velikost textu

Functional and biochemical characterization of elF3 and elF3j in Saccharomyces cerevisiae and human cell lines

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Functional and biochemical characterization of elF3 and elF3j in Saccharomyces cerevisiae and human cell lines
Název v češtině:
Funkční a biochemická charakterizace elF3 a elF3j v Saccharomyces cerevisiae a lidských buňkách
Typ:
Disertační práce
Autor:
Susan Wagner, M.Sc., Ph.D.
Školitel:
Mgr. Leoš Valášek, Ph.D.
Oponenti:
Mgr. Libor Krásný, Ph.D.
doc. Mgr. David Staněk, Ph.D.
Id práce:
84023
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
30. 6. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
3 Abstrakt 3.2 český Translace se dělí na iniciaci, elongaci, terminaci a recyklaci ribozómů. Eukaryotický iniciační faktor (eIF) 3 je jeden z největších iniciačních faktorů a hraje důležitou roli ve většině reakcí během iniciace translace. Byl taktéž spojován s fází recyklace ribozómů. Nyní jsme však objevili jeho další funkci, a to v terminaci translace v kvasinkách, kde komplex eIF3 a jeho nestechiometricky vázaná podjednotka eIF3j/HCR1 ovlivňují terminaci translace a působí na rozpoznání STOP kodónu antagonisticky. Taktéž jsme charakterizovali funkci eIF3j v iniciaci translace. Strukturní analýza ukázala vazbu mezi evolučně konzervovaným tryptofanem v N-koncovém kyselém motivu (NTA) lidského eIF3j a hydrofóbní kapsou v RNA rozpoznávajícím motivu (RRM) lidského eIF3b. Tato vazba je konzervovaná rovněž v kvasinkách, kde zajištuje dostatečnou vazbu eIF3 na 40S ribozomální podjednotku. Má vliv na přesnost rozpoznání počátečního kodónu AUG, přičemž se zdá, že j/HCR1 při tom spolupracuje s eIF1A. Zjistili jsme, že první polovina j/HCR1 je v kvasinkách dostačující pro zajištění všech funkcí celého proteinu, které jsou zapotřebí pro růst přirozeného kmenu. Druhá polovina pak obsahuje evolučně konzervovaný specifický motif KERR, který je taktéž obsažen v HCR1-like doméně podjednotky a/TIF32. Tato část j/HCR1 dokáže suprimovat defekty růstu, které jsou spojeny s mutacemi motivu KERR právě v podjednotce a/TIF32. Dále se díky naší detailní analýze ukázalo, že funkce j/HCR1 v terminaci translace je mnohem kritičtější pro optimální proliferaci buněk než jeho funkce v iniciaci translace. Námi provedené mapování vazby j/HCR1 na povrch ribozómu ukázalo, že tato podjednotka specificky interaguje s ribozomálními proteiny malé ribozomální podjednotky RPS2 a RPS23, které jsou umístěny v blízkosti vstupního místa pro mRNA. Toto zjištění koresponduje s dřívější studií, která mapovala vazbu lidského eIF3j na ribozóm pomocí hydroxylových radikálů. Nakonec, za použití RNAi, jsme snížili množství podjednotky eIF3j ve dvou lidských buněčných liniích a zjistili jsme, že překvapivě toto snížení nemá vliv na efektivitu translace ani na růst. To může znamenat, že eIF3j hraje v savčích buňkách méně důležitou roli než jeho homolog v kvasinkách. Naopak snížení eIF3c nebo eIF3a vedlo ke snížení dalších podjednotek komplexu eIF3, nikoliv jejich mRNA. Tím došlo k desintegraci celého komplexu, což mělo za následek snížení rychlosti translace a postižena byla i buněčná proliferace. Na základě toho předpokládáme, že podjednotky eIF3a a eIF3c ovlivňují množství a složení lidských komplexů eIF3. Na druhou stranu úplný rozpad komplexu eIF3 po snížení eIF3a nijak neovlivnil vazbu eIF3j na 40S in vivo. Na základě těchto a dalších poznatků si myslíme, že by zařazení proteinu eIF3j/HCR1 mezi podjednotky komplexu eIF3 mělo být přehodnoceno.
Abstract v angličtině:
3 Abstract 3.1 english Translation is divided into initiation, elongation, termination and ribosome recycling. One of the largest eukaryotic initiation factors (eIF), eIF3, plays a role in nearly all steps of initiation and was recently also implicated in ribosomal recycling. Here we uncovered novel roles for eIF3 in translation termination in yeast, where the five core eIF3 subunits and their loosely associated eIF3j/HCR1 accessory factor control stop codon read-through in the opposite manner. In addition, we further characterized the function of eIF3j in initiation. Structural analysis revealed that the conserved tryptophan residue in the human eIF3j N-terminal acidic motif (NTA) is held in the hydrophobic pocket of the human eIF3b RNA recognition motif (RRM). This binding mode was shown to be conserved in yeast ensuring efficient 40S-binding by eIF3 and stringency of AUG recognition, where j/HCR1 seems to co-operate with eIF1A. We found that the N-terminal half of j/HCR1 in yeast is sufficient for fulfilling all functions of the full-length protein necessary for wild-type growth. Despite the logical dispensability of the j/HCR1 C- terminal half, it was shown that it bears a specific KERR motif that is evolutionary conserved and contained also within the HCR1-like domain of a/TIF32, through which it physically and functionally interacts with a/TIF32 and is able to suppress growth defects associated with mutations in the KERR motif of a/TIF32. Strikingly, our detailed analysis demonstrated that the termination function of yeast j/HCR1 is more critical for optimal proliferation than its function in translation initiation. Our efforts to map the binding site of j/HCR1 on the ribosomal surface then revealed that it specifically interacts with small ribosomal proteins RPS2 and RPS23 located in the vicinity of the mRNA entry channel, which is consistent with an earlier study mapping the ribosomal binding site for human eIF3j by hydroxyl radical probing. Finally, using RNA interference we down-regulated eIF3j in two human cell lines and discovered that it surprisingly had barely any consequences on translational rates as well as growth, suggesting that eIF3j in mammals has minor importance than its yeast counterpart. In contrast, down-regulation of eIF3c or eIF3a reduced protein but not mRNA levels of many other eIF3 subunits besides eIF3c and eIF3a and thus disintegrated the whole eIF3 complex, leading to severe reduction in translational rates and retarded cell proliferation. Hence, we propose that eIF3a and eIF3c control abundance and assembly of the entire human 12-subunit eIF3 complex. Complete disassembly of eIF3 upon eIF3a down-regulation did not influence the binding of eIF3j to the 40S in vivo. Based on these and other observations we suggest that the assignment of eIF3j/HCR1 as a bona fide eIF3 subunit should be reconsidered.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Susan Wagner, M.Sc., Ph.D. 38.74 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Susan Wagner, M.Sc., Ph.D. 294 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Susan Wagner, M.Sc., Ph.D. 290 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Susan Wagner, M.Sc., Ph.D. 788 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Libor Krásný, Ph.D. 145 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Mgr. David Staněk, Ph.D. 157 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 574 kB