velikost textu

Multiple regulatory roles of the transmembrane adaptor protein NTAL in gene transcription and mast cell physiology

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Multiple regulatory roles of the transmembrane adaptor protein NTAL in gene transcription and mast cell physiology
Název v češtině:
Regulační role transmembránového adaptorového proteinu NTAL v genové transkripci a fyziologii žírných buněk
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Iva Polakovičová, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Petr Dráber, DrSc.
Oponenti:
MUDr. Ladislav Vyklický, DrSc.
Ing. Jiří Hašek, CSc.
Id práce:
83901
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Imunologie (P1517)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
4. 12. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
ABSTRACT (CZ) Tato dizertační práce se zaměřuje především na pochopení regulačních úloh transmembránových adaptorových proteinů NTAL („non-T cell activation linker“) a PAG („phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains“) v aktivaci myších žírných buněk. V odborné literatuře existují protikladné studie o úloze proteinu NTAL v aktivační dráze vysoce afinního receptoru pro imunoglobulin E (IgE) (FcεRI). Studie prováděné na žírných buňkách připravených z myší s genovým knockoutem NTALu naznačují, že NTAL je negativní regulátor FcεRI signalizace, zatímco experimenty provedené na lidských žírných buňkách a buňkách bazofilní leukemie potkana s potlačenou expresí proteinu NTAL mu připisují pozitivní regulační roli. Abychom pochopili zapojení proteinu NTAL v FcεRI zprostředkované signalizaci v myších žírných buňkách a určili, zda různé metodiky delece NTALu mají různé fyziologické následky, použili jsme široké spektrum testů. Jako model jsme použili žírné buňky odvozené z kostní dřeně (BMMC) a připravili jsme BMMC z myší NTAL divokého typu („wild type“) a myší s genovým knockoutem NTALu. Pomocí lentivirových vektorů jsme transdukovali část buněk divokého typu vektorem nesoucím NTAL shRNA („short hairpin RNA“) pro generování buněk s potlačenou expresí NTALu („knockdown“) nebo prázdným vektorem pro přípravu negativní kontroly. Srovnání všech čtyř skupin připravených buněk v našich testech ukázalo, že oba typy NTAL-deficitních BMMC vykazovaly zvýšenou degranulaci, mobilizaci vápníku, chemotaxi, fosforylaci tyrosinu molekul LAT („linker for activation of T cells“) a ERK a depolymeraci filamentárního aktinu. Tyto výsledky prokazují, že NTAL je negativní regulátor FcεRI zprostředkovaných aktivačních dějů v myších BMMC a to nezávisle na případných kompenzačních mechanizmech během vývoje. Abychom získali další pohled na navazující signalizační děje související s proteinem NTAL, zabývali jsme se transkripčními profily získanými z aktivovaných a neaktivovaných všech čtyř typů připravených BMMCs. Prostřednictvím transkripční analýzy jsme identifikovali několik genů, které byly rozdílně regulované v neaktivovaných a antigenem aktivovaných kontrolních a NTAL-deficitních buňkách. Další rozbor ukázal, že se část těchto genů účastní regulace dějů závislých na cholesterolu v chemotaxi zprostředkované antigenem. Získaná data naznačují multiregulační úlohu proteinu NTAL v genové expresi a fyziologii žírných buněk. Dále jsme ukázali, že transmembránový adaptorový protein PAG má pozitivní i negativní regulační úlohu při aktivaci žírných buněk v závislosti na regulované signalizační dráze. Protože obě studie vyžadovaly provedení řady analýz genové exprese pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR), část experimentů byla věnována také vývoji nových reakčních směsí (tzv. master mixů) s akcentem na amplifikaci obtížně amplifikovatelných fragmentů DNA. Zjistili jsme, že zásadního zlepšení lze dosáhnout u směsí s přídavkem 1 M 1,2-propandiolu a 0,2 M trehalózy. Tato reakční směs je nyní komerčně dostupná. Na závěr jsme provedli recenzi nových přístupů k potlačení onemocnění zprostředkovaných žírnými buňkami nebo s nimi souvisejícími patologiemi. Hlavním zaměřením byly nedávno vyvinuté inhibitory intracelulárních signálních drah a jejich význam pro klinické studie.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT (EN) This thesis focuses mainly on understanding of the regulatory roles of the transmembrane adaptor proteins, non-T cell activation linker (NTAL) and phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), in murine mast cell signaling. There are conflicting reports on the role of NTAL in the high affinity immunoglobulin E receptor (FcεRI) activation pathways in mast cells. Studies carried out on mast cells prepared from NTAL knock-out mice have indicated that NTAL is a negative regulator of FcεRI signaling, whereas experiments performed on human mast cells and rat basophilic leukemia cells with silenced NTAL expression have suggested its positive regulatory role. To thoroughly examine the involvement of NTAL in FcεRI-mediated signaling events in mouse mast cells and to determine whether different methodologies of NTAL ablation have different physiological consequences, we utilized a broad range of assays. Using bone marrow-derived mast cells (BMMCs) as a model, we obtained cells from NTAL wild type and knock-out cells and using lentiviral delivery approach we transduced part of the wild type cells, with vector bearing NTAL shRNA or empty vector to generate NTAL knock-down cells and control cells, respectively. Comparison of all four groups of generated cells in our assays revealed that both types of NTAL-deficient BMMCs exhibited enhanced degranulation, calcium mobilization, chemotaxis, tyrosine phosphorylation of linker for activation of T cells (LAT) and ERK and depolymerization of filamentous actin. These data provide evidence that NTAL is a negative regulator of FcεRI activation events in murine BMMCs, independently of possible compensatory developmental alterations. To gain further insight into the downstream signaling activity of NTAL, we examined the resting and antigen-activated transcriptome profiles of all four types of generated BMMCs. Through this analysis we identified several genes that were differentially regulated in nonactivated and antigen-activated control and NTAL-deficient cells. Interestingly, a subset of these genes was involved in regulation of cholesterol-dependent events in antigen-mediated chemotaxis. The combined data indicate multiple regulatory roles of NTAL in gene expression and mast cell physiology. We have also shown that another transmembrane adaptor protein, PAG, has both positive and negative role in mast cell FcεRI-mediated activation depending on the signaling pathway involved. Since both studies demanded numerous quantitative real-time PCR examinations, part of the focus was also dedicated to development of new PCR master mixes suitable for amplification of difficult-to-amplify DNA fragments. We found excellent performance of a PCR mix supplemented with 1 M 1,2-propanediol and 0.2 M trehalose. This master mix is now also commercially available. Lastly, we have reviewed recent approaches towards inhibiting mast cell mediated events in diseases or with mast cell related pathology, with the main focus being on recently developed inhibitors of intracellular signaling pathways and their relevance to clinical trials.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Iva Polakovičová, Ph.D. 30.07 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Iva Polakovičová, Ph.D. 68 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Iva Polakovičová, Ph.D. 66 kB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Ladislav Vyklický, DrSc. 187 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Jiří Hašek, CSc. 150 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 182 kB