velikost textu

Studium enantioseparace vybraných substituovaných binaftylů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium enantioseparace vybraných substituovaných binaftylů
Název v angličtině:
Study of Enantioseparation of Selected Substituted Binaphthyls
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Lucie Loukotková, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Zuzana Bosáková, CSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Ladislav Feltl, CSc.
RNDr. Miroslav Flieger, CSc.
Id práce:
83759
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra analytické chemie (31-230)
Program studia:
Analytická chemie (P1403)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
25. 2. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
1 ÚVOD V posledních desetiletích dvacátého století se podařilo objevit mnoho stereoselektivních reakcí, díky kterým jsme schopni synteticky připravit čisté enantiomery řady látek, majících široké využití v nejrůznějších oblastech lidského života. Tento způsob přípravy, tzv. asymetrická syntéza, umožňuje přímou syntézu enantiomerů za použití vhodných katalyzátorů, jimiž bývají opticky aktivní látky. Předpokladem úspěšného použití organických katalyzátorů v asymetrické syntéze je vedle jejich vhodného prostorového uspořádání i jejich dostatečná konformační stabilita (odolnost vůči racemizaci). Mezi významné katalyzátory asymetrických reakcí patří deriváty binaftylu, jejichž použití jako asymetrických katalyzátorů je velmi rozsáhlé. Binaftyly se vyznačují pozoruhodnými vlastnostmi chirálního rozpoznávání pramenícími z jejich chirality, prostorového uspořádání a rigidní struktury. Většina molekul 1,1´-binaftylu je C2 symetrická se dvěma identickými substitučními skupinami, které bývají často umístěny v polohách 2 a 2´. Chiralita derivátů 1,1´- binaftylu je dána stéricky bráněnou rotací atomů nebo skupin atomů kolem jednoduché vazby binaftylového skeletonu (axiální chiralita, atropisomery). S velikostí racemizační bariéry roste pravděpodobnost využití binaftylů v enantioseparacích [1]. Z významných zástupců 2,2´-disubstituovaných derivátů 1,1´-binaftylu lze jmenovat 2,2´-dihydroxy-1,1´- binaftyl (1,1´-bi-2,2´-naftol, OBIN, BINOL) [2-5], 2,2´-diamino-1,1´-binaftyl (BINAM) a 2,2´-bis(difenylfosfino)-1,1´-binaftyl (BINAP) [6,7]. Kromě přípravy binaftylových derivátů s nestejnými substituenty nebo substituenty lokalizovanými v různých polohách [8] se snaha organických chemiků zaměřila na posun klasické 1,1´- chirální osy do jiných poloh [9]. Důraz je vždy kladen na vytvoření stabilní chirální látky s vysokým stupněm optické čistoty. Cyklodextriny (CD) a polysacharidy jsou přírodní oligomery a polymery, jejichž základními stavebními jednotkami jsou glukosové jednotky. CD a polysacharidy a jejich deriváty byly s úspěchem použity jako chirální stacionární fáze (CSP) pro enantioselektivní separace velkého počtu strukturně odlišných látek [10]. 8 Velmi často se cyklodextrinové CSP používají v reverzním módu, kde v mechanismu enantioselektivního rozpoznávání převládá inkluze nepolární části analytu do kavity CD. Rozměry kavity β-CD jsou vhodné pro substituované fenylové a naftylové skupiny, a proto je retence disubstituovaných binaftylů pravděpodobná. V normálním módu jsou upřednostňovány spíše vodíkové vazby a π-π interakce, zatímco v polárně- organickém módu je podstatou enantioseparace tvorba vodíkových můstků mezi chirálním analytem a funkčními skupinami nativních nebo derivatizovaných CD. [11,12] Mezi CSP na bázi polysacharidových derivátů vyniká schopnostmi chirálního rozpoznávání tris(3,5-dimethylfenylkarbamát) celulosy [13,14]. Chirální rozpoznávání je založeno na stereogenním fitu enantiomerů do chirálních kavit chirálního selektoru a tato enantioselektivní interakce je stabilizována dalšími interakcemi jako jsou vodíkové vazby, π - π interakce, dipól- dipólové interakce a stérické efekty [13]. Kromě přírodních polymerních chirálních selektorů mohou poskytnout srovnatelné separační podmínky zcela syntetické polymery. Polymerní CSP mají celou řadu atraktivních znaků jako je vytvoření dobře definovaného chirálního prostředí, strukturní a chemická variabilita, nebo možnost přípravy obou enantiomerních verzí dané CSP [15]. Pro přípravu polymerních CSP byly použity nejméně čtyři postupy [16]. Tři nové syntetické polymerní CSP založené na trans-1,2- diaminocyklohexanu (P-CAP), trans-1,2-difenylethylendiaminu (P-CAP-DP) a trans- 9,10-dihydro-9,10-ethanoantracen-(11S,12S)-11,12-dikarboxylové kyselině (DEABV) byly připraveny radikálově iniciovanou polymerizací [15,17,18]. P-CAP CSP má poměrně rigidní strukturu a neobsahuje žádné aromatické skupiny, takže v mechanismu chirálního rozpoznávání převažují H-vazby. Každý monomer stacionární fáze P-CAP-DP obsahuje dvě aromatické jednotky a konformace monomeru je flexibilní. Na chirálním rozlišení analytů se podílejí také π-π interakce. DEABV CSP obsahuje množství amidových vazeb a aromatických skupin, a proto vodíkové vazby, dipolární a π-π interakce hrají velkou roli v procesu chirálního rozpoznávání. Všechny tři polymerní CSP jsou vzájemně komplementární [15,17,18]. Další výhodou těchto CSP je vysoká dávkovací kapacita a možnost provádět separace v semipreparativním nebo preparativním měřítku. 9 Literatura týkající se binaftylových derivátů je sice velmi rozsáhlá, zabývá se především syntézou derivátů. Chromatografické separace jsou zmiňovány obvykle okrajově a přesné separační podmínky mnohdy schází. Přitom chromatografie je k rychlému zjištění čistoty připravené látky nebo k předpovězení velikosti racemizační bariéry velice vhodná. V literatuře byly zmíněny separace na amylosových nebo celulosových CSP především v normálním módu [13,19-23]. Nedávno byla publikována práce zabývající se separacemi OBINu, 2,2´-diamino-1,1´-binaftalenu a 1,1´-bi-2-naftol bis(trifluoromethansulfonátu) na nových syntetických chirálních stacionárních P-CAP, P-CAP-DP, DEABV a DPEVB [24]. 10 2 CÍL PRÁCE Cílem této disertační práce bylo studium chromatografického chování sady 2,2´-disubstituovaných a 2,3,2´-trisubstituovaných 1,1´-binaftylů a 3,8´- disubstituovaných 1,2´-binaftylových derivátů na třech rozdílných typech CSP, jmenovitě na bázi cyklodextrinu, derivatizované celulosy a syntetických polymerů. Na základě získaných dat byly diskutovány enantioselektivní separační mechanismy. 1 R 1 = H; R 2 = R 3 = O C CH 3 O 2 R1= COO H R2 = OH R3 = NH 3 R 1 = H; R 2 = NH C CH 3 R 3 = OH R1 O R2 4 R1 = H; R2 = O C N(CH3)2 R 3 = S C N(CH 3)2 R3 S O 5 R 1 = H; R 2 = R 3 = O C N(CH 3 )2 S 6 R 1 = H; R 2 = R 3 = S C N(CH3)2 O 7 R 1 = CO OH; R 2 = NH 2; R 3 = OH 8 R 1 = H; R 2 = R 3 = OH O C 9 R1 = O CH 3 HN CH 3 R1 10 R1 = O H Obr. 1: Struktura binaftylových derivátů studovaných v předkládané disertační práci. 11 3 VÝSLEDKY A DISKUSE 3.1 Studium vlivu experimentálních podmínek na retenci a enantioseparaci sady nově syntetizovaných disubstituovaných binaftylů Separace na β–cyklodextrinové CSP Retenční a enantioseparační chování sady binaftylových derivátů bylo sledováno jak v normálním, tak v reverzním separačním systému. Jako první byl testován normální mód (NP) s binární mobilní fází (MF) n-hexan/propan-2-ol. I přes to, že retence analytů s rostoucím podílem n-hexanu v MF rostla, nebyl pozorován náznak enantioseparace žádného z analytů. Reverzní separační mód byl realizován binární mobilní fází obsahující organický modifikátor (OM), kterým byl buď acetonitril (ACN), nebo methanol (MeOH), ve směsi s vodou nebo vodným roztokem triethylaminoctanového (TEAA) pufru, pH 3,0 nebo 6,0. Pokud byl ACN použit jako složka MF, všechny analyty eluovaly s mrtvým časem, proto byl nahrazen methanolem. Vysoký obsah methanolu (50 - 100 obj. %) v MF vedl ke krátké retenci bez pozorované enantioseparace. S klesajícím množstvím MeOH se prodlužovala retence analytů, která byla v některých případech doprovázena enantioseparací. V mobilní fázi MeOH/voda 30/70 (v/v) eluovaly všechny analyty kromě látky 2 (obr. 1) v rozmezí 6 až 12 minut. Ze skupiny 1,1´-binaftylů byla částečná enantioseparace pozorována pouze u analytu 1 (viz tab. 1). Nejlepších hodnot chirálního rozlišení 8,3´-disubstituovaných-1,2´- binaftylů bylo dosaženo v mobilní fázi složené z MeOH/voda 30/70 (v/v) a 20/80 (v/v) pro 9 resp. 10. Nahrazení vody 0,5% vodným roztokem TEAA pufru, pH 3,0 nebo 6,0, vedlo k poklesu retence zejména při nižší hodnotě pH pufru, což lze přičíst účinnějšímu omezení silanofilních interakcí analytu se silikagelovým nosičem β-CD. Tyto interakce jsou charakteristické pro tento typ chirálních kolon. Symetrie píků, rozlišení a účinnost kolony nebyly změnami ve složení mobilní fáze významně ovlivněny. 