velikost textu

Karbocyklické analogy nukleosidů obsahující substituované bicyklické systémy.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Karbocyklické analogy nukleosidů obsahující substituované bicyklické systémy.
Název v angličtině:
Carbocyclic analogues of nucleosides containing substituted bicyclic systems.
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Michal Šála
Školitel:
Ing. Hubert Hřebabecký, CSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Miloslav Černý, DrSc.
prof. Ing. Jitka Moravcová, CSc.
Id práce:
83816
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra organické chemie (31-270)
Program studia:
Organická chemie (P1402)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
22. 6. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra organické chemie a jaderné chemie Karbocyklické analogy nukleosidů obsahující substituované bicyklické systémy Michal Šála Autoreferát disertační práce Praha 2010 Úvod Nukleosidové a nukleotidové analogy hrají velice důležitou roli ve všech biologických systémech. Z těchto důvodů jsou tyto látky v popředí zájmu zejména jako možná antivirotika a cytostatika. Nevýhodou derivátů přírodních nukleosidů je nestabilita N-glykosidické vazby mezi heterocyklickou bází a cukernou částí. Jednoduchá záměna furanosového kruhu za substituovaný uhlovodíkový zbytek zvýší odolnost těchto látek vůči enzymatické degradaci. Takto transformované deriváty se nazývají karbocyklické nukleosidy1 a mnoho látek z této skupiny vykazuje zajímavé antivirové vlastnosti. Byly připraveny i konformačně uzamčené karbocyklické nukleosidy. Velice dobře prozkoumanou skupinou derivátů jsou látky s bicyclo[3.1.0]hexanovým skeletem2. Nedávno byly popsány nukleosidové analogy, které místo cukerné části nesou substituovaný 2-oxabicyclo[2.2.1]heptanový skelet3, a které jsou považovány za prekurzory pro karbocyklické uzamčené nukleové kyseliny (cLNA). Základním cílem této disertační práce byla příprava biologicky účinných látek na bázi komponent nukleových kyselin. První část byla věnována syntéze konformačně uzamčených karbocyklických analogů nukleosidů odvozených od bicyclo[2.2.1]heptanu. Tyto látky byly původně cíleny pro základní testování biologické aktivity. V průběhu této práce bylo zjištěno, že mnoho látek připravených v naší laboratoři působí jako velice dobré inhibitory coxsackieviru B3 (Picornaviry). Tyto velice zajímavé předběžné výsledky odstartovaly program cíleného vývoje nových inhibitorů tohoto typů virů. Konformačně uzamčené karbocyklické nukleosidy První část práce je zaměřena na syntézu nových racemických konformačně uzamčených analogů nukleosidů, které mají jako pseudocukernou složku substituovaný bicyklo[2.2.1]hept- 2-enový nebo -heptanový skelet. Byly připraveny dvě série těchto látek s odlišnou orientací nukleobáze (syn a anti konfigurace). Na tyto látky lze pohlížet jako na karbapentofuranosové analogy nukleosidů přemostěné ethylenovou (-CH2CH2-) nebo vinylenovou (-CH=CH-) skupinou. Celá syntetická strategie vycházela z přípravy bicyklického skeletu s vhodně orientovanou aminoskupinou a následné výstavbě příslušné nukleobáze. Klíčovým meziproduktem pro přípravu řady syn-nukleosidů byl syn-amin 170, který byl dostupný ve třech krocích z diolu 98 (schéma 1). Dibenzoylderivát 109 reagoval s ethylazidoformiátem za vzniku triazolinových meziproduktů 167x a 167y. Reakční směs byla bez čištění a separace převedena působením silikagelu v dichlormethanovém roztoku na směs žádaného karbamátu - produkt 168 a aziridinového derivátu 169 v poměru 2:3 v celkovém výtěžku 80%. Karbamát 168 vzniká Wagner-Meerweinovým přesmykem. Látky 168 a 169 lze snadno separovat sloupcovou chromatografií. Volný amin 170 byl uvolněn z látky 168 zahříváním k varu ve směsi ethanol-voda v přítomnosti silné báze (KOH). Na volné aminoskupině byl následně vystavěna thyminová báze (171). Získaný nenasycený nukleosid 171 byl dále hydrogenací (Pd(OH)2/C, methanol-voda) převeden na nasycený derivát 172. COOEt RO b RO N RO N N N RO RO N RO N EtOOC 98, R = H a 109, R = Bz 167x 167y NHCOOEt c BzO NHCOOEt BzO BzO BzO 168 169 d O NH HO N HO NH2 e O HO 170 HO 171 f O O NH NH HO N COOEt O EtO HO 172 95 Schéma 1. a) BzCl, pyridin, r.t., 91%; b) ethylazidoformiát, toluen, 6 h, 80 °C; c) silikagel, CH2Cl2, 2 h, 33% pro 168, 47% pro 169; d) KOH, EtOH-H2O, reflux, 14 h, 83%; e) 1. 1,4-dioxan, 100 °C, 3 h, 2. Dowex 50 (H+ cyklus), 1,4-dioxan, 100 °C, 2.5 h, 50%; f) H2, Pd(OH)2/C , MeOH-H2O, 3 d, 71%. Amin 170 byl také použit pro přípravu nukleosidů s purinovou bází (schéma 3). Sledem dříve popsaných reakcí s 5-amino-4,6-dichlorpyrimidinem v ethanolu za přítomnosti triethylaminu byl připraven pyrimidinový intermediát 173. Imidazolový kruh purinové báze byl poté uzavřen reakcí s triethylorthoformiátem v přítomnosti kyseliny chlorovodíkové. Poloha 6 na purinovém skeletu byla následně derivatizována. Byl připraven adeninový derivát 175 a cyklopropylaminoderivát 176. Oba dva takto získané deriváty 175 a 176 byly následně hydrogenovány na nasycené analogy 177 a 178 ve vynikajících výtěžcích. H2N Cl H HO NH2 a HO N b N HO N HO 170 173 N X N X HO N e HO N N N N N HO HO 174, X = Cl 175, X = NH2 c 177, X = NH2 d 176, X = NH 178, X = NH Schéma 2. a) 4,6-dichlorpyrimidin-5-amin, Et3N, EtOH, 100 °C, 6 d, 97%; b) 1. HC(OEt)3, HCl, 3 d 2. HCl, THF-H2O, 4 h, 79%; c) NH3 (l), 75 °C, 2 d, 95%; d) cyclopropylamin, MeOH, r.t., přes noc, 92%; e) H2, Pd(OH)2/C , MeOH-H2O, 87% pro 177, 85% pro 178. Deriváty guanosinu byly připraveny obdobným způsobem (schéma 3). Reakcí aminu 170 s 2,5-diamino-4,6-dichlorpyrimidinem a uzavřením imidazolového kruhu triethyl- orthoformiátem v kyselém prostředí byl získán purinový derivát 179, ze kterého byly modifikací polohy 6 na purinovém skeletu získány guaninový derivát 180 a cyklo- propylaminoderivát 181. Dvojná vazba v obou derivátech byla následně hydrogenována za použití hydroxidu palladnatého. Tímto způsobem byly připraveny nasycené analogy 182 a 183 ve velmi dobrých výtěžcích. Schéma 3. a) 1. 