velikost textu

Genetic determination of cholesterolemia regulation

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Genetic determination of cholesterolemia regulation
Název v češtině:
Genetická determinace regulace cholesterolémie
Typ:
Disertační práce
Autor:
Ing. Miluše Vlachová
Školitel:
RNDr. Jan Kovář, CSc.
Oponenti:
doc. MUDr. Michal Vrablík, Ph.D.
Ing. Ludmila Kazdová, CSc.
Id práce:
84017
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyziologie (31-152)
Program studia:
Fyziologie živočichů (P1521)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
2. 5. 2016
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
cholesterol, potkan, hypercholesterolémie, cholesterol-7alfa-hydroxylasa
Klíčová slova v angličtině:
cholesterol, rat, hypercholesterolemia, cholesterol 7alpha-hydroxylase
Abstrakt:
Souhrn Většina hypercholesterolémií je polygenního původu, dosud však neznáme všechny geny, které cholesterolémii určují. K objevu těchto genů by mohlo napomoci studium experimentálních modelů se spontánním defektem v metabolismu cholesterolu. Cholesterolémie u lidí může být též ovlivněna řadou genových variací a polymorfismů. Některé z nich mohou ovlivnit i odpověď cholesterolémie na příjem tuků. Pražský hereditárně hypercholesterolemický (PHHC) potkan je jedinečný model hypercholesterolémie, která je indukovaná pouze dietním cholesterolem (bez přídavku kyseliny cholové nebo léků ovlivňujících činnost štítné žlázy). Již na standardní dietě má lehce zvýšenou cholesterolémii a na podání cholesterolové diety reaguje několikanásobným vzestupem koncentrace cholesterolu v krvi (odpovídající pacientům s hypercholesterolémií). Akumulují se u něj lipoproteiny s vysokým obsahem cholesterolu, zejména lipoproteiny o střední (IDL) a velmi nízké (VLDL) hustotě. V pokusu s tyloxapolem (inhibitorem lipoproteinové lipasy (LPL)) jsme zjistili, že PHHC potkan na cholesterolové dietě inkorporuje do VLDL dvakrát více cholesterolu než potkan Wistar, a to při stejném obsahu cholesterolu v játrech u obou kmenů. Tyto VLDL bohaté na cholesterol jsou in vivo katabolizovány pomaleji a hromadí se v cirkulaci. Zvýšenou inkorporaci cholesterolu do VLDL u PHHC potkana nemůžeme vysvětlit rozdíly v aktivitě enzymů acyl-CoA:cholesterol- acyltransferasy (ACAT) a mikrosomálního proteinu přenášejícího triacylglyceroly (MTP) ani v expresi genů, které tyto enzymy kódují. Mezi potkany PHHC a Wistar nebyly také nalezeny žádné rozdíly v odpovědi jaterního transkriptomu (Affymetrix GeneChip®) na cholesterolovou dietu. Identifikovali jsme ale několik genů, jejichž exprese se mezi oběma kmeny významně lišila nezávisle na dietě. Podrobněji jsme analyzovali úlohy dvou z nich, Apof a Aldh1a7, včetně jimi kódovaných proteinů. Jejich funkce v patogenezi hypercholesterolémie zůstávají však i nadále nejasné. V rámci disertační práci jsme objasnili fyziologickou podstatu hypercholesterolémie u PHHC potkana, geny odpovědné za rozvoj hypercholesterolémie se nám však určit nepodařilo. Cholesterol-7α-hydroxylasa (CYP7A1) klíčový řídicí enzym syntézy žlučových kyselin, hraje důležitou roli v regulaci cholesterolémie. Polymorfismus -203A>C (rs3808607) v promotoru genu pro CYP7A1 se podílí na determinaci cholesterolémie a její odpovědi na dietu. Tento polymorfismus je v pevné vazbě s dalším promotorovým polymorfismem -469C>T (rs3824260). Pomocí duálního luciferasového stanovení jsme zjistili, že exprese alely -203C (-203C, -469T) je několikrát zvýšena v porovnání s alelou -203A (-203A, -469C). Za pozorované změny je odpovědný nukleotid v pozici -203. Obě alely se nelišily v odpovědi na stimulaci inzulínem a PPARα agonisty (WY-14643 nebo fenofibrát). Dále jsme studovali diurnální variaci aktivity CYP7A1 po podání cholestyraminu (zvýšení aktivity) a kyseliny chenodeoxycholové (CDCA, snížení aktivity) u zdravých mužů homozygotních pro variantu -203A nebo -203C. Aktivita CYP7A1 byla po podání cholestyraminu zvýšena a po podání CDCA snížena. Mezi homozygotními nositeli -203A a -203C jsme však po podání obou léků nenalezli rozdíly. Aktivita CYP7A1 vykazuje v kontrolním experimentu bez lékové intervence u nositelů alely -203A diurnální variaci, zatímco u nositelů alely -203C nikoli. Rozdíly v diurnální variaci enzymové aktivity mohou přispět k vysvělení role polymorfismu CYP7A1 v regulaci cholesterolémie a její odpovědi na dietu.