12 Tab. 1: Retenční parametry binaftylových derivátů separovaných na β-cyklodextrinové chirální stacionární fázi, mobilní fáze MeOH/voda, průtoková rychlost 0,7 ml/min, UV detekce 254 nm. MeOH/H2O (v/v) 20/80 30/70 Analyt k1 R α k1 R α 1 2,9 0,5 1,2 0,8 0,2 1,1 9 2,5 0,5 1,3 1,1 0,9 1,1 10 2,1 2,2 1,3 1,1 0,4 1,2 Separace na hydroxypropylether-β-cyklodextrinové CSP Z výsledků naměřených na β-CD CSP vyplývá, že tato CSP není vhodná k enantioseparaci studovaných látek. V mobilních fázích reverzního módu dochází k tvorbě silných inkluzních komplexů, které ale nemají stereodiskriminační charakter. V dalších měřeních byl použit hydroxypropylether-β-cyklodextrin (HP-β-CD) jako chirální selektor. Hydroxylová skupina je navázána na druhý uhlíkový atom glukosové jednotky, čímž dochází jak ke zvětšení molekuly substituovaného cyklodextrinu, tak ke zvýšení počtu interakčních možností pro analyty (stérické repulse, vodíkové vazby). Normální separační mód Jako první byl opět studován NP mód s obdobným složením mobilních fází jako u β-CD CSP . Retenční faktory analytů byly na HP-β-CD CSP vyšší, doprovázené lepší symetrií píků než v případě β-CD CSP. Enantioseparace však nebyla pozorována ani na koloně HP-β-CD. NP mód by byl vhodný pro achirální separace směsí binaftylových derivátů; ty se mohou vyskytnout během procesu asymetrické syntézy – požadovaná látka může být doprovázena dalšími vedlejšími produkty. Reverzní separační mód S ohledem na výsledky dosažené na β-CD CSP v mobilní fázi ACN/voda, nebylo toto složení MF proměřováno/studováno na HP-β-CD CSP. Binární mobilní fáze se skládala ze směsi MeOH/voda s obsahem MeOH mezi 30 - 40 %. S rostoucím obsahem MeOH v mobilní fázi docházelo ke zkracování retence analytů a současnému potlačení enantioseparace. Retence analytů byla ve většině případů vyšší na HP-β-CD 13 koloně než na β-CD CSP. Navzdory vyšší retenci a lepší symetrii píků nevedla měření na hydroxypropylether-β-cyklodextrinové CSP k enantioseparaci všech analytů. Analyt 1 jako zástupce disubstituovaných 1,1´-binaftylů byl chirálně rozdělen ve 23 minutách s hodnotou rozlišení R = 1,0 a byla pozorována částečná enantioseparace analytů 2, 4 a 8. Oba zástupci skupiny 8,3´-disubstituovaných 1,2´- binaftylů se rozdělily v MF složené z MeOH/vody 30/70 (v/v) s hodnotami chirálního rozlišení R = 1,1 pro analyt 9 a R = 1,9 pro analyt 10. Nahrazení vody roztokem TEAA pufru, pH 3,0 nebo 6,0, mělo za následek zkrácení retence a současné zhoršení symetrie píků všech studovaných látek. Jediný analyt 9 dosáhl nejvyšší hodnoty enantiorozlišení (R = 1,5) v MF obsahující TEAA pufr, pH 3,0. Symetrie píků této látky se ovšem zhoršila. Závěr: Chirální stacionární fáze na bázi β–cyklodextrinu se neosvědčily pro enantioseparace studovaných analytů – separovalo se na nich malé množství látek s poměrně nízkými hodnotami chirálního rozlišení. Tyto chirální selektory mohou být s úspěchem použity pro separace směsí binaftylových derivátů vznikajících v průběhu syntézy v reakční směsi. 14 3.2 Chirální stacionární fáze na bázi tris(3,5-dimethylfenylkarbamátu) celulosy jako účinný nástroj pro HPLC separace strukturně odlišných disubstituovaných binaftylů Mezi celulosovými CSP vyniká vysokou schopností chirálního rozpoznávání CSP založená na tris(3,5-dimethylfenylkarbamátu) celulosy. Vzhledem k tomu, že použitelnost pokrytých verzí celulosových CSP v mobilních fázích o různých polaritách je omezena [25], byly testovány dvě CSP na bázi tris(3,5- dimethylfenylkarbamátu) celulosy – jedna určena přímo pro normální separační mód a druhá pro reverzní separační mód. Normální separační mód Vzhledem k literárním údajům [13] byl NP mód vybrán jako první pro studium retenčního a enantioseparačního chování 1,1´- a 1,2´- binaftylových derivátů. Mobilní fáze byly tvořeny směsí n-hexanu a propan-2-olu v různých objemových zastoupeních. Objem propan-2-olu se pohyboval v rozmezí 5 - 80 obj. %. Vyšší zastoupení propan- 2-olu v MF vedlo k nižší retenci všech analytů. Enantioseparace čtyř analytů (1, 4, 9, 10) byla pozorována v MF složené z n-hexan/propan-2-olu 95/5 (v/v); z nich tři analyty se separovaly až na základní linii. Separace na základní linii analytu 4 probíhala ve velmi krátkém čase už v MF obsahující 20 % obj. propan-2-olu (obr. 2A). Oba zástupci disubstituovaných 1,2´-binaftylů vykazovaly v porovnání s 1,1´-binaftyly delší retenční časy (zejména analyt 9) a výrazně vyšší hodnoty enantiorozlišení (obr. 2B), které nebyly změnami ve složení MF výrazně ovlivňovány. 15 Obr. 2: Enantioseparace analytu 4 (A) a analytu 9 (B) na CSP založené na tris(3,5- dimethylfenylkarbamátu) celulosy. Experimentální podmínky: kolona Chiralcel OD-H, mobilní fáze n-hexan/propan-2-ol 80/20 (v/v), průtoková rychlost 0,7 ml/min, UV detekce 254 nm. Reverzní separační mód Mobilní fáze v reverzním separačním módu byly tvořeny směsí acetonitrilu a vody nebo 20 mM fosfátového pufru, pH 3,0 nebo 6,0. Množství ACN se pohybovalo v rozmezí 80 – 30 obj. %. Nižší obsah ACN v mobilní fázi vedl k nárůstu retence všech analytů, zejména látky 1, 4, 5, 6, 8 a 9 vykazovaly velmi dlouhou retenci již v MF obsahující 40 nebo 30 % ACN. Delší retence byla u většiny analytů spojena jak s vyšší enantioselektivitou, tak s vyšším rozlišením. U analytů 2, 5, 6 a 8 nebyl pozorován ani náznak enantioseparace v mobilních fázích ACN/voda. Naproti tomu oba zástupci skupiny 8,3´-disubstituovaných 1,2´-binaftylů (9 a 10) byly rozděleny na základní linii už v MF obsahující 80 % ACN. Značnou citlivost vůči poměru ACN/voda vykazoval analyt 7, nesoucí ve své struktuře skupiny schopné poskytovat i akceptovat vodíkovou vazbu. Retenční chování analytů v pufrovaných mobilních fázích, pH 3,0 nebo 6,0, vykazovalo obdobné trendy jako v případě mobilních fází ACN/H2O, tj. nižší obsah ACN vedl k delší retenci analytů doprovázené pro většinu i vyššími hodnotami chirálního rozlišení. Vliv pH fosfátového pufru je uveden na obr. 3. Vyšší retence a 16 vyšší hodnoty enantiorozlišení byly pozorovány v mobilních fázích obsahujících pufr o nižší hodnotě pH (viz tab. 2). Obr. 3: Chromatogram enantioseparace analytu 7, Chiralcel OD-RH (150 x 4.6 mm I.D.), ACN/20 mM fosfátový pufr, pH 3,0 nebo 6,0, 40/60 (v/v); průtoková rychlost 0,7ml/min, UV detekce 254 nm. Tab. 2: Vliv množství acetonitrilu a pH vodné složky MF na chromatografické chování binaftylových derivátů na CSP na bázi tris(3,5-dimethylfenylkarbamátu) celulosy; mobilní fáze ACN/20 mM fosfátový pufr, pH 3,0, ve třech objemových poměrech, Chiralcel OD-RH, průtoková rychlost 0,7 ml/min, UV detekce 254 nm. ACN/20 mM fosfátový pufr, pH 3,0 Analyt 60/40 50/50 40/60 k1 R α k1 R α k1 R α 1 2,74 0,63 1,05 6,56 0,72 1,05 10,48 1,79 1,13 2 1,12 0,00 1,00 2,91 0,59 1,05 13,90 0,74 1,10 3 0,79 1,25 1,16 1,60 1,66 1,14 4,65 2,14 1,15 4 4,77 0,95 1,06 11,59 1,09 1,07 x x x 5 5,14 0,00 1,00 16,72 0,00 1,00 x x x 6 3,13 0,00 1,00 8,10 0,00 1,00 x x x 7 1,02 4,37 1,55 2,30 5,64 1,55 7,12 6,93 1,58 8 1,43 0,00 1,00 3,27 0,00 1,00 10,32 0,00 1,00 9 2,74 4,41 1,37 5,62 4,87 1,37 16,50 4,96 1,38 10 1,35 3,68 1,41 2,70 4,46 1,40 7,05 4,96 1,42 x – retenční čas analytů byl delší než 120 min. 17 Ze srovnání výsledků získaných v pufrovaných a nepufrovaných mobilních fázích obsahujících stejný podíl ACN vyplývá, že rozdíly v retenci a enantioseparaci jsou nejvíce patrné v MF s nejnižším podílem ACN (40 obj. %) a při nižší hodnotě pH (3,0). Tyto rozdíly se nejvíce projevily