4,6-dichlorpyrimidin-2,5-diamin, Et3N, EtOH, 100 °C, 6 d, 2. HC(OEt)3, HCl, 4 d, 3. HCl, THF- H2O, 4 h, 79%; b) CF3COOH, H2O, 3 d, 94%; c) cyclopropylamin, MeOH, přes noc, 94%; d) H2, Pd(OH)2/C, DMF, 87% pro 182, MeOH-H2O, 80% pro 183. Dále byly připraveny další typy syn-nukleosidů, které nesly na bicyklickém skeletu pouze jednu hydroxymethylovou nebo hydroxylovou skupinu. Tyto látky byly syntetizovány zcela obdobným postupem. Pro syntézu cílových látek s nukleobází na bicyklickém skeletu v pozici 7 a s konfigurací anti byla rovněž klíčová příprava aminu 212 (schéma 4), který byl získán v šesti krocích z 5,5- dimethoxy-1,2,3,4-tetrachlorcyklopentadienu 206. Tento cyklopentadienový derivát poskytl sledem reakcí diol 207. Atomy chloru byly snadno odstraněny sodíkem v kapalném amoniaku a volné hydroxylové funkce byly chráněny benzoylací. Keton 209 byl připraven deketalizací (Dowex 50, H+ cyklus) ve směsi dioxan-voda a byl následně redukován na hydroxyderivát 210. V reakční směsi byl nalezen pouze jeden z možných izomerů a to ten s konfigurací anti. Přítomnost pouze jednoho produktu lze vysvětlit stérickým bráněním, které znemožnilo přístup redukčního činidla ze směru hydroxymethylového substituentu. Závěrečným krokem pro zavedení chráněné aminoskupiny byla Ritterova reakce spočívající v reakci alkoholu s acetonitrilem jako zdrojem dusíku. Ritterova reakce proběhla s retencí konfigurace za vzniku acetamidu 211. Volný amin 212 byl následně uvolněn za bazických podmínek (KOH) za refluxu ve směsi voda-ethanol. MeO OMe MeO OMe MeO OMe Cl Cl Cl C a l b c HO BzO Cl Cl Cl Cl HO BzO 206 207 208 O HO AcHN BzO d BzO e BzO f BzO BzO BzO 209 210 211 H2N HO NH2 HO HO HO 212 Schéma 4. a) 1. akrolein, 55 °C, 8 h, 2. aq. HCHO, NaOH, 55 °C, 4 h, 3. NaBH4, MeOH, přes noc, 82%; b) 1. Na, NH3 (l), THF-EtOH, -45 °C, 2. BzCl, pyridin, přes noc, 78 %; c) Dowex 50 (H+ cyklus), 1,4-dioxan-voda, reflux, 10 h, 75%; d) NaBH4, THF- H2O, 0 °C, 30 min, 88%; e) CH3CN, H2SO4-AcOH, r.t., 1 h, 84%; f) KOH, EtOH-H2O, reflux, 9 h, 90%. Amin 212 byl poté využit při výstavbách heterocyklických bází (schéma 5). Byl připraven thyminový analog 213, 6-chlorpurinový analog 214 a 2-amino-6-chlorpurinový analog 215. Pozice 6 na purinovém skeletu byla následně modifikována a byl získán adeninový derivát 216 a dva cyklopropylderiváty 217 a 218 ve vysokých výtěžcích. Schéma 5. a) 1. 95, 1,4-dioxan, 100 °C, 3 h, 2. Dowex 50 (H+ cyklus), 1,4-dioxan, 100 °C, 2.5 h, 55%; b) 1. 4,6- dichlorpyrimidin-5-amin, Et3N, EtOH, 100 °C, 6 d, 2. HC(OEt)3, HCl, 2 d, 3. HCl, THF-H2O, 3 h, 63%; c) 1. 4,6-dichlorpyrimidin-2,5-diamin, Et3N,EtOH, 100 °C, 6 d, 2. HC(OEt)3, HCl, 5 d 3. HCl, THF-H2O, 4 h, 67%; d) NH3 (l), 75 °C, 2 d, 91%; e) cyklopropylamin, MeOH, přes noc, 92% pro 217, 80% pro 218. Dvojná vazba v těchto látkách byla poté zpracována na dva typy dalších derivátů (schéma 6). Nasycené nukleosidy 219, 220, 221, 222 byly připraveny hydrogenací na hydroxidu palladnatém. Další reakcí na dvojné vazbě byla její cis-hydroxylace oxidem osmičelým, která poskytla cis-dioly 223, 224, 225, 226. Pro regeneraci oxidu osmičelého do katalytického cyklu byl použit N-methylmorfolin-N-oxid. O O NH NH HO HO N O N O HO a nebo b HO R R 213 219, R = H 223, R = OH X X Y=H N N N 220, X = NH2, R = H N 224, X = NH2, R = OH HO HO N N N Y N Y 221, X = NH ,R=H 225, X = NH , R = OH HO a nebo b HO R Y = NH2 R 216, X = NH2, Y = H 222, X= NH ,R=H 217, X = NH ,Y=H 226, X= NH , R = OH 218, X= NH , Y = NH2 Schéma 6. a) H2, Pd(OH)2/C, MeOH-H2O; b) OsO4, NMMO, aceton-H2O. Látky s tricyklickým systémem byly připraveny také z chráněného amidu 211 (schéma 7). Dvojná vazba byla epoxidována m-chlorperoxybenzoovou kyselinou a vzniklý oxiran 227 byl intramolekulárně otevřen během debenzoylace při mírných bazických podmínkách (K2CO3). Amin 228 byl poté získán bazickou hydrolýzou hydroxidem draselným. Obecnými postupy byly následně vystavěny nukleosidy 229, 230 a cyklopropylový analog 231. AcHN AcHN H2N HO NH2 a O b OH BzO BzO HO BzO O BzO O OH 211 227 228 O NH HO N O c O HO NH2 OH 229 Cl HN N N N N O OH HO N HO N N N 228 d e O O OH OH 230 231 Schéma 7. a) mCPBA, CH2Cl2, přes noc, kvant..; b) 1. K2CO3, MeOH, 2. KOH, EtOH-H2O, reflux, 9 h, 85%; c) 1. 95, 1,4-dioxan, 100 °C, 3h, 2. Dowex 50 (H+ cyklus), 1,4-dioxan, 100 °C, 2.5 h, 56%; d) 1. 