velikost textu

Complex structural and functional analysis of individual subunits of yeast translation initiation factor 3.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Complex structural and functional analysis of individual subunits of yeast translation initiation factor 3.
Název v češtině:
Komplexní strukturní a funkční analýza jednotlivých podjednotek kvasinkového translačního iniciačního faktoru 3.
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Anna Herrmannová, Ph.D.
Školitel:
Mgr. Leoš Valášek, Ph.D.
Oponenti:
Mgr. Libor Krásný, Ph.D.
RNDr. Martin Pospíšek, Ph.D.
Id práce:
84022
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
20. 3. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
ABSTRAKT Eukaryotická iniciace translace je komplexní proces, který je ovlivněn mnoha proteiny a proteinovými komplexy, které nazýváme translační iniciační faktory. Eukaryotický translační iniciační faktor 3 (eIF3) je komplexem více podjednotek a hraje roli hned v několika fázích iniciace translace. Iniciační faktor eIF3 se v kvasince Saccharomyces cerevisiae skládá z pěti esenciálních podjednotek (a/TIF32, b/PRT1, c/NIP1, g/TIF35, i/TIF34) a jedné neesenciální podjednotky (j/HCR1). Naším dlouhodobým cílem je porozumět tomu, jak eIF3 působí v různých fázích iniciace translace, které podjednotky nebo jejich domény hrají při těchto proceses důležitou roli, a také zmapování jeho vazebných míst na malé ribosomální podjednotce a vytvoření strukturního modelu celého komplexu. V této práci prezentuji výsledky dvou strukturních studií. První popisuje interakci objevenou pomocí NMR spektroskopie mezi RNA-rozpoznávajícím motivem lidského faktoru eIF3b a podjednotkou eIF3j. Druhá studie představuje krystalickou strukturu interakce mezi C-koncovým fragmentem kvasinkové podjednotky b/PRT1 a podjednotkou i/TIF34 v rozlišení 2,2 A. V první práci jsme ukázali, že kritické determinanty této interakce jsou konzervovány také v kvasinkách, a že jejich mutace způsobuje zpomalení růstu, eliminuje asociaci j/HCR1 s b/PRT1 in vitro a in vivo, má vliv na vazbu eIF3 na 40S podjednotku a vede k defektu zvanému „leaky scanning“, který indikuje narušení procesu výběru AUG kodonu. V druhé studii jsme odhalili, že interakce mezi b/PRT1 a i/TIF34 závisí na dvou hlavních kontaktech. Mutace těchto kontaktů způsobují eliminaci vazby i/TIF34 a g/TIF35 podjednotek na multifaktoriální komplex, snižují vazbu zbývajících podjednotek eIF3 a také iniciačního faktoru 5 na ribozóm a vedou k akumulaci aberantních preiniciačních komplexů, které způsobují „leaky scanning“. V dalších studiích jsme identifikovali nové kontakty mezi C-koncovou doménou a/TIF32 a ribozomálními proteiny malé podjednotky RPS2 a RPS3, a mezi j/HCR1 a RPS2 a RPS23. Tyto kontakty vzájemně interagujících podjednotek eIF3 naznačují, že se tyto podjednotky váží na ribozóm v blízkosti vstupního kanálu pro mRNA, kde mohou regulovat výběr start kodonu, a v případě a/TIF32-CTD také usnadňovat vazbu mRNA na ribozóm. Dále jsme také zjistili, že se podjednotka g/TIF35 váže na 7 ribozomální proteiny RPS3 a RPS20, což naznačuje že subkomplex g/TIF35-i/TIF34 se nachází nad vstupním kanálem pro mRNA, kde může ovlivňovat skenování a také kriticky přispívat ke správnému sestavení 48S preiniciačního komplexu. Dále jsme také popsali, jak N-koncová doména c/NIP1 ovlivňuje působení faktorů eIF1 a eIF5 během vazby ternárního komplexu a během výběru iniciačního kodonu a zmapovali jsme vazebná místa těchto faktorů na podjednotce c/NIP1-NTD. V dalších studiích jsme poté ukázali, že N-koncová doména a/TIF32 a podjednotka g/TIF35 hrají důležitou roli v procesu genově specifické regulace zvané reiniciace, ačkoli molekulární mechanismus působení obou podjednotek se liší. 8
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Translation initiation in eukaryotes is a complex process promoted by numerous proteins or protein complexes called eukaryotic initiation factors (eIFs). The eukaryotic initiation factor 3 (eIF3) is a multisubunit complex that has been implicated in several steps of the translation initiation pathway. In yeast Saccharomyces cerevisiae, eIF3 is composed of five essential subunits (a/TIF32, b/PRT1, c/NIP1, g/TIF35, i/TIF34) and one nonessential subunit (j/HCR1). It is our long-term goal to understand how eIF3 promotes different stages of translation initiation and which subunits or their domains play a critical role in this process as well as to map the binding sites of eIF3 on 40S ribosomal subunit and to create a structural model of eIF3 complex. Here I present two structural studies showing interactions between the RNA recognition motif of eIF3b and a short peptide of eIF3j subunits of human eIF3 solved by NMR spectroscopy, and a crystal structure of the C-terminal fragment of yeast b/PRT1 in complex with the full length i/TIF34 subunit at 2.2 Å resolution. In the former study, me and my colleagues showed that the critical determinants mediating this eIF3b–eIF3j interaction are evolutionary conserved, since their mutations in yeast proteins reduced cellular growth rate, eliminated j/HCR1 association with b/PRT1 in vitro and in vivo, affected 40S-binding of the entire eIF3 complex, and finally produced a leaky scanning defect (skipping the AUG start codon) indicating impairment of the AUG selection process. In the latter study, I revealed that the b/PRT1-i/TIF34 interaction is mediated by two major contacts. Site-directed mutagenesis of these contacts eliminated association of i/TIF34 and g/TIF35 with the rest of eIF3 in vivo, affected 40S-binding of the remaining trimeric subcomplex of eIF3 and its binding partner eIF5, and, as a result, led to accumulation of aberrant preinitiation complexes containing only eIF1 and eIF2 causing a severe leaky scanning defect. In other studies, we identified novel contacts between the a/TIF32 C-terminal domain (a/TIF32-CTD) and yeast small ribosomal proteins RPS2 and RPS3, and between j/HCR1 and RPS2 and RPS23, which place this mutually interacting eIF3 subunits in the vicinity of the mRNA entry channel, where they can contribute to regulation of the start codon recognition, and at least in case of the a/TIF32-CTD, also in mRNA recruitment, as we demonstrated. We also identified RPS3 and RPS20 as the 5 binding partners of g/TIF35, which places the g/TIF35-i/TIF34 subcomplex on the solvent side of the 40S subunit right above the mRNA entry channel, where it can contribute to the proper assembly of the 48S pre-initiation complex and influence subsequent scanning for AUG, as we showed. We also mapped the binding sites of two factors critically involved in AUG recognition within the c/NIP1 N-terminal domain, namely eIF1 and eIF5, and characterized how these contacts promote the ternary complex recruitment and modulate start codon selection. Finally, in our functional genetic studies, we showed that a/TIF32 N-terminal domain and g/TIF35 play important roles in the process of gene-specific regulation called reinitiation, although by a different molecular mechanism. 6
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Anna Herrmannová, Ph.D. 29.37 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Anna Herrmannová, Ph.D. 242 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Anna Herrmannová, Ph.D. 163 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Anna Herrmannová, Ph.D. 331 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Libor Krásný, Ph.D. 144 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Martin Pospíšek, Ph.D. 468 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 626 kB