u analytů 1, 2 a 7. Vyšší chirální rozlišení těchto látek bylo získáno v pufrované MF (pH 3,0), zatímco retenční faktory byly ovlivněny odlišně. Retence analytu 1 v MF obsahující fosfátový pufr, pH 3,0, klesla za současného nárůstu hodnot chirálního rozlišení. Analyty 2 a 7 obsahují ve své struktuře skupiny schopné tvorby H-vazeb. Právě vodíkové vazby jsou stereoselektivní a s růstem jejich síly dochází k zlepšení enantioseparace v separačním systému s tris(3,5-dimethylfenylkarbamátem) celulosy jako chirálním selektorem a s MF pufrovanou na hodnotu pH 3,0. Síla vodíkových vazeb je ovlivněna také množstvím organického modifikátoru přítomného v MF, a proto se rozdíly v enantioseparaci více projevily v MF obsahující nižší obsah ACN. Při porovnání separačního chování analytů 2 a 7 v korespondujících mobilních fázích je zřejmé, že objemný aromatický substituent aminoskupiny ležící v blízkosti hydroxylové skupiny analytu 2 výrazně snižuje sílu stereoselektivních H-vazeb. Tento fakt dokládají vyšší hodnoty retence a nižší hodnoty rozlišení analytu 2 oproti látce 7 (tab. 2). Analyty 5, 6 a 8 se nepodařilo ani částečně rozdělit v žádné z testovaných mobilních fází. Struktura těchto látek je vysoce symetrická a separace takových látek je velmi obtížná. 8,3´-Disubstituované 1,2´-binaftyly se ve všech mobilních fázích separovaly na základní linii. Změny ve složení MF ovlivňovaly retenční chování těchto látek, enantiomerní rozlišení však stále dosahovalo vysokých hodnot. Prostorové uspořádání těchto derivátů pravděpodobně umožňuje jejich lepší „fit“ do chirálních kavit tris(3,5- dimethylfenylkarbamátu) celulosy. Substituenty naftylového kruhu, zejména v poloze 8, pak poskytují doplňkové stereoselektivní interakce. Z výsledků získaných v reverzním separačním módu vyplývá, že analyty 1, 2 a 7 se nejlépe separovaly v MF složené z ACN/20 mM fosfátový pufr, pH 3,0, 40/60 (v/v). Látky 3, 9 a 10 upřednostňovaly MF obsahující ACN/voda 40/60 (v/v) a pro analyt 4 byla nejvýhodnější MF složená ze směsi ACN/voda v poměru 1:1. Vysoké hodnoty rozlišení analytů 9 a 10 v MF ACN/voda umožňují přímé použití této metody v semipreparativním měřítku. Mobilní fáze použitá pro tyto 18 analyty byla ACN/voda 60/40 (v/v) jako výsledek kompromisu mezi požadavky na rozpustnost analytu, jeho retenci a enantiorozlišení. Semipreparativní měřítko bylo aplikováno také pro analyt 7, ovšem složení MF bylo lehce pozměněno na ACN/0,1% octová kyselina, pH 3,3, 60/40 (v/v). Různé objemy zásobních roztoků analytů 7, 9 a 10 (10, 50 a 100 μl) o jednotné koncentraci 5,0 mg/ml byly dávkovány na kolonu. Dostatečné enantiorozlišení bylo zachováno až do 50 μl nastřikovaného objemu (viz obr. 4). Obr. 4: Separace analytu 7 v semipreparativním měřítku; Chiralcel OD-RH (150 x 4.6 mm I.D.), ACN/1% HAc, pH 3,3, 60/40 (v/v), průtoková rychlost 0,7 ml/min, UV detekce 254 nm. Dávkované množství analytu 250 μg (koncentrace zásobního roztoku analytu 5,0 mg/ml, objem vzorku 50 μl). Ve výřezu je ukázána enantioseparace analytu 7 při analytických podmínkách – koncentrace vzorku 0,5 mg/ml, dávkovaný objem vzorku 10 μl. Závěr: V reverzním separačním módu bylo na atropisomery rozděleno sedm látek z deseti studovaných. S nejvyššími hodnotami rozlišení byly ve všech testovaných mobilních fázích separovány analyty 9 a 10. Struktura těchto analytů zřejmě dobře 19 zapadá do struktury celulosové CSP. Chirální rozlišení podporují π-π interakce aromatických částí analytů se substituentem CSP, vodíkové nebo dipól-dipólové interakce. Ze skupiny 1,1´-binaftylových derivátů byl s nejvyššími hodnotami enantiorozlišení separován analyt 7, který ve své struktuře obsahuje skupiny schopné tvorby H-vazeb. Vysoké hodnoty chirálního rozlišení analytů 7, 9 a 10 umožňovaly separaci těchto látek v semipreparativním měřítku. V normálním separačním módu byly na CSP na bázi tris(3,5- dimethylfenylkarbamátu) celulosy rozděleny čtyři analyty, dva analyty ze skupiny 1,1´-binaftylů (1 a 4) a oba zástupci 1,2´-binaftylů (9 a 10). Analyty 4, 9 a 10 se separovaly na základní linii. Ze srovnání výsledků získaných v NP a RP módu jednoznačně vyplývá, že reverzní separační mód je pro separaci studovaných analytů vhodnější. 20 3.3 Srovnání enantioseparace substituovaných binaftylů na cyklodextrinových, celulosových a syntetických polymerních chirálních stacionárních fázích Tato práce se věnuje porovnání enantioseparačního chování vybraných binaftylových derivátů na třech typech chirálních stacionárních fází. Prvním typem je β-cyklodextrinová a hydroxypropylether-β-cyklodextrinová CSP. Druhou CSP, na které bylo studováno chování binaftylů, byl tris(3,5-dimethylfenylkarbamát) celulosy (jedna CSP vyvinutá pro NP a druhá pro RP separační mód). Poslední skupina CSP zahrnuje tři nově připravené syntetické polymerní CSP na bázi trans-1,2- diaminocyklohexanu - P-CAP, P-CAP-DP a DEABV, jejichž struktury jsou znázorněny na obr. 5 (kolony byly připraveny v laboratoři Prof. Armstronga, The University of Texas at Arlington, USA). Chování binaftylových derivátů na prvních dvou typech CSP bylo studováno v předchozích pracích (kapitoly 3.1 a 3.2). Proto je tato kapitola věnována převážně syntetickým polymerním CSP a celkové srovnání je uvedeno až na konci. Retenční a enantioseparační chování binaftylových derivátů bylo na syntetických polymerních CSP sledováno v normálním a polárně-organickém separačním módu. O O O HN HN NH O HN HN O O HN O silica O Si O Si N silica Si O Si gel CN O H O O O gel O HN HN HN NH HN HN HN HN HN NH O O O O O O O O NC (S) N N N (S) H Si O Si NO H SiO2 H N Si O Si N H2 H CN Poly-DEABV Obr. 5: Struktury polymerních CSP, vlevo nahoře – (R,R)-P-CAP, vpravo nahoře - (R,R)-P-CAP-DP, dole – DEABV CSP. 21 Normální separační mód Mobilní fáze normálního módu byly tvořeny n-heptanem nebo n-hexanem ve směsi s ethanolem nebo propan-2-olem s nebo bez přídavku malého množství octové (HAc) nebo trifluoroctové (TFA) kyseliny. Retence všech analytů rostla podle předpokladu s množstvím nepolární složky v MF. Vyšší retence byla doprovázena vyššími hodnotami chirálního rozlišení. Nejvýhodnější poměr n-hexanu (n-heptanu) a propan-2-olu (ethanolu) na koloně P-CAP byl 80/20 (v/v). V tab. 3 jsou shrnuty výsledky získané v podobných MF jako je tato základní. Přídavek HAc nebo TFA vedl ve většině případů ke snížení hodnot retence a chirálního rozlišení. Tento pokles /toto snížení byl patrnější/výraznější v přítomnosti TFA. Tab. 3: Hodnoty retenčních faktorů, enantioselektivního rozlišení a enantioselektivit těch analytů, u kterých byla pozorována alespoň částečná enantioseparace na P-CAP CSP v normálním separačním módu. 80/20 (v/v) 80/20/0,1 (v/v/v) Analyt HEX/IPA HEX/EtOH HEP/EtOH HEP/EtOH/HAc HEX/IPA/TFA HEP/EtOH/TFA k1 2,62 3,92 4,23 2,72 2,54 0,85 3 R 0,91 0,85 0,75 0,64 1,06 0,00 α 1,15 1,07 1,06 1,06 1,13 1,00 k1 x x x x 10,27 2,21 7 R x x x x 1,62 0,69 α x x x x 1,22 1,10 k1 9,98 11,23 11,24 8,73 9,04 2,15 8 R 3,43 5,02 4,22 4,52 3,66 2,93 α 1,59 1,43 1,36 1,39 1,58 1,34 k1 3,56 4,82 4,81 3,98 3,74 0,96 10 R 1,97 2,28 2,28 1,93 1,96 1,00 α 1,36 1,19 1,18 1,17 1,35 1,15 x – analyt neeluoval z kolony do 120 min. Separace derivátů obsahujících hydroxylové skupiny ležící vedle jednoduché vazby spojující naftylové kruhy (látky 3, 7, 8, 10) na P-CAP CSP ukazuje na důležitost H-vazeb v mechanismu enantioselektivního rozpoznávání atropisomerů. Význam vodíkových vazeb podporuje také fakt, že analyt 9, který má strukturu velice podobnou analytu 10, ovšem neobsahuje OH- skupiny, nebyl ani částečně rozdělen. Enantioseparace analytů 7 a 8 je znázorněna na obr. 6. 