4,6- dichlorpyrimidin-5-amin, Et3N, EtOH, 100 °C, 6 d, 2. HC(OEt)3, HCl, 2 d, 2. HCl, THF-H2O, 3 h, 30%; e) cyklopropylamin, MeOH, přes noc, 92%. Struktura látek byla potvrzena pomocí NMR spektroskopie. Skutečnost, že při Ritterově reakci se zachovává konfigurace (anti), byla potvrzena pomocí NOE spektroskopie. Na obr. 1 jsou znázorněny NOE interakce u obou (syn/anti) chlorpurinových derivátů 174 a 214. V případě syn-nukleosidu 174 byla nalezena interakce mezi protonem H-8´ (8,47 ppm) a protony na dvojné vazbě H-5 (6,02 ppm) a H-6 (6,07 ppm), zatímco u anti-izomeru 214 byla pozorována pouze korelace k protonu H-3exo (1,85 ppm) na bicyklickém skeletu. Obr. 1. Důležité NOE interakce u analogů 174 and 214. Druhá část projektu syntézy karbocyklických nukleosidů se zabývá látkami s vicinálním uspořádáním nukleobáze a hydroxymethylové skupiny. Thyminové deriváty byly připraveny Michaelovou adicí nukleobáze na aktivovanou dvojnou vazbu (schéma 8). Jako báze byl použit DBU nebo K2CO3. V obou případech byly v reakční směsi nalezeny pouze produkty v konfiguraci trans. Tyto izomery 233a a 233b byly separovány sloupcovou chromatografií. Výtěžek a poměr těchto dvou izomerů závisel na použité bázi. V případě DBU byl poměr 233a/233b 3,5:1, zatímco při reakci s K2CO3 byl tento poměr prakticky obráceně - 1:2,5. Tato metoda se však neukázala vhodná pro použití u purinových bází. Adicí solí adeninu, N6- benzoyladeninu a 6-chlorpurinu vznikaly složité reakční směsi. O O NH NH N N a O O COOMe COOMe COOMe 232 233a 233b Schéma 8. a) Metoda I: thymin, DBU, DMF, 75 °C, 72 h, 35% pro 233a, 10% pro 233b; a) Metoda II: thymin, K2CO3, DMF, 75 °C, 72 h, 16% pro 233a, 10% pro 233b. Cílové thyminové nukleosidy byly připraveny pomocí standardních postupů (schéma 9). Esterová skupina u nenasycených esterů 233a a 233b byla redukována na hydroxymethylové deriváty 236a a 236b lithiumaluminiumhydridem v tetrahydrofuranu při laboratorní teplotě. Nasycené nukleosidy 237a a 237b byly připraveny ve dvou krocích. Nejprve byla dvojná vazba hydrogenována na hydroxidu palladnatém a následně byla esterová skupina redukována pomocí lithiumaluminiumhydridu za stejných podmínek jako v případě nenasycených analogů. Cis-hydroxy deriváty 235a a 235b byly připraveny pomocí katalytické dihydroxylace s oxidem osmičelým v přítomnosti N-methylmorfolin-N-oxidu jako reoxidovadla. Cílové nukleosidy 238a a 238b byly poté připraveny redukcí stejným způsobem jako nenasycené deriváty. Schéma 9. a) H2, Pd(OH)2/C, MeOH-H2O, 86% pro 234a, 84% pro 234b; b) OsO4, NMMO, aceton-H2O, 98% pro 235a, 91% pro 235b; c) LiAlH4, THF, r.t., 54% pro 236a, 69% pro 236b 55% pro 237a, 70% pro 237b, 39% pro 238a, 58% pro 238b. Vzhledem k neúspěchu při zavádění purinových bází Michaelovou adicí bylo nutno najít jiný postup. Byla opět zvolena strategie postupné výstavby purinové báze na odpovídající aminoskupině. Jako další metoda pro zavedení aminoskupiny na skelet byl zvolen Curtiův přesmyk (Schéma 10). Výchozí látka - monoethylester kyseliny fumarové 239 - byl zahříván s cyklopentadienem v dioxanu na 60 °C (schéma 11). Získané kyseliny reagovaly s jódem v bazickém prostředí a došlo k intramolekulárnímu uzavření laktonového cyklu. Byly získány dva produkty - kyselina 240a a ester 240b. Směs látek bylo možné separovat na základě jejich acidobazických vlastností. Oba tyto deriváty bylo poté převedeny na aminoalkoholy 242a a 242b ve čtyřech krocích zahrnujících Curtiův přesmyk, obnovení dvojné vazby na skeletu, redukci esterové funkce na hydroxymethyl. Pro tyto oba izomery bylo použito rozdílné pořadí jednotlivých reakčních kroků (schéma 10). Volné aminy 242a a 242b nebyly plně charakterizovány a byly rovnou použity pro výstavbu cílových nukleosidů. Plně charakterizovány byly až triacetylderiváty 243a a 243b. Standardními postupy byly připraveny nenasycené, nasycené a cis-hydroxylované analogy nukleosidů. Schéma 10. a) 1. cyklopentadien, 1,4-dioxan, 60 °C, 1 h, 2. I2, KI, Na2CO3, H2O-CHCl3, r.t., přes noc, 31% pro 240a, 41% pro 240b; b) 1. ClCOOEt, Et3N, aceton, 0 °C, 1 h, 2. NaN3, H2O-aceton, 0°C, 1 h, 3. toluen, t-BuOH, reflux, 4 h, 51%; c) Zn, EtOH, reflux, 1 h, quant.; d) 1. Zn, EtOH, reflux, 2 h, 2. HCl, MeOH, 4 d 3. LiAlH4, THF, reflux, 12 h, 61%; e) 1. ClCOOEt, Et3N, aceton, 0 °C, 1 h, 2. NaN3, H2O-aceton, 0 °C, 1 h, 3. toluen, aq. HCl, reflux, 13 h; 4. LiAlH4, THF, reflux, 12 h, 67%; f) Ac2O, pyridin, r.t., 80% pro 243a, 92% pro 243b. Žádný z připravených nukleosidů z této části práce nevykazoval signifikantní hodnoty biologické aktivity. Inhibitory replikace viru coxsackie B3 Tento projekt se zabýval hledáním dalších inhibitorů coxsackieviru B3. Byly připraveny dvě skupiny derivátů. První z nich se skládá z látek majících 6-chlorpurin substituovaný v poloze 9 různými karbocyklickými systémy. Do druhé skupiny patří látky získané modifikací základní látky 251b v purinové časti molekuly (v polohách 2, 6, 8). Všechny látky zobrazené na obr. 2 byly připraveny Mitsunobuovou reakcí, která poskytovala výtěžky v rozmezí 14% až 78% . Tato reakce poskytovala pouze N9 izomery s bází v poloze exo na karbocyklickém skeletu. V některých případech bylo jednodušší zavedení aminoskupiny než hydroxyskupiny na skelet. Purinová báze byla následně vystavěna na této aminoskupině (obr. 3). Obr. 2. Látky připravené Mitsunobuovou reakcí. B = 6-chlorpurin-9-yl. Obr. 3. Látky připravené konstrukcí nukleobáze. B = 6-chlorpurin-9-yl. Látky substituované na bicyklickém skeletu (např. hydroxyskupina, fluor, ketoskupina atd.) rozšířily naší knihovnu inhibitorů coxsackieviru B3 a jsou zobrazeny na obr. 4. Tyto látky byly většinou připraveny