Abstract v angličtině:
Abstract Most types of hypercholesterolemia are of polygenic origin. Some genes related to hypercholesterolemia are known, although all genes responsible for cholesterolemia regulation have not been characterised yet. To identify these new genes, animal models with spontaneous defects in cholesterol metabolism could be very useful. Moreover, a number of variations and polymorphisms have been found to influence blood cholesterol levels in humans. Some may also affect cholesterolemia responsiveness to dietary fat. The Prague hereditary hypercholesterolemic (PHHC) rat is a unique model of hypercholesterolemia induced by dietary cholesterol alone (without administration of cholic acid or thyrotoxic drugs). It exhibits modestly increased cholesterolemia when fed chow and responds to a diet containing cholesterol with a several-fold increase of cholesterolemia to concentrations comparable to those observed in hypercholesterolemic patients. Hypercholesterolemia in this model is characterised by accumulation of very low density lipoproteins (VLDL) and intermediate density lipoproteins (IDL) enriched by cholesterol. In an experiment with tyloxapol (an inhibitor of lipoprotein lipase) we found that PHHC rats on a cholesterol diet incorporated twice as much cholesterol into VLDL as Wistar rats, although liver cholesterol remained the same. When labelled with 125I, these cholesterol-rich VLDL of PHHC rats were catabolised in vivo more slowly than 125I-labelled VLDL of Wistar rats and accumulated in circulation. The increased incorporation of cholesteryl esters (CE) into VLDL in PHHC rats could not be explained by differences in acyl-CoA:cholesterolacyltransferase (ACAT) or microsomal triglyceride transfer protein (MTP) activities and gene expression. Furthermore, we found no differences between PHHC and Wistar rats in the response of the hepatic transcriptome (as determined using AffymetrixGeneChip® arrays) to dietary cholesterol. However, several genes were differently expressed between both strains, independent of diet. Of those, we studied Apof, Aldh1a7 and corresponding proteins in detail. We could not ascribe any role to these genes in hypercholesterolemia pathogenesis. We were able to explain the aetiology of hypercholesterolemia in the PHHC rat, although the related genetic defects need to be clarified. Cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1), a key regulatory enzyme in bile acid biosynthesis, plays an important role in cholesterolemia regulation. The -203A>C polymorphism (rs3808607) in the CYP7A1 gene (CYP7A1) promoter is involved in cholesterolemia determination and its responsiveness to diet. This polymorphism is in close linkage disequilibrium with the -469C>T polymorphism (rs3824260). Firstly, using dual luciferase assay, we demonstrated that expression of the -203C (-203C, -469T) allele was markedly increased compared to the -203A (-203A, -469C) allele, caused by the nucleotide in position -203. The alleles neither responded to stimulation with insulin nor PPARα agonists (WY-14643 or fenofibrate). Secondly, we analysed diurnal variation of CYP7A1 after enzyme activity upregulation (cholestyramine) and suppression (chenodeoxycholic bile acid, CDCA) in healthy men homozygous for the -203A or -203C allele. As expected, CYP7A1 activity was upregulated after treatment with cholestyramine and suppressed after treatment with CDCA. There were no differences between -203A and -203C homozygous subjects in the response of enzyme activity to both drugs. Importantly, in the control experiment, CYP7A1 in -203A allele carriers displayed diurnal variation, but not in -203C carriers. The differences in diurnal variations of enzyme activity may partly explain the role of the CYP7A1 polymorphism in the regulation of cholesterolemia and its responsiveness to diet.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Ing. Miluše Vlachová 3.33 MB
Stáhnout Příloha k práci Ing. Miluše Vlachová 7.27 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Ing. Miluše Vlachová 77 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Ing. Miluše Vlachová 78 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Ing. Miluše Vlachová 591 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Michal Vrablík, Ph.D. 232 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Ludmila Kazdová, CSc. 148 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 445 kB