22 Analyt 7 R = 1,6 Analyt 8 R = 5,0 Odezva [mAU] 20 40 60 80 t [min] Obr. 6: Chromatogramy enantioseparace analytů 7 a 8 na P-CAP (250 x 4,6 mm I.D.), mobilní fáze: pro analyt 7 n-hexan/propan-2-ol/TFA 80/20/0.1 (v/v/v), pro analyt 8 n-hexan/ethanol 80/20 (v/v); průtoková rychlost 0,7ml/min, UV detekce 254 nm. Na DEABV CSP byla pozorována v MF stejného složení vyšší retence než na koloně P-CAP. Proto optimalizované složení mobilní fáze obsahovalo menší zastoupení n-heptanu, tedy n-heptan/IPA 70/30 (v/v). Přídavek 0,1% octové kyseliny do MF měl na chromatografické parametry analytů zanedbatelný vliv. Na DEABV CSP bylo dosaženo částečné enantioseparace analytů 8 (R = 0,5), 9 (R = 1,3) a 10 (R = 1,0). Ze srovnání výsledků separačních parametrů – rozlišení, symetrie píků nebo separační účinnosti – naměřených na obou kolonách vyplývá, že chirální stacionární fáze P-CAP je pro enantioseparace binaftylů vhodnější. P-CAP-DP CSP se pro enantioseparace binaftylových derivátů v NP módu neosvědčila. Polárně-organický separační mód Mobilní fáze polárně-organického módu (PO) byly tvořeny acetonitrilem s malým množstvím methanolu. Aditivy mobilních fází byly HAc, TFA nebo triethylamin ovlivňující disociaci/protonaci buď analytu, nebo funkčních skupin chirálních selektorů. Na všech polymerních kolonách rostla retence se stoupajícím množstvím ACN v mobilní fázi. Přídavek 0,1% HAc do MF vedl ke snížení retence na P-CAP a P-CAP-DP CSP, zatímco na DEABV se retence látek v přítomnosti kyseliny 23 výrazně neměnila. Účinnost kolony a symetrie píků byly lepší v okyselené MF. Výjimku tvořila DEABV CSP, na které se změny v symetrii a účinnosti kolony v MF obsahující HAc projevily jen mírně. V tabulce 4 jsou uvedeny separační parametry analytů, které se na jednotlivých CSP dělily na atropisomery. Na koloně P-CAP se separovalo pět látek - v tab. 4 nejsou uvedeny analyty 2 a 7, které se podařilo rozdělit pouze v MF složené z ACN/MeOH 95/5 (v/v) + 10 mM směs HAc a TEA s rozlišením R = 1,20 pro analyt 2 a R = 0,60 pro analyt 7. Tři látky byly shodně separovány na P- CAP-DP a DEABV CSP. Poslední jmenovaná CSP – DEABV – byla jediná chirální stacionární fáze ze všech studovaných CSP, na které byla pozorována částečná enantioseparace analytu 5 (obr. 7). Ze vzájemného porovnání jednotlivých polymerních kolon studovaných v této práci vyplývá, že z hlediska rozlišení, symetrie a účinnosti se nejlépe osvědčila chirální stacionární fáze P-CAP. Tab. 4: Hodnoty rozlišení a enantioselektivit studovaných binaftylových derivátů separovaných v PO módu na polymerních CSP - P-CAP, P-CAP-DP a DEABV. Stacionární fáze P-CAP P-CAP-DP DEABV Analyt 3 8 10 8 10 5 9 10 Mobilní fáze (v/v) R α R α R α R α R α R α R α R α ACN/MeOH 95/5 0,54 1,07 3,64 1,37 1,64 1,18 0,00 1,00 1,47 1,28 0,60 1,08 1,33 1,17 1,40 1,16 ACN 0,75 1,11 3,82 1,54 1,29 1,19 0,78 1,13 2,31 1,37 0,61 1,09 1,40 1,17 1,35 1,17 ACN/MeOH/HAc 95/5/10 mM 0,57 1,07 3,86 1,37 1,88 1,19 0,49 1,06 1,53 1,27 0,58 1,08 1,27 1,16 1,37 1,16 ACN/HAc 100/10 mM 1,01 1,12 4,22 1,57 1,83 1,21 0,86 1,12 2,30 1,36 0,63 1,11 1,43 1,18 1,31 1,17 - v tabulce nejsou uvedeny analyty 2 a 7, které se separovaly v MF ACN/MeOH 95/5 (v/v) + 10 mM HAc + TEA na P-CAP CSP; analyt 2 se ve stejné MF dělil také na P-CAP-DP CSP. 24 R = 0,63 150 Odezva [mAU] 100 50 0 3 4 5 t [min] Obr. 7: Chromatogram enantioseparace analytu 5 na koloně DEABV (250 x 4,6 mm I.D.) v mobilní fázi ACN/HAc 100/0,1 (v/v); průtoková rychlost 0,7ml/min, UV detekce 254 nm. Závěr: V NP módu byla pozorována enantioseparace čtyř analytů na P-CAP CSP a tří látek na DEABV CSP. Nejvyšší hodnoty chirálního rozlišení analytů byly na P-CAP CSP dosaženy v mobilní fázi n-hexan/propan-2-ol/TFA 80/20/0,1 (v/v/v). Všechny analyty obsahují ve své struktuře funkční skupiny schopné tvorby vodíkových vazeb - ty převládají v mechanismu chirálního rozpoznávání na P-CAP CSP. Na DEABV CSP byla pozorována separace na atropisomery u analytů 8, 9 a 10 v mobilní fázi n- heptan/propan-2-ol 70/30 (v/v). Lepší výsledky byly ze dvou testovaných CSP v normálním módu dosaženy na P-CAP CSP. Sedm látek bylo rozděleno na atropisomery v PO módu, z nich pět analytů na P-CAP (látky 2, 3, 7, 8 a 10) a shodně po třech látkách na DEABV a P-CAP-DP CSP. Analyt 8 byl enantioseparován s nejvyšším chirálním rozlišením na P-CAP, zatímco analyt 10 se s nejvyšší hodnotou rozlišení separoval na P-CAP-DP CSP. Tento derivát se jako jediný separoval na všech polymerních chirálních stacionárních fázích. Enantioseparace sloučenin 3 a 7 byla pozorována pouze na P-CAP CSP, analyt 2 se dělil jak na P-CAP, tak na P-CAP-DP, a analyty 5 a 9 se podařilo chirálně rozlišit pouze na DEABV CSP. Na jednotlivých polymerních CSP byla pozorována 25 enantioseparace různých analytů – tato skutečnost potvrzuje vzájemnou komplementaritu polymerních CSP studovaných v této práci. 3.3.1. Srovnání výsledků získaných na všech testovaných CSP Celkově bylo retenční a enantioseparační chování sady deseti analytů studováno na šesti chirálních stacionárních fázích, a to na bázi β-cyklodextrinu, hydroxypropylether-β-cyklodextrinu, tris(3,5-dimethylfenylkarbamátu) celulosy, poly(trans-1,2-diaminocyklohexandiyl-bis akrylamidu), N,N´-[(1R,2R)-1,2-difenyl- 1,2-ethandiyl]bis-2-propenamidu a bis-4-vinylfenylamidového derivátu trans-9,10- dihydro-9,10-ethanoantracen-(11S,12S)-11,12-dikarboxylové kyseliny. První dva typy CSP mají podobný základ – řadí se do skupiny oligo-, resp. polysacharidových CSP. Poslední tři CSP patří do skupiny zcela syntetických polymerů. Ačkoli jsou všechny analyty strukturně podobné, výsledky dosažené na jednotlivých CSP se vzájemně velice lišily. Z tab. 5, ve které je uveden přehled analytů rozdělených na jednotlivých CSP, vyplývá, že optimalizace separace analytů známé struktury na CSP rovněž známé (a dobře definované) struktury není jednoduchý proces. 26 Tab. 5: Přehled analytů separovaných na atropisomery na jednotlivých CSP studovaných v této práci v NP, RP a PO separačním módu (v závorkách jsou uvedeny hodnoty chirálního rozlišení). Separační mód NP RP PO Chirální stacionární fáze β-Cyklodextrin žádná separace 1 (0,5) 9 (0,9) 10 (2,2) - Hydroxypropylether-β- 1 (0,7) 2 (1,0) 4 (0,2) žádná separace - cyklodextrin 8 (0,8) 9 (1,1) 10 (1,9) 1 (1,8) 2 (0,7) 3 (3,2) 4 Derivatizovaná celulosa 1 (1,2) 4 (1,9) (1,2) - 9 (4,9) 10 (5,0) 7 (6,9) 9 (6,3) 10 (5,9) P-CAP 3 (1,1) 7 (1,6) - 2 (1,1) 3 (1,0) 7 (0,6) 8 (5,0) 10 (2,3) 8 (4,2) 10 (1,9) 2 (0,6) 8 (0,9) 10 P-CAP-DP - - (2,3) 8 (0,6) 9 (1,3) 10 5 (0,6) 9 (1,4) 10 DEABV (1,0) - (1,4) - retenční a enantioseparační chování analytů nebylo v daném separačním módu na CSP testováno nebo se analyty ireverzibilně zadržovaly na CSP 27 4 ZÁVĚR Ke studiu retenčního a enantioseparačního chování sady binaftylových derivátů byly použity tři typy chirálních stacionárních fází – cyklodextrinové, celulosové a CSP založené na syntetických polymerech. Na jednotlivých CSP byly testovány různé separační módy s různým složením mobilních fází. V normálním módu nebyl na cyklodextrinových CSP rozdělen ani jeden analyt. Na celulosové a P-CAP CSP se rozdělily shodně čtyři analyty, avšak odlišné. Na další polymerní CSP - DEABV – se dělily tři, nikoli však shodné, látky. Na chirálních stacionárních fází na bázi sacharidů i polymerů se separují pouze zástupci 1,2´-disubstituovaných binaftylů (9, 10). Mechanismus enantioseparace na celulosové CSP je založen na vhodném „fitu“ analytu do chirálních prostorových struktur CSP doplněném o interakce funkčních skupin cyklodextrinu nebo celulosy a daného analytu. Vlastnosti daných rigidních uspořádání jsou však u CD a derivatizované celulosy odlišné. Na syntetických polymerních CSP je enantioseparace založena zejména na tvorbě stereoselektivních vodíkových interakcí. Ty jsou kromě kolony P-CAP na dalších dvou polymerních CSP doplněny o π-π a dipólové interakce. Separace 9 a 10 na obou typech CSP je způsobena vhodnějším prostorovým uspořádáním těchto analytů. Analyt 10, který se separoval na všech testovaných CSP, má zřejmě jako jediný zástupce takové prostorové uspořádání a takové funkční skupiny, které mohou účinně interagovat se všemi typy CSP. Analyt 9, který se separoval na celulosové a jednom typu polymerní CSP (DEABV), sice ve své struktuře neobsahuje skupinu schopnou tvorby H-vazeb, ale svým prostorovým uspořádáním zřejmě dobře zapadá do struktur CSP. Tato interakce je pak zpevněna interakcemi aromatických skupin analytu a stacionární fáze (π-π). Vzájemné porovnání výsledků získaných v reverzním a polárně-organickém separačním módu není dost dobře možné, neboť v obou systémech se uplatňují (převládají) rozdílné interakce. Ze srovnání separací na cyklodextrinových a celulosové CSP provedených v RP módu jednoznačně vyplývá, že celulosová CSP je účinnější jak z hlediska počtu separovaných látek, tak lepší symetrie píků a vyšších hodnot enantiorozlišení těch analytů, které se separovaly na obou CSP. Zatímco se na 28 celulosové CSP se rozdělilo sedm látek z deseti, na cyklodextrinových CSP byla pozorována enantioseparace šesti analytů. Polární separační mód byl aplikován pouze u syntetických polymerních CSP, na kterých se podařilo rozdělit sedm látek. Ze vzájemného porovnání všech CSP vyplývá, že nejvhodnější CSP pro separaci binaftylových derivátů je CSP obsahující tris(3,5-dimethylfenylkarbamát) celulosy jako chirální selektor a vhodným separačním systémem je reverzní mód. 29