postupnou syntézou zahrnující Mitsunobuovu reakci pro zavedení 6- chlorpurinu do molekuly. Důležitým poznatkem v těchto syntézách bylo vypracování debenzoylačního kroku v přítomnosti 6-chlorpurinu v molekule. Optimalizovali jsme popsanou metodu4 použitím přebytku methylmagnesiumchloridu jako debenzoylačního činidla v tetrahydrofuranu při 0 °C. Výtěžky tohoto kroku se pohybovaly v rozmezí 35-75%. HO B B B HO B B O B B HO O HO HO O 272 273 HO 277 285 286 287 288 B B F B B F B B B F F HO OH F F F 293 289 290 291 292 294 301 PhO B B B B B B B PhO B 302 303 304 305 307 B 308 B B O B B B O HO HO 316 326 O O HO 334 HO 333 Obr. 4. Látky s modifikací v bicyklickém skeletu. B = 6-chlorpurin-9-yl. Druhá část projektu hledání nových inhibitorů coxsackieviru B3 je zaměřena na studium vlivu substitutce na purinové části molekuly. V polohách 2,6,8 na purinovém skeletu byla modifikována základní látka 251b, která je snadno dostupná, dostatečně aktivní, zároveň je bicyklický substituent značně chemicky inertní a není proto třeba na něj brát zřetel při plánování syntéz. Většina látek byla získána pouhou modifikací základní látky 251b běžnými a známými metodami (nukleofilní aromatická substituce, kaplingové reakce nebo vzájemná přeměna těchto funkčních skupin mezi sebou). Vzorce připravených látek jsou zobrazeny na obr. 5, 6 a 7. Obr. 5. Modifikace v purinové části, poloha 6. Cl Cl Cl Cl N N N N N N N N N N NH2 N N Cl N N F N N I R R R R 353 354 355 356 Cl Cl N N N N N N R= N N N N NO2 N N Cl R R R 357 358 371 Obr. 6. Modifikace v purinové části, poloha 2. Obr. 7. Modifikace v purinové části, poloha 8. Testování těchto připravených látek proti coxsackieviru B3 poskytlo zajímavé výsledky. Většina z připravených látek vykazovala proti tomuto viru signifikantní hodnoty antivirové aktivity a zároveň velmi nízkou cytotoxicitu k Vero buňkám, na kterých bylo testování prováděno. Velmi dobré výsledky poskytovaly zvláště látky nesoucí 6-chlorpurin jako nukleobázi. Modifikace v purinové části molekuly vedly k poklesu antivirové aktivity daných látek oproti původní látce 251b, pouze látka mající p-chlorfenylovou skupinu v poloze 6 vykazovala srovnatelnou hodnotu EC50 (0.87±0.41 µM). Z těchto výsledků je zřejmé, že přítomnost 6-chlorpurinové báze je esenciální pro aktivitu proti coxsackieviru B3. Několik látek z této řady inhibovalo replikaci coxsackieviru B3 v rozmezí hodnot EC50 0.66 µM - 2 µM. Zároveň jsou tyto výsledky srovnatelné nebo u některých derivátů lepší než u známého inhibitoru TTP-83075. Sloučeniny 251b (EC50 = 0.81±0.20 µM) a 259b (EC50 = 0.66±0.35 µM) jsou nejlepšími inhibitory z této série. Studie vedoucí k určení mechanismu jejich působení jsou předmětem dalšího výzkumu. Cytotoxicita k Vero buňkám byla nalezena u tří látek (261b, 262b, 309) ze skupiny sloučenin s modifikovaným bicyklickým systémem, více cytotoxických látek bylo nalezeno ve skupině derivátů s modifikovaným purinem (335, 337, 354, 355, 356, 358, 362). Jejich cytotoxické a eventuálně cytostatické vlastnosti budou dále studovány. Závěr V první části předkládané práce byly připraveny tři řady nukleosidových analogů odvozených od různě substituovaného bicyklo[2.2.1]heptanového skeletu jako konformačně uzamčených karbocyklických nukleosidů - dvě řady izomerních látek (syn a anti) s nukleobází vázanou v poloze 7 bicyklického systému, jedna řada s nukleobází umístěnou v poloze 2. Klíčovým krokem syntetických postupů bylo zavedení vhodně orientované aminoskupiny na bicyklický skelet pro finální výstavbu nukleobáze. Byly použity tři základní metody. Syn-nukleosidy byly získány kysele katalyzovaným Wagner-Meerweinovým přesmykem produktů získaných reakcí mezi dvojnou vazbou bicyklického skeletu a ethylazidoformiátem. Pro přípravu anti- nukleosidů byla využita Ritterova reakce mezi hydroxyskupinou v poloze 7 na bicyklickém systému a acetonitrilem za kyselé katalýzy, která probíhala s retencí konfigurace a mohla tak být zajištěna konfigurace anti pro cílové nukleosidy. Poslední strukturní typ s vicinálním uspořádáním nukleobáze a hydroxymethylové funkce byl získán v případě thyminových nukleosidů Michaelovskou adicí sodné soli thyminu na dvojnou vazbu konjugovanou s esterovou skupinou. Vzhledem k tomu, že tento postup v řadě purinových derivátů selhal, musely být purinové nukleosidy postupně vystavěny. Aminoskupina byla v tomto případě na norbornanovém skeletu připravena Curtiovým přesmykem ve velice dobrých výtěžcích. Látky z této první části při antivirových a cytostatických testech nevykazovaly žádnou biologickou aktivitu. Druhá část práce byla věnována syntéze nových inhibitorů coxsackieviru B3. Nejprve byla studována závislost antivirové aktivity na 6-chlopurinových derivátech modifikovaných na karbocyklickém skeletu. 6-Chlopurin byl zaváděn na skelet převážně Mitsunobuovou reakcí s příslušnými bicyklickými alkoholy a to v dobrých výtěžcích. V několika případech bylo synteticky jednodušší vystavět 6-chlorpurin na aminoskupině. Vzájemnými transformacemi jednotlivých funkčních skupin na bicyklickém skeletu byla dále knihovna derivátů rozšířena (OH, F, ketoskupina, nasycený, nenasycený skelet atd.). Paralelně s touto studií byla studována antivirová aktivita v závislosti na substituci v purinové části molekuly. U vybrané látky 251b byly různě modifikovány polohy 2, 6, 8 na purinové bázi. Zde se ukázalo, že žádná modifikace nevedla k lepší hodnotě EC50 než jakou měla původní látka 251b, naopak většina připravených látek nebyla vůbec aktivní. Mnoho z připravených cílových látek mělo hodnotu EC50 srovnatelnou se známým inhibitorem TTP-8307. Dvě nejlepší struktury 251b (EC50 = 0.81±0.20 µM) a 259 (EC50 = 0.66±0.35 µM) budou dále studovány a podrobeny testům proti dalším virům z čeledi picornavirů.
