclic voltammetry which shows a reversible couple of peaks around -0.4 V. The combination of two reducible labels, anthraquinone and nitrophenyl group, gave only one unresolved broad peak in voltammetry. Then benzofurazane as a new redox label has been attached to nucleosides and dNTPs either directly or through the acetylene linker. The benzofurazane-modified dNTPs were incorporated into DNA by primer extension. The voltammetric properties of the benzofurazane-modified nucleosides, nucleotides and DNA were studied by using cyclic voltammetry which produced intense cathodic peaks in the region -0.70 and -0.85 V. By combination of benzofurazane, nitrophenyl and aminophenyl labels we have successfully developed a three-potential coding of DNA bases. The combination of benzofurazane and nitrophenyl reducible labels has proved to be excellent for ratiometric analysis of nucleotide sequences and is suitable for bioanalytical applications. New redox labeling of DNA by azido group which can be chemically transformed to nitrophenyltriazole or silenced to phenyltriazole was developed. This tranformation was utilized in the electrochemical detection of DNA-protein interactions (p53 protein) since only those azidophenyl groups in the parts of the DNA which was not shielded by the bound p53 protein were transformed to nitrophenyltriazoles whereas those covered by the protein were not.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Jana Balintová, Ph.D. 5.77 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Jana Balintová, Ph.D. 50 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Jana Balintová, Ph.D. 26 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Jana Balintová, Ph.D. 2.1 MB
Stáhnout Posudek vedoucího prof. doc. Ing. Michal Hocek, DSc. 510 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc. 231 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Martin Bartošík, Ph.D. 797 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 657 kB