Abstract v angličtině:
1 INTRODUCTION Over the last two decades, high-performance liquid chromatography (HPLC) has become one of the most common techniques in chiral separations. HPLC has also been successfully employed for determination of the optical purity of newly synthesized organic compounds. Asymmetric synthesis is a direct way of synthesis of enantiomers that uses suitable optically pure ligands acting as catalysts. The chiral ligands in asymmetric reactions must have stable configurations (they must be resistant towards racemization) and a high optical purity is required. Binaphthyl derivatives have been extensively used to control many asymmetric processes and have demonstrated outstanding chiral discrimination properties, due to their unique properties derived from their rigidity and spatial arrangement. Most of 1,1´- binaphthyl molecules are C2 symmetric with two identical naphthyl units often substituted in the 2,2´-positions. Chirality of these compounds is caused by restricted rotation of atoms or groups of atoms around the single bond on the binaphthyl skeleton (axial chirality, atropisomerism). Increased hindrance to rotation at the pivotal 1,1´- bond makes these molecules potential candidates for enantioseparation [1]. The best representatives of the binaphthyl group are 2,2´-dihydroxy-1,1´-binaphthyl (1,1´-bi- 2,2´-naphthol, BINOL, OBIN) [2-5], 2,2´-diamino-1,1´-binaphthyl (BINAM) and 2,2´- bis(diphenylphosphino)-1,1´-binaphthyl (BINAP) [6,7], which have been used to develop many related chiral auxiliaries. The recent developments in the field of new chiral binaphthyl catalysts are focused to the preparation of derivatives with non- identical groups in various positions [8] and to a shifting the classical 1,1´- chiral axis to other positions [9]. Efforts in the molecular architecture of these ligands are oriented toward creating a stable chiral environment for asymmetric reactions providing a high degree of enantiopurity. Cyclodextrins (CDs) and polysaccharides are natural oligomers and polymers, respectively, their basic constituents are glucose units. CDs and polysaccharides and their derivatives have been successfully used as chiral stationary phases (CSPs) in HPLC for enantioselective separation of a wide range of structurally different 8 compounds [10]. On cyclodextrin based CSPs inclusion phenomena play a dominant role in the enantioselective recognition mechanism in a reversed-phase separation system. The cavity dimension of β-cyclodextrin fits well with substituted phenyl and naphthyl (even better) moieties, so that enantioseparation of disubstituted binaphthyls can be expected. Combination of hydrogen bonding, dipole-dipole interactions, dispersion forces etc. are accented in normal or polar-organic separation modes [11,12]. Among CSPs based on polysaccharide derivatives, celulose tris(3,5- dimethylphenylcarbamate) ones exhibit a very good resolution capability [13,14]. The chiral recognition is based on stereogenically different fit of enantiomers into chiral grooves, the enantioselective interaction is further stabilized by other interaction types, e.g. H-bonding, π - π interactions, dipole-dipole interaction and steric effect [13]. Besides natural polymeric chiral selectors (CSs), purely synthetic polymers can provide comparable separation possibilities. Creation of well-defined chiral environment, possibility of obtaining chiral selectors with opposite absolute configurations, structures available for chemical modification are just a few features offered by the polymeric CSPs. [15]. In general, four approaches have been used to prepare the synthetic polymeric CSPs [16]. One of them is based on the creation of a chiral linear homopolymer attached to the surface of a silica gel support. Three new synthetic polymeric CSPs based on trans-1,2-diamino-cyclohexane (P-CAP), trans-1,2- diphenylethylenediamine (P-CAP-DP) and trans-9,10-dihydro-9,10-ethanoanthracene- (11S,12S)-11,12-dicarboxylic acid (DEABV) have been developed via radical-initiated polymerization [15,17,18]. The P-CAP CSP contains relatively rigid structure that has no aromatic moieties while the P-CAP-DP CSP has aromatic units and the conformation of the monomer is flexible. The DEABV CSP exhibits different enantioselectivity due to a number of amide linkages and aromatic groups. In general, different hydrogen bonding, dipolar and π- π interactions (with the exception of P-CAP CSP) play an important role in the chiral discrimination process and can provide complementary separations. [15,17,18]. The advantages of all these CSPs are wide range of mobile phase compositions compatible with them (multiple mobile phase modes can be used), high sample-loading capacity and therefore, possibility of semipreparative or preparative applications. 9 Most papers on the binaphthyl-based ligands found in the literature deal with their synthesis. Enantioselective HPLC has been used in some cases to control the enantiomeric purity or the yield of the final products. However, the separation conditions, including characterization of the separation systems, have not usually been adequately described. Only a few articles pay attention to the enantioseparation of some of these compounds. Cellulose- or amylose- based columns in the normal separation mode have mostly been used [13,19-23]. OBIN, 2,2´-diamino-1,1´-binaphthalene and 1,1´-bi-2-naphthol bis(trifluoromethane sulfonate) have been separated on newly developed synthetic polymeric chiral stationary phases – P-CAP, P-CAP-DP, DEABV and DPEVB [24]. 10 2 OBJECTIVES OF THE THESIS This work is aimed to study the retention and enantioseparation behavior of 2,2´- disubstituted and 2,3,2´-trisubstituted 1,1´-binaphthyls and 3,8´-disubstituted 1,2´- binaphthyls (see Fig. 1) on three different types of chiral stationary phases based on: (i) β-cyclodextrin, (ii) derivatized cellulose and (iii) synthetic polymers under various experimental conditions. The obtained results, related to different interaction and enantiodiscrimination mechanisms were critically compared. 1 R1 = H; R2 = R3 = O C CH3 O 2 R1= COOH R2 = OH R3 = NH 3 R1 = H; R2 = NH C CH3 R3 = OH R1 O R2 4 R1 = H; R2 = O C N(CH3)2 R3 = S C N(CH3)2 R3 S O 5 R1 = H; R2 = R3 = O C N(CH3)2 S 6 R1 = H; R2 = R3 = S C N(CH3)2 O 7 R1 = COOH; R2 = NH2; R3 = OH 8 R1 = H; R2 = R3 = OH O C 9 R1 = O CH3 HN CH3 R1 10 R1 = OH Fig. 1: Structures of the studied binaphthyl derivatives. 