Abstract v angličtině:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Organic and Nuclear Chemistry Carbocyclic analogues of nucleosides containing substituted bicyclic systems Michal Šála Ph.D. Thesis Abstract Prague 2010 Introduction Nucleoside and nucleotide analogues are of fundamental importance for all organisms. Therefore, nucleoside analogues are interesting target for drug discovery and development, mainly as potential antiviral and antitumor agents. A crucial disadvantage of natural nucleosides analogues is cleavage of the N-glycosidic bond by phosphorylases. Modification which increases resistance against enzymatic degradation is substitution of the sugar moiety furanose ring by a hydrocarbon ring. Many of such modified analogues – carbocyclic nucleosides1 – exhibit interesting antiviral activity. Several analogues containing conformationally locked bicyclic systems were also synthesized. Well known are carbocylic nucleosides with a fused cyclopropane moiety2 (bicyclo[3.1.0]hexane). Recently, novel conformationally locked carbocyclic nucleosides based on 2-oxabicyclo[2.2.1]heptane ring system were described3 (as precursors for carbocyclic locked nucleic acids). This thesis concerns the synthesis of biologically active compounds related to the carbocyclic nucleoside analogues. First part of the work is devoted to the synthesis of the conformationally locked carbocyclic nucleosides derived from bicyclo[2.2.1]heptane. These compounds were primarily designed for general biological activity screening. In the course of this work, compounds produced in our laboratory showed interesting antiviral properties against coxsackievirus B3 (Picornaviridae). These very promising findings of the preliminary biological tests led us to start the program targeted on development of novel coxsackievirus B3 inhibitors. Carbocyclic conformationally locked nucleosides First part of this chapter attends to a synthesis of novel racemic conformationally locked nucleoside analogues with bicyclo[2.2.1]hept-2-ene or -heptane ring substituted with nucleobase at the position 7 of the bicyclic scaffold (two series, syn and anti isomers). These bicyclic compounds could be considered as the conformationally locked carbapentofuranose nucleoside analogues. The synthetic strategy was based on construction of the nucleobases at the amino group of an appropriate aminobicycloalkene. The key intermediate in the synthesis of the syn-nucleosides was syn-amine 170 which was prepared in three simple steps from the commercially available bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,2-dimethanol (98) (Scheme 1). The dibenzoyl derivative 109 was treated with ethyl azidoformate and intermediate triazoline derivatives 167x and 167y were cleaved without isolation with silica gel (Wagner-Meerwein rearrangement). This reaction afforded a mixture of carbamates 168 and 169 (2:3) which were easily separated by chromatography on a silica gel column. Free amine 170 was obtained in a good yield by deprotection with potassium hydroxide. Thymine nucleoside 171 was prepared in a moderate yield by reaction of amine 170 with carbamate 95 in 1,4-dioxane at 100 °C and following pyrimidine ring closure catalyzed with Dowex 50. Saturated nucleoside 171 was obtained by hydrogenation using palladium(II) hydroxide as a catalyst. COOEt RO b RO N RO N N N RO RO N RO N EtOOC 98, R = H a 109, R = Bz 167x 167y NHCOOEt c BzO NHCOOEt BzO BzO BzO 168 169 d O NH HO N HO NH2 e O HO 170 HO 171 f O O NH NH HO N COOEt O EtO HO 172 95 Scheme 1. a) BzCl, pyridine, r.t., 91%; b) ethyl azidoformate, toluene, 6 h, 80 °C; c) silicagel, CH2Cl2, 2 h, 33% for 168, 47% for 169; d) KOH, EtOH-H2O, reflux, 14 h, 83%; e) 1. 1,4-dioxane, 100 °C, 3 h, 2. Dowex 50 (H+ cycle), 1,4-dioxane, 100 °C, 2.5 h, 50%; f) H2, Pd(OH)2/C, MeOH-H2O, 3 d, 71%. Amine 170 was also treated with 4,6-dichloropyrimidine-5-amine in ethanol in the presence of triethylamine (Scheme 2) and the purine ring was subsequently closed with triethyl orthoformate in the presence of concentrated hydrochloric acid to give 6-chloropurine derivative 174. Finally, position 6 of the purine ring was derivatized by ammonolysis (175) and nucleophilic substitution of the chlorine atom with cyclopropylamino group (176). Both unsaturated nucleosides were hydrogenated to give saturated nucleosides 177 and 178. H2N Cl H HO NH2 a HO N b N HO N HO 170 173 N X N X HO N e HO N N N N N HO HO 174, X = Cl 175, X = NH2 c 177, X = NH2 d 176, X = NH 178, X = NH Scheme 2. a) 4,6-dichlorpyrimidine-5-amine, Et3N, EtOH, 100 °C, 6 d, 97%; b) 1. HC(OEt)3, HCl, 3 d 2. HCl, THF-H2O, 4 h, 79%; c) NH3 (l), 75 °C, 2 d, 95%; d) cyclopropylamine, MeOH, r.t., overnight, 92%; e) H2, Pd(OH)2/C , MeOH-H2O, 87% for 177, 85% for 178. Amine 170 was coupled with 4,6-dichloropyrimidine-2,5-diamine in the presence of triethylamine in ethanol, the obtained intermediate was treated with triethyl orthoformate and concentrated hydrochloric acid to give 2-amino-6-chloropurine nucleoside 179 (Scheme 3). The nucleoside analogue 179 was converted to guanine compound 180 by treatment with trifluoroacetic acid. The reaction of 179 with cyclopropylamine in methanol afforded compound 181. Saturated derivatives 182 and 183 were prepared by hydrogenation. Scheme 3. a) 1. 