velikost textu

Charakterizace dvou nejmensich podjednotek eIF3 a jejich úloh v translaci.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Charakterizace dvou nejmensich podjednotek eIF3 a jejich úloh v translaci.
Název v angličtině:
Characterization of the two smallest core subunits of eIF3 and their roles in translation.
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Lucie Cuchalová, Ph.D.
Školitel:
Mgr. Leoš Valášek, Ph.D.
Oponenti:
Mgr. Libor Krásný, Ph.D.
RNDr. Martin Pospíšek, Ph.D.
Id práce:
84021
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
4. 4. 2013
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Abstrakt Syntéza bílkovin, neboli translace mRNA, je komplexní a velmi konzervovaný proces. Translace probíhá v několika na sebe navazujících fázích: iniciaci, elongaci, terminaci a recyklaci ribozomu. Vzhledem k tomu, že většina regulačních procesů probíhá v iniciační fázi, již po několik desetiletí je právě k ní upírán vědecký zrak se snahou objasnit molekulární mechanismus všech jejich kontrolních bodů. Iniciační faktor eIF3, který se v kvasinkách skládá z pěti esenciálních podjednotek tvořících jeho jádro (eIF3a/TIF32, b/PRT1, c/NIP1, g/TIF35, a i/TIF34) a jedné přidružené neesenciální podjednotky (j/HCR1), patří neoddiskutovatelně ke klíčovým hráčům iniciace. Kromě této úlohy hraje rovněž důležitou roli v recyklaci ribozomu, reiniciaci, signálních drahách buněčné signalizace, kontrolních a regulačních mechanismech, jakým je kupříkladu degradace mRNA s předčasným stop kodonem (nonsense-mediated mRNA decay - NMD) atp. Zaměřili jsme se na objasnění molekulárního mechanismu, kterým eIF3 spolu s ostatními iniciačními faktory vykonávající svou funkci nejen v iniciaci translace, ale i její terminaci a reiniciaci. To zahrnovalo mimo jiné i genetické mapování vazebných míst eIF3 na malou ribozomální podjednotku. Ukázali jsme, že vazba mezi 200-400-tým aminokyselinovým zbytkem N-konce a/eIF3 a flexibilním chvostem C-konce RPS0A významně stimuluje navázání eIF3 a s ní asociovaných faktorů na malou ribozomální podjednotku in vivo, a tak a/TIF32-NTD, spolu s nedávno publikovanou PCI (proteasome component) doménou C-konce c/NIP1, tvoří důležitý mezimolekulární most mezi eIF3 a 40S. Dále jsme předvedli, že částečná delece domény vázající RPS0A v a/TIF32 blokuje znovu zahájení translace genu GCN4, který probíhá prostřednictvím reiniciaci. Genetická analýza odhalila funkční vazbu mezi 5´cis-působících sekvencí mRNA genu GCN4 a N-koncem a/TIF32. Tato interakce se podílí na stabilizování post-terminačních 40S ribozomálních podjednotek na uORF1 (čtecím rámci v protisměru) mRNA genu GCN4 a obnovení skenování. Další část mé dizertační práce odhaluje funkční charakteristiku dvou esenciálních podjednotek eIF3: g/TIF5 and i/TIF34, u kterých bylo dříve in vitro prokázáno, že jsou postradatelné pro vytvoření 48S neiniciačních komplexů, jedné ze základních rolí eIF3. Ukázali jsme, že oba proteiny ovlivňují rychlost a procesivitu skeninku v živých buňkách. Dále jsme ukázali, že g/TIF35 se specificky váže na ribozomální proteiny RPS3 a RPS20, které se nalézají v blízkosti vstupního kanálu mRNA do ribozomu a její RRM (RNA recognition motif) doména hraje roli v reiniciaci již zmiňovaným stabilizování uORF1 post- terminačních 40S ribozomů na mRNA genu GCN4, ačkoliv jiným molekulárním mechanismem než a/TIF32-NTD. Mimo to jsme uveřejnili krystalovou strukturu, v rozlišení 2.2A˚, i/TIF34 podjednotky v komplexu s malou částí C-konce b/PRT1 (654-700-tým zbytkem). V poslední části mé dizertační práce jsme identifikovali a definovali roli eIF3 v procesu rozpoznání stop kodonu a odhalili její aktivní roli v terminaci translace.
Abstract v angličtině:
Abstract Protein synthesis or mRNA translation is a complex and highly conserved process. Translation consists of initiation, elongation, termination, and ribosome recycling stages. Since most regulation occurs during initiation, its mechanism is being studied intensively to elucidate the molecular basis of every potential control point. The initiation factor eIF3, which in yeast consists of five essential core subunits (eIF3a/TIF32, b/PRT1, c/NIP1, g/TIF35, and i/TIF34) and one transiently associated, non-essential subunit (j/HCR1), is undisputedly one of the key promoters of initiation. In addition, it has also been implicated in playing a critical role during ribosomal recycling, reinitiation, signal transduction, NMD etc. We have focused on determining the molecular mechanism of the roles of eIF3 and its associated eIFs not only in translation initiation but also in termination and in reinitiation. This included the biochemical and genetic mapping of yeast eIF3 binding site on the small ribosomal subunit, among others. We showed that the interaction between the residues 200–400 of a/TIF32-NTD and flexible C-terminal tail RPS0A significantly stimulates attachment of eIF3 and its associated eIFs to small ribosomal subunits in vivo, thus a/TIF32-NTD together with the recently published PCI (proteasome component) domain in c/NIP1-CTD form important intermolecular bridges between eIF3 and the 40S. Moreover, we demonstrated that the partial deletion of the RPS0A-binding domain of a/TIF32 also severely blocks the induction of GCN4 translation that occurs via reinitiation. Genetic analysis reveals a functional interaction between 5´ cis-acting sequences of the GCN4 mRNA and a/TIF32-NTD. This interaction facilitates stabilizing post-termination 40S subunits on upstream ORF1 of the GCN4 mRNA and resuming of scanning downstream. Furthermore, another part of my Ph.D. thesis reveals functional characterization of two essential eIF3 subunits, g/TIF35 and i/TIF34, previously suggested to be dispensable for formation of the 48S preinitiation complexes (PICs) in vitro, hallmark function of eIF3. We showed that both subunits are involved in promoting the rate and processivity of scanning in living cells. Moreover, we demonstrated that g/TIF35 specifically interacts with ribosomal proteins RPS3 and RPS20 located near the ribosomal mRNA entry channel and its RRM domain plays role in reinitiation by stabilizing uORF1 post-termination 40S ribosomes on GCN4, although by different molecular mechanism than a/TIF32-NTD. Besides, we reported the 2.2A˚ resolution crystal structure of i/TIF34 subunit in complex with the minimal CTD of b/PRT1 (654–700), the boundaries of which were defined by solution NMR spectroscopy In my last part of this thesis we identified and defined a role for eIF3 in the stop codon selection process in vivo and uncovered its active roles in translation termination, defining a communication bridge between initiation and termination/recycling phases of protein synthesis.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Lucie Cuchalová, Ph.D. 27.5 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Lucie Cuchalová, Ph.D. 98 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Lucie Cuchalová, Ph.D. 79 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Lucie Cuchalová, Ph.D. 327 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Libor Krásný, Ph.D. 122 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Martin Pospíšek, Ph.D. 262 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 818 kB