11 3 RESULTS AND DISCUSSION 3.1 Study of the influence of experimental conditions on the retention and enantioseparation of series of newly synthesized disubstituted binaphthyls Separation on β–cyclodextrin bonded CSP The enantioseparation was carried out in two separation modes – normal and reversed-phase. The molecules of substituted binaphthyls have a non-polar character so for that reason the normal separation mode was used as the first choice. The mobile phases (MP) consisted of n-hexane/propan-2-ol in various volume ratios. Retention of the analytes increased when the amount of n-hexane in mobile phase increased, but no enantioseparation was observed. The reversed-phase separation mode was carried out in binary mobile phases consisted of acetonitrile (ACN) or methanol (MeOH) as the organic modifier and water. Water was later replaced by triethylamine acetate (TEAA) buffer of two different pH values – 3.0 and 6.0. All the analytes eluted in death time when ACN was used as the organic modifier. Better results were observed in the mobile phase containing MeOH. High amount of methanol (50 - 100 vol. % ) led to short retention times with no enantioseparation. As the amount of methanol decreased, the analytes were more retained and enantioseparation was observed in some cases. The appropriate mobile phase composition was proved to be MeOH/water 30/70 (v/v), in which all the analytes eluted with retention times ranging from 6 to 12 minutes, except of analyte 2 (Fig. 1). Just one representative of the group of 2,2´-substituted 1,1´-binaphthyls, analyte 1, was partly separated into enantiomers (see Tab. 1). The best resolution of 8,3´-disubstituted- 1,2´-binaphthyls was achieved in mobile phases consisted of MeOH/water 30/70 (v/v) and 20/80 (v/v) for 9 and 10, respectively. 12 Table 1: Retention parameters of binaphthyl derivatives enantioseparated on β- cyclodextrin-based column, mobile phase MeOH/water, flow rate 0.7 mL/min and detection wavelength 254 nm. MeOH/H2O (v/v) 20/80 30/70 Analyte k1 R α k1 R α 1 2.9 0.5 1.2 0.8 0.2 1.1 9 2.5 0.5 1.3 1.1 0.9 1.1 10 2.1 2.2 1.3 1.1 0.4 1.2 Replacement of water for 0.5% TEAA buffer, pH 3.0, provided considerable retention decrease, which indicates more effective reduction of silanophyl interactions between analyte and silica gel. These interactions are characteristic for this type of chiral columns. Higher pH led also to shorter retention times in comparison with the mobile phase consisted of MeOH and water. The peak symmetry, resolution and efficiency were not affected by the change in composition of the aqueous part of the mobile phase. Separation on hydroxypropylether-β-cyclodextrin bonded CSP As the results have shown, the chiral stationary phase based on native β- cyclodextrin is not effective for the enantioseparations of the studied compounds. Inclusion complexes are probably formed in reversed-phase separation mode in the mobile phase used but this interaction does not have any stereodiscriminative character. In further experiments hydroxypropylether-β-cyclodextrin (HP-β-CD) CSP was used. The hydroxyl group is bonded to the second carbon atom in the glucose structure and in this way the molecule of the substituted cyclodextrin is enlarged and offers other interaction possibilities for the analytes (steric repulsions, hydrogen bonds). Normal separation mode Firstly the normal separation mode (realized in the same way as for β-CD CSP ) was tested but no enantioseparation occurred. The retention factors acquired with the β- CD CSP were lower than these obtained with HP-β-CD CSP, whereas the asymmetry values were proved to be better on the latter column. 13 Non-chiral separations of binaphthyl mixtures can be applied in normal separation mode for the analysis of binaphthyl derivatives that can occur during the process of asymmetric synthesis because the required derivative can be accompanied by some side products. Reversed-phase separation mode Based on the results obtained with the β-CD CSP binary MP consisted of MeOH/water mixtures with MeOH content between 30 - 40% on HP-β-CD CSP. Higher amount of MeOH in the mobile phase resulted in the faster elution. The retention gained on the HP-β-CD column was in most cases higher than the retention on β-CD CSP. In spite of the higher retention and better values of asymmetry, the experiments carried out on hydroxypropyl-β-cyclodextrin column did not lead to enantioseparation of all the studied analytes. Analyte 1 as the representative of the group of disubstituted 1,1´-binaphthyls was separated in 23 minutes with resolution value R = 1.0 and partial enantioseparation of analytes 2, 4 and 8 was observed, too. Both studied 8,3´-substituted 1,2´-binaphthyls were successfully enantioseparated in the mobile phase composed of MeOH/water 30/70 (v/v) with the values of resolution R = 1.1 for analyte 9 and R = 1.9 for analyte 10. The use of TEAA buffer, pH 3.0 or 6.0, instead of water led to shorter retention, which was accompanied with a decrease of peak symmetry of all the studied analytes. Only analyte 9 gained the highest resolution value (R = 1.5) in MP containing TEAA buffer, pH 3.0, but its peak symmetry deteriorated. Conclusions: β–Cyclodextrin based chiral stationary phases did not provide sufficient enantioseparation ability for the studied analytes but these chiral selectors can be successfully used for separations of mixtures of these compounds produced during the synthesis process. 14 3.2 Cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)-based chiral stationary phases as effective tools for enantioselective HPLC separation of structurally different disubstituted binaphthyls CSPs based on cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) exhibit a particularly high chiral recognition for a variety of racemic compounds. Applicability of coated versions of these CSPs to mobile phases of various polarities is limited [25]. Two cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) coated CSPs have been examined - one designed for normal mode and the other for reversed-phase separations of the synthesized atropoisomers of differently substituted binaphthyls. Normal separation mode Based on the structure of the substituted binaphthyls [13], the normal phase separation mode was the first choice for the study of the retention and enantioseparation behavior of the selected 1,1´- and 1,2´- binaphthyl derivatives. The mobile phases were prepared by mixing n-hexane and propane-2-ol at various volume ratios, ranging from 5 to 80 vol. % of propane-2-ol. In general, higher propane-2-ol contents resulted in a lower retention. The enantioseparation of four analytes (1, 4, 9, 10) in MP composed of n-hexane/propane-2-ol 95/5 (v/v) was observed, with baseline separation of three compounds. The baseline enantioseparation of analyte 4 was achieved in a very short separation time in the mobile phase with 20% vol. propan-2-ol (see Fig. 2A). In comparison with the retention of the 1,1´-binaphthyls, both the disubstituted 1,2´- binaphthyls exhibited longer retention times (particularly sample 9) with markedly higher values of enantioresolution (see Fig. 2B) which were just slightly affected by changes in the mobile phase composition. 15 Fig. 2: Enantioseparation of analyte 4 (A) and analyte 9 (B) on CSP based on tris(3,5- dimethylphenylcarbamate) cellulose. Experimental conditions: Chiralcel OD-H (150 x 4.6 mm I.D.) column, mobile phase n-hexane/propane-2-ol, 80/20 (v/v); flow rate 0.7 mL/min, UV detection at 254 nm. Reversed-phase separation mode In the reversed-phase separation mode mobile phases consisted of ACN and water or a 20 mM phosphate buffer, pH 3.0 or 6.0. The amount of ACN in the MP ranged between 80 – 30 vol. %. Lower acetonitrile contents led to a higher retention of all the analytes, especially analytes 1, 4, 5, 6, 8 and 9 exhibited very long retention times in the MPs with 40% or 30% ACN. In general, increased retention times result in an improved enantioresolution of most of the analytes. However, no partial enantioresolution was observed for analytes 2, 5, 6 and 8. On the contrary, both the representatives of 8,3´-disubstituted 1,2´- binaphthyls (analytes 9 and 10) provided high values of enantioresolution, even in mobile phases with high acetonitrile contents. Compound 7 showed rather high sensitivity to MP composition. Both hydrogen donor and acceptor groups, which are sensitive to ACN/water ratio, are available in analyte 7. No other analyte studied offers such possibilities for hydrogen bonding. The influence of the acetonitrile content in the buffered mobile phases, pH 3.0 or 6.0, on the retention is similar to that observed in the unbuffered separation systems, i.e., a