4,6-dichlorpyrimidine-2,5-diamine, Et3N, EtOH, 100 °C, 6 d, 2. HC(OEt)3, HCl, 4 d, 3. HCl, THF-H2O, 4 h, 79%; b) CF3COOH, H2O, 3 d, 94%; c) cyclopropylamine, MeOH, overnight, 94%; d) H2, Pd(OH)2/C, DMF, 87% for 182, MeOH-H2O, 80% for 183. Synthesis of other syn-nucleosides (without any substitution or bearing only one hydroxymethyl or hydroxy group) was realized in similar way as described above. Also, the synthesis of the anti-nucleosides was based on the construction of nucleobases at the amino group (Scheme 4). Anti-amine 212 was prepared in six steps, starting from commercially available 1,2,3,4-tetrachloro-5,5-dimethoxycyclopentadiene 206. The chlorocyclopentadiene 206 was treated with acrolein, and the Diels-Alder intermediate - formyl derivative - was reacted with formaldehyde under basic conditions (NaOH) to yield the dihydroxymethyl derivative 207. Chlorine atoms were removed with sodium in liquid ammonia, and the free hydroxy groups were immediately protected by benzoylation. Ketone 209 was then prepared by deketalization (Dowex 50, H+ cycle) in refluxing dioxane-water mixture. Reduction of the keto group was achieved by reaction with sodium borohydride in mixture of tetrahydrofuran and water. Due to the steric hindrance (hydroxymethyl group against double bond) only one isomer (anti) was obtained in very good yield. Finally, protected amino group was introduced by Ritter reaction with retention of the configuration. The free amine 212 was finally released by basic deprotection (KOH). MeO OMe MeO OMe MeO OMe Cl Cl Cl C a l b c HO BzO Cl Cl Cl Cl HO BzO 206 207 208 O HO AcHN BzO d BzO e BzO f BzO BzO BzO 209 210 211 H2N HO NH2 HO HO HO 212 Scheme 4. a) 1. acrolein, 55 °C, 8 h, 2. aq. HCHO, NaOH, 55 °C, 4 h, 3. NaBH4, MeOH, overnight, 82%; b) 1. Na, NH3 (l), THF-EtOH, -45 °C, 2. BzCl, pyridine, overnight, 78 %; c) Dowex 50 (H+ cycle), 1,4-dioxane-water, reflux, 10 h, 75%; d) NaBH4, THF- H2O, 0 °C, 30 min, 88%; e) CH3CN, H2SO4-AcOH, r.t., 1 h, 84%; f) KOH, EtOH-H2O, reflux, 9 h, 90%. Amine 212 was then used for the construction of target compounds (Scheme 5) by the same procedures as in the case of the syn-nucleosides. The double bond in each of the nucleosides 213, 216, 217, 218 was utilized in two ways (Scheme 6). Saturated compounds 219, 220, 221, 222 were obtained after hydrogenation over palladium hydroxide on charcoal. The compounds 223, 224, 225, and 226 with two cis-hydroxy groups were prepared by osmium tetroxide catalyzed cis-hydroxylation in an acetone-water mixture with N-methylmorpholine- N-oxide (NMMO) as a recovering agent for osmium catalytic cycle. Scheme 5. a) 1. 95, 1,4-dioxane, 100 °C, 3 h, 2. Dowex 50 (H+ cycle), 1,4-dioxane, 100 °C, 2.5 h, 55%; b) 1. 4,6-dichlorpyrimidine-5-amine, Et3N, EtOH, 100 °C, 6 d, 2. HC(OEt)3, HCl, 2 d, 3. HCl, THF-H2O, 3 h, 63%; c) 1. 4,6-dichlorpyrimidine-2,5-diamine, Et3N,EtOH, 100 °C, 6 d, 2. HC(OEt)3, HCl, 5 d 3. HCl, THF-H2O, 4 h, 67%; d) NH3 (l), 75 °C, 2 d, 91%; e) cyclopropylamine, MeOH, overnight, 92% for 217, 80% for 218. O O NH NH HO HO N O N O HO a or b HO R R 213 219, R = H 223, R = OH X X Y=H N N N 220, X = NH2, R = H N 224, X = NH2, R = OH HO HO N N N Y N Y 221, X = NH ,R=H 225, X = NH , R = OH HO a or b HO R Y = NH2 R 216, X = NH2, Y = H 222, X= NH ,R=H 217, X = NH ,Y=H 226, X= NH , R = OH 218, X= NH , Y = NH2 Scheme 6. a) H2, Pd(OH)2/C, MeOH-H2O; b) OsO4, NMMO, acetone-H2O. Compounds with a tricyclic skeleton were synthesized starting from the protected amide 211 (Scheme 7). This compound was treated with m-chloroperbenzoic acid in dichloromethane and the epoxide 227 afforded the amine 228 by means of intramolecular oxirane ring opening under mild basic conditions (deprotection of the benzoyl groups by potassium carbonate). After that, acetyl protecting group was removed by potassium hydroxide. Nucleosides 229, 230, 231 were prepared starting from amine 228, using the same procedures as described above. AcHN AcHN H2N HO NH2 a O b OH BzO BzO HO BzO O BzO O OH 211 227 228 O NH HO N O c O OH HO NH2 229 O OH Cl HN N N N 228 N HO N HO N N N d e O O OH OH 230 231 Scheme 7. a) mCPBA, CH2Cl2, overnight, quant.; b) 1. K2CO3, MeOH, 2. KOH, EtOH-H2O, reflux, 9 h, 85%; c) 1. 95, 1,4-dioxane, 100 °C, 3h, 2. Dowex 50 (H+ cycle), 1,4-dioxane, 100 °C, 2.5 h, 56%; d) 1. 