decrease in the acetonitrile content leads to a higher retention with better values of enantioresolution for most of the analytes. The effect of the phosphate buffer pH is 16 illustrated in Fig. 3. The retention is increased and the resolution substantially improved at lower pH values (see Table 2). Fig. 3: A chromatogram of enantioseparation of sample 7, Chiralcel OD-RH (150 x 4.6 mm I.D.) column, ACN/20 mM phosphate buffer, pH 3.0 or 6.0, 40/60 (v/v); flow rate 0.7mL/min, UV detection at 254 nm. Table 2: Effect of the acetonitrile content and buffer pH on the chromatographic data of all the studied binaphthyl derivatives; ACN/20 mM phosphate buffer, pH 3.0, at three volume ratios, Chiralcel OD-RH column, mobile phase –flow rate 0.7 mL/min, UV detection at 254 nm. ACN/20 mM phosphate buffer, pH 3.0 Sample 60/40 50/50 40/60 k1 R α k1 R α k1 R α 1 2.74 0.63 1.05 6.56 0.72 1.05 10.48 1.79 1.13 2 1.12 0.00 1.00 2.91 0.59 1.05 13.90 0.74 1.10 3 0.79 1.25 1.16 1.60 1.66 1.14 4.65 2.14 1.15 4 4.77 0.95 1.06 11.59 1.09 1.07 x x x 5 5.14 0.00 1.00 16.72 0.00 1.00 x x x 6 3.13 0.00 1.00 8.10 0.00 1.00 x x x 7 1.02 4.37 1.55 2.30 5.64 1.55 7.12 6.93 1.58 8 1.43 0.00 1.00 3.27 0.00 1.00 10.32 0.00 1.00 9 2.74 4.41 1.37 5.62 4.87 1.37 16.50 4.96 1.38 10 1.35 3.68 1.41 2.70 4.46 1.40 7.05 4.96 1.42 x – retention time of analyte was longer than 120 minutes 17 Comparing the results obtained in the unbuffered and buffered mobile phases with the same ACN contents, differences in the retention and enantioseparation can mostly be found in the mobile phases with the lowest acetonitrile content (40 vol. %) and at lower buffer pH value (3.0). These differences are mostly pronounced for samples 1, 2 and 7. The enantioresolution of these three compounds was improved in the buffered mobile phase (pH 3.0) while the retention factors were affected in different ways. The reduced retention of compound 1 in the mobile phase with the phosphate buffer, pH 3.0, is still accompanied by an increased resolution value. The samples 2 and 7 contain in their structures functional groups capable of creating hydrogen bonds. The H-bonding interactions are stereoselective and an increase in their strength results in a stronger retention and improved enantioseparation in the separation system with the cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) chiral selector and the mobile phase buffered to pH 3.0. As the strength of the hydrogen bonding is considerably influenced by the organic modifier present in the mobile phase, the differences are more pronounced in the mobile phases with low acetonitrile contents. Comparing the separation behavior of analytes 2 and 7 in identical mobile phases demonstrates that the bulky aromatic substituent of the amino group near the hydroxyl group in analyte 2 substantially reduces the strength of the stereoselective H-bonding. This result can be documented on higher retention versus lower resolution values of analyte 2 against analyte 7 (Table 2). Unfortunately, no partial enantioresolution was observed for samples 5, 6 and 8. These analytes have the most symmetrical structure of all the compounds studied, which is difficult to enantioresolve. The replacement of water with the buffer solution only slightly affects the retention and enantioresolution of 8,3´-disubstituted 1,2´-binaphthyls. The retention factors and the high values of enantioresolution remain almost unchanged. The steric arrangement of this type of derivatives probably improves their fitting to the chiral cavities of cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) and a substitution, especially in position 8, provides a supplementary stereoselective interaction. Based on the results attained in the reversed-phased separation mode, the best mobile phase composition for analytes 1, 2 and 7 was ACN/20 mM phosphate buffer, 18 pH 3.0, 40/60 (v/v). Compounds 3, 9 and 10 yielded better results in ACN/water 40/60 (v/v). The resolution values obtained for analytes 9 and 10 in the ACN/water mobile phase enable direct use of the method developed in a semi-preparative mode. As a compromise among the demands on the solubility, retention and resolution, the mobile phase composition ACN/water 60/40 (v/v) was selected for analytes 9 and 10. Mobile phase composed of ACN/0.1% acetic acid, pH 3.3, 60/40 (v/v) was used for analyte 7. Overload conditions were attained by using various injection volumes (10, 50 and 100 μL) at the same concentration of analytes 7, 9 and 10, i.e., 5.0 mg/mL. A sufficient enantioresolution was preserved up to the injection volume, 50 μL (see Fig. 4). Fig. 4: Enantioseparation of sample 7 under semi-preparative conditions, Chiralcel OD- RH (150 x 4.6 mm I.D.), ACN/1%HAc, pH 3.3, 60/40 (v/v); flow rate 0.7mL/min, UV detection at 254 nm. Injected sample amount, 250 µg (sample concentration, 5.0 mg/mL, sample volume, 50 µL). Insert: The enantioseparation under analytical conditions - sample concentration 0.5 mg/mL, sample volume 10 µL. 19 Conclusions: Cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)-based CSPs have been found suitable for enantioseparation of most (7 from 10) of the studied binaphthyl derivatives. The separation system has also been proposed for semi-preparative application (for analytes 7, 9 and 10), which can be used for the preparation of these catalysts for asymmetric syntheses. The representatives of 8,3´-disubstituted 1,2´-binaphthyls (analytes 9 and 10) have been separated with the highest values of enantioresolution in all the mobile phases tested. This result can be attributed to the proper fit of these derivatives into the helical structure of cellulose. In addition, π-π interactions of the aromatic parts of the analytes with the tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) substituent on cellulose and hydrogen bonding or dipole-dipole interactions contribute to the enantiodiscrimination process. In the group of the 1,1´-binaphthyl derivatives, the best enantioseparation has been attained for analyte 7, which offers functional groups required for H-bonding. The comparison of the two separation modes studied (normal- and reversed-phase) shows that only analyte 4 from the family of 1,1´-binaphthyls and the two 8,3´- disubstituted 1,2´-binaphthyls can be baseline resolved in the normal phase separation mode, whereas the reversed-phase mode provides a more universal application. 20 3.3 Comparison of enantioseparation of substituted binaphthyls on cyclodextrin-, cellulose- and synthetic polymer-based chiral stationary phases This work was focused on the comparison of the enantiospearation behavior of selected binaphthyls on three types of chiral stationary phases: (i) CSPs based on β- cyclodextrin and hydroxypropylether-β-cyclodextrin; (ii) CSPs based on cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) and (iii) the last group of studied CSPs included three recently developed synthetic stationary phases – polymers based on trans-1,2- diaminocyclohexane, P-CAP, P-CAP-DP and DEABV (structures are depicted in Fig. 5) covalently bonded to silica gel support. These CSPs were prepared in the laboratory of Prof. Armstrong, The University of Texas at Arlington, USA. The measurements were carried out in normal and polar-orgnic separation modes. The retention and separation behavior of the studied binaphthyl on the first two types of CSPs was described in the previous (chapter 3.1 and 3.2) works. Therefore, only the enantioseparation behavior of the studied compounds on polymer-based CSPs will be discussed in this part. O O O HN HN NH O HN HN O O HN O silica O Si O Si N silica Si O Si gel CN O H O O O gel O HN HN HN NH HN HN HN HN HN NH O O O O O O O O NC (S) N N N (S) H Si O Si NO H SiO2 H N Si O Si N H2 H CN Poly-DEABV Fig. 5: Structures of polymer-based CSPs, left up – (R,R)-P-CAP, right up - (R,R)-P- CAP-DP, bottom – DEABV CSP. 21 Normal separation mode Mixtures of n-hexane or n-heptane and propan-2-ol or ethanol without or with addition of small amounts of acetic acid or trifluoroacetic