4,6- dichlorpyrimidine-5-amine, Et3N, EtOH, 100 °C, 6 d, 2. HC(OEt)3, HCl, 2 d, 2. HCl, THF-H2O, 3 h, 30%; e) cyclopropylamine, MeOH, overnight, 92%. The relative configuration (syn/anti) at the position 7 was confirmed by NOE experiment (compounds 174 and 214). For 174, a correlation was found between proton H-8´ (8.47 ppm) and protons H-5 (6.02 ppm) and H-6 (6.07 ppm) indicating syn-position of the nucleobase, while for 214, interaction between proton H-8´ (8.76 ppm) and proton H-3exo (1.85 ppm) indicating anti-position of the nucleobase was observed (Fig. 1). Fig. 1. Important NOE interactions in compounds 174 and 214. Second part of the carbocyclic nucleoside project concerns the synthesis of the compounds with vicinal position of the nucleobase and hydroxymethyl group. Synthetic strategy was originally based on Michael addition of the nucleobase to the activated double bond. Addition of thymine to ester 232 in the presence of the base (DBU, K2CO3) gave moderate yields of isomers 233a and 233b (Scheme 8). Only isomers with trans configuration were observed in the reaction mixture and these were easily separated by column chromatography. The ratio of the exo-233a and endo-233b depended on the used base. In the case of DBU the ratio 233a/233b was 3.5:1, whereas when potassium carbonate was used, the ratio was almost completely inversed - 1:2.5. However, this conjugate addition is not suitable for preparing purine nucleoside derivatives, yields of these additions were low and complicated reaction mixtures were obtained. O O NH NH N N a O O COOMe COOMe COOMe 232 233a 233b Scheme 8. a) Method I: thymine, DBU, DMF, 75 °C, 72 h, 35% for 233a, 10% for 233b; a) Method II: thymine, K2CO3, DMF, 75 °C, 72 h, 16% for 233a, 40% for 233b. Target thymine nucleosides were prepared by standard reaction procedures (Scheme 9). Ester group on unsaturated esters 233a and 233b was reduced with lithium aluminium hydride in tetrahydrofurane to afford hydroxymethyl group (236a and 236b). Saturated nucleosides 237a and 237b were prepared in two simple steps: the double bond was hydrogenated on palladium hydroxide and then the ester group was reduced to hydroxymethyl group with lithium aluminium hydride under the same conditions as for unsaturated compounds giving 237a and 237b. Compounds 238a and 238b with two cis-hydroxy groups at the skeleton were prepared by osmium tetroxide catalyzed cis-hydroxylation followed by lithium aluminium hydride reduction. Scheme 9. a) H2, Pd(OH)2/C, MeOH-H2O, 86% for 234a, 84% for 234b; b) OsO4, NMMO, acetone-H2O, 98% for 235a, 91% for 235b; c) LiAlH4, THF, r.t., 54% for 236a, 69% for 236b 55% for 237a, 70% for 237b, 39% for 238a, 58% for 238b. When the Michael addition strategy failed, it was necessary to find a new route leading to the purine nucleosides. Curtius rearrangement was chosen for the introduction of the amino function (Scheme 10). The synthesis started with reaction of cyclopentadiene and fumaric acid monoethyl ester 239. Diels-Alder adducts were treated with iodine and sodium bicarbonate in the presence of potassium iodide in order to obtain to products - iodoacid 240a and iodoester 240b. This step allowed the separation of these crucial intermediates by simple acid/base extraction. Both individuals were utilized for preparation of the isomeric aminoalcohols 242a and 242b in four steps. Iodoacid 240a was firstly converted to Boc- protected amine 241a by Curtius rearrangement. Double bond was restored with zinc in refluxing ethanol-water solution. Protected amino acid was immediately deprotected under acidic conditions and carboxylic acid was subsequently reduced with lithium aluminium hydride in THF to the aminoalcohol 242a. Synthesis of the aminoalcohol 242b was realized in a similar way, only the reaction sequence was different. Both amines were used crude for the next step and were fully characterized as acetyl derivatives 243a and 243b. The aminoalcohols 242a and 242b were used to build the target nucleoside analogues using standard and described synthetic procedures. Both saturated and cis-hydroxylated nucleoside analogues were prepared. Scheme 10. a) 1. cyclopentadiene, 1,4-dioxane, 60 °C, 1 h, 2. I2, KI, Na2CO3, H2O-CHCl3, r.t., overnight, 31% for 240a, 41% for 240b; b) 1. ClCOOEt, Et3N, acetone, 0 °C, 1 h, 2. NaN3, H2O-acetone, 0°C, 1 h, 3. toluene, t- BuOH, reflux, 4 h, 51%; c) Zn, EtOH, reflux, 1 h, quant.; d) 1. Zn, EtOH, reflux, 2 h, 2. HCl, MeOH, 4 d 3. LiAlH4, THF, reflux, 12 h, 61%; e) 1. ClCOOEt, Et3N, acetone, 0 °C, 1 h, 2. NaN3, H2O-acetone, 0 °C, 1 h, 3. toluene, aq. HCl, reflux, 13 h; 4. LiAlH4, THF, reflux, 12 h, 67%; f) Ac2O, pyridine, r.t., 80% for 243a, 92% for 243b. Unfortunately, none of the prepared carbocyclic nucleosides showed any significant biological activity. Inhibitors of coxsackie B3 virus replication Two main groups of the novel coxsackie B3 virus inhibitors were synthesized. First group contained the derivatives with 6-chloropurines substituted in the position 9 with various bicylic systems. Second group of derivatives resulted from the systematic modification of the purine moiety of the selected lead structure 251b. The introduction of the nucleobase during the synthesis of 6-chloropurines (Fig. 2) was usually accomplished by Mitsunobu reaction. This reaction lead to 9-substituted-6- chloropurines with exo orientation of the base to the bicyclic scaffold. Only 9-isomers were obtained in yields ranging from 14% to 78% after usual purification. Three derivatives were prepared by the construction of the nucleobase on appropriate amino precursor (Fig. 3). Fig. 2. Derivatives prepared by Mitsunobu reaction. B = 6-chloropurine-9-yl. Fig. 3. Derivatives prepared by nucleobase-construction strategy. B = 6-chloropurine-9-yl. Compounds bearing various substituents on the norbornane scaffold (e.g. hydroxy, fluorine, ketogroup etc.) were also prepared in order to expand the library of the coxsackievirus inhibitors. Compounds were prepared by linear strategy involving Mitsunobu reaction as a key reaction. For the debenzoylations of protected 6-chloropurines intermediates we improved previously published method.4 Excess of methylmagnesium chloride in tetrahydrofurane at 0 °C overnight and yields from 35-75% were obtained. HO B B B HO B B O B B HO O HO HO O 272 273 HO 277 285 286 287 288 B B F B B F B B B F F HO OH F F F 293 289 290 291 292 294 301 PhO B B B B B B B PhO B 302 303 304 305 307 B 308 B B O B B B O HO HO 316 326 O O HO 334 HO 333 Fig. 4. Derivatives with variously substituted bicyclic scaffold. B = 6-chloropurine-9-yl. Second part of the coxsackie B3 virus inhibitors project was focused on the studying of the necessary nucleobase substitution. A small library of compounds was built up using well known synthetic procedures (nucleophilic aromatic substitution, cross-coupling reactions or conversion of the function groups) to modify purine scaffold at the positions 2, 6, 8. Most of these compounds were prepared by 6-chloropurine derivatization of the lead structure 251b. This scaffold was chosen for this modifications due to its availability and chemical inactivity of the bicyclic scaffold. Structures of the prepared compounds are shown in the figures 5, 6 and 7. Fig. 5. Purine modifications, position 6. Cl Cl Cl Cl N N N N N N N N N N NH2 N N Cl N N F N N I R R R R 353 354 355 356 Cl Cl N N N N N N R= N N N N NO2 N N Cl R R R 357 358 371 Fig. 6. Purine modifications, position 2. Fig. 7. Purine modifications, position 8. The results of the antiviral screening showed some interesting data. Most of the compounds exhibit a significant activity against coxsackie B3 virus with very low level of cytotoxicity to the Vero cells. The presence of the 6-chlorpurine as the nucleobase seems to be essential for the excellent antiviral activity. Most of the modifications in the purine part lead to lower antiviral activity, only compound bearing p-chlorophenyl substituent in position 6 embodied similar value of the EC50 (0.87±0.41 µM) to the parental compound. Several analogues inhibited CVB3 in the low micromolar range (0.66 µM - 2 µM). Some of the compounds showed comparable results or they are slightly better than previously prepared derivatives and are also comparable to the known inhibitor TTP-83075. Compounds 251b (EC50 = 0.81±0.20 µM) and 259b (EC50 = 0.66±0.35 µM) are the best derivatives from this series. Studies to identify the molecular target of these compounds are in progress. Only three compounds from the group of bicyclic modified derivatives showed significant cytotoxicity to the Vero cell line (261b, 262b, 309), more cytotoxic compounds were found in the group of the purine modified derivatives (335, 337, 354, 355, 356, 358, 362). Conclusion In the first part of the thesis, three different types of the conformationally locked nucleoside analogues were prepared. In most cases, nucleobase was introduced to the bicyclic scaffold by built up strategy on an appropriate amino function. Three different synthetic pathways were used for preparation of suitable amines. For the 7-syn analogues, acid catalyzed decomposition of the intermediate triazolines connected with Wagner-Meervein rearrangement was used. The preparation of the isomeric anti-amine required totally different synthetic strategy where the key step was Ritter reaction in order to convert the hydroxy group to the acetamido group in excellent yield and which proceeded with retention of the configuration to achieve anti-configuration. Third used approach for preparation of the amino precursors was Curtius rearrangement of the suitable substituted bicyclic carboxylic acids. This step accompanied with function group transformations (ester reduction) furnished amine- intermediates in good yield. Biological screening of the prepared compounds did not show any considerable activity. In the second part of the thesis, two large series of the coxsackie B3 virus inhibitors were designed and synthesized. This series uncovered a novel type of the coxsackie B3 virus inhibitors combining norbornane scaffold with 6-chlorpurine base. Two different types of the compounds were synthesized. Firstly, the bicyclic scaffold (OH, F, keto group, saturated, unsaturated scaffold etc.) was modified and as the nucleobase 6-chlorpurine was used. Nucleobases were generally introduced to the scaffold by Mitsunobu reaction in good yields. Second part was devoted to modifications at the purine part of the selected inhibitor (251b, easily available, very potent inhibitor), but these modifications did not improved the biological properties. Two most promising compounds 251b (EC50 = 0.81±0.20 µM) and 259b (EC50 = 0.66±0.35 µM) were selected for further investigation.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Michal Šála 2.49 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Michal Šála 316 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Michal Šála 265 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Ing. Hubert Hřebabecký, CSc. 813 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Miloslav Černý, DrSc. 114 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Ing. Jitka Moravcová, CSc. 192 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 480 kB