acid were tested in NP. As could be expected, retention of the analytes increased with the increasing content of the nonpolar constituent in the mobile phase and the increase of retention was accompanied by improved enantioresolution. The most suitable n-hexane (n-heptane) to propan-2-ol (ethanol) ratio for P-CAP CSP was found 80/20 (v/v). Table 3 summarizes the results obtained by variation of this basic mobile phase composition. Addition of acetic acid or trifluoroacetic acid mostly resulted in drop of retention and resolution that was more pronounced with TFA. Table 3: Retention, enantioresolution and enantioselectivity values obtained on P-CAP CSP for analytes that exhibited at least partial enantioseparation of their atropoisomers in NP. 80/20 (v/v) 80/20/0,1 (v/v/v) Analyte HEX/IPA HEX/EtOH HEP/EtOH HEP/EtOH/HAc HEX/IPA/TFA HEP/EtOH/TFA k1 2.62 3.92 4.23 2.72 2.54 0.85 3 R 0.91 0.85 0.75 0.64 1.06 0.00 α 1.15 1.07 1.06 1.06 1.13 1.00 k1 x x x x 1.27 2.21 7 R x x x x 1.62 0.69 α x x x x 1.22 1.10 k1 9.98 11.23 11.24 8.73 9.04 2.15 8 R 3.43 5.02 4.22 4.52 3.66 2.93 α 1.59 1.43 1.36 1.39 1.58 1.34 k1 3.56 4.82 4.81 3.98 3.74 0.96 10 R 1.97 2.28 2.28 1.93 1.96 1.00 α 1.36 1.19 1.18 1.17 1.35 1.15 x – analyte did not elute within 120 minutes. Separation of the derivatives with hydroxyl group in the position next to the single bond connecting the two naphthyl moieties – compounds 3, 7, 8, 10 – shows the importance of the H-bonding interaction in the enantioselective recognition mechanism of the atropoisomers on P-CAP CSP. The importance of H-bonding is supported by the fact that atropoisomers of compound 9, which has a very similar structure to compound 22 10 but misses the OH group, could not be, even partly, separated. The enantioseparation of analytes 7 and 8 is illustrated in Fig. 6. Analyte 7 R = 1.6 Analyte 8 R = 5.0 Response [mAU] 20 40 60 80 Time [min] Fig. 6: Chromatograms of enantioseparation of analytes 7 and 8 on P-CAP (250 x 4.6 mm I.D.) CSP, mobile phase: for analyte 7 n-hexane/propane-2-ol/TFA 80/20/0.1 (v/v/v), for analyte 8 n-hexane/ethanol 80/20 (v/v); flow rate 0.7mL/min, UV detection at 254 nm. On DEABV CSP higher retention than on the P-CAP column was observed in mobile phases of the same composition. Therefore, the optimized mobile phase composition (n-heptane/IPA 70/30 (v/v)) contained lower amount of n-heptane. The effect of addition of 0.1 % HAc to the mobile phase on chromatographic parameters of the studied compounds was minute. Partial enantioresolution of analytes 8 (R = 0.5), 9 (R = 1.3) and 10 (R = 1.0) was observed. Comparing the P-CAP and DEABV CSPs, better results – resolution, peak symmetry and separation efficiency values - were obtained on the P-CAP column. The results obtained on column P-CAP-DP showed that this column is not suitable for enantioseparation of the binaphthyl derivatives in the normal phase mode. 23 Polar-organic separation mode In polar-organic (PO) mode the mobile phases were composed of acetonitrile and small portions of methanol with HAc, TFA or triethylamine as aditives affecting dissociation/protonation of either analytes or functional groups of the chiral selectors. Retention increased with increased acetonitrile contents in the mobile phase on all these polymer-based columns. Addition of 0.1% HAc to the mobile phase resulted in decreased retention on P-CAP and P-CAP-DP CSPs while it did not much affect retention on DEABV column. Peak symmetry and separation efficiency were improved also in acidified mobile phases; this effect was less noticable on DEABV CSP. The results of some interest for enantioseparation of binaphthyls are summarized in Table 4. Five compounds were at least partly separated on P-CAP CSP. Analytes 2 and 7 (missing in this Table) were enantioresolved just in mobile phase consisted of ACN/MeOH 95/5 (v/v) + 10 mM HAc and TEA with the values of enantioresolution R = 1.20 for analyte 2 and R = 0.60 for analyte 7. Three analytes were separated on P- CAP-DP and DEABV CSP. From all the tested CSPs only DEABV column provided at least partial separation of compound 5 (Fig. 7). Table 4: Resolution and enantioselectivity values of 1,1´- or 1,2´-binaphthyls separated in polar-organic separation mode on the synthetic stationary phases P-CAP, P-CAP-DP and DEABV. Stationary phase P-CAP P-CAP-DP DEABV Analyte 3 8 10 8 10 5 9 10 Mobile phase (v/v) R α R α R α R α R α R α R α R α ACN/MeOH 95/5 0.54 1.07 3.64 1.37 1.64 1.18 0.00 1.00 1.47 1.28 0.60 1.08 1.33 1.17 1.40 1.16 ACN 0.75 1.11 3.82 1.54 1.29 1.19 0.78 1.13 2.31 1.37 0.61 1.09 1.40 1.17 1.35 1.17 ACN/MeOH/HAc 95/5/10 mM 0.57 1.07 3.86 1.37 1.88 1.19 0.49 1.06 1.53 1.27 0.58 1.08 1.27 1.16 1.37 1.16 ACN/HAc 100/10 mM 1.01 1.12 4.22 1.57 1.83 1.21 0.86 1.12 2.30 1.36 0.63 1.11 1.43 1.18 1.31 1.17 24 R = 0.63 150 Response [mAU] 100 50 0 3 4 5 Time [min] Fig. 7: Chromatogram of enantioseparation of analyte 5 in ACN/HAc 100/0.1 (v/v), DEABV (250 x 4.6 I.D.) column; flow rate 0.7mL/min, UV detection at 254 nm. Conclusions: At least partial enantioseparation of four analytes on P-CAP and three compounds on DEABV was observed in the NP mode. The best mobile phase composition was n-hexane/propane-2-ol/TFA 80/20/0.1 (v/v/v), where the highest values of enantioresolution were achieved on P-CAP CSP. All the separated analytes posses functional groups capable of H-bonding, which is important in the separation mechanism on P-CAP CSP. On DEABV CSP analytes 8, 9 and 10 were resolved into atropisomers in MP consisted of n-heptane/propane-2-ol 70/30 (v/v). Comparing the two CSPs – P-CAP and DEABV – better results were obtained on P-CAP column. The enantioseparation of seven compounds in PO mode was observed, five were enantioresolved on P-CAP and three compounds on P-CAP-DP and DEABV CSPs. Analyte 8 was separated with the highest enantioresolution on P-CAP CSP while the best results for analyte 10 were achieved on P-CAP-DP CSP. This derivative was as the only one separated on all three polymer-based CSPs. The enantioseparation of compounds 3 and 7 was obtained only on P-CAP CSP, analyte 2 was successfully separated on P-CAP and P-CAP-DP CSPs, and analytes 5 and 9 were enantioresolved on DEABV CSP. The complementarity of the three polymer-based stationary phases 25 was confirmed by the fact that on each of these CSPs enantioseparation of different binaphthyl derivatives was achieved. 26 4 CONCLUSION Table 5 gives an overview of the separations of the atropoisomers of individual binaphthyl derivatives in various separation systems investigated in this work. Table 5: Overview of the analytes separated on the CSPs studied in this work in NP, RP and PO separation modes (resolution values in parenthesis). Separation mode NP RP PO Chiral stationary phase Cyclobond I 2000 no separation 1 (0.5) 9 (0.9) 10 (2.2) - 1 (0.7) 2 (1.0) 4 (0.2) Cyclobond I 2000 RSP no separation - 8 (0.8) 9 (1.1) 10 (1.9) 1 (1.8) 2 (0.7) 3 (3.2) 4 Derivatized cellulose 1 (1.2) 4 (1.9) (1.2) - 9 (4.9) 10 (5.0) 7 (6.9) 9 (6.3) 10 (5.9) P-CAP 3 (1.1) 7 (1.6) - 2 (1.1) 3 (1.0) 7 (0.6) 8 (5.0) 10 (2.3) 8 (4.2) 10 (1.9) P-CAP-DP - - 2 (0.6) 8 (0.9) 10 (2.3) 8 (0.6) 9 (1.3) 10 DEABV (1.0) - 5 (0.6) 9 (1.4) 10 (1.4) - Enantioseparation behavior of analytes was not tested in the separation mode or the analytes did not elute within 120 minutes. The RP separation mode has been found more advantageous for enantioresolution of the majority of analytes on cyclodextrin- and cellulose-based CSPs. Concerning the cyclodextrin-bonded CSPs better enantioseparation has been obtained on the HP-β-CD CSP with MeOH/water mobile phases containing low portion of the organic modifier. On tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) cellulose-based CSP, lower content of acetonitrile (40 vol. %) in the ACN/water or ACN/phosphate buffer mobile phases provided sufficient retention of the binaphthyl derivatives to enable enantioresolution of the majority of these analytes. The best enantioseparation of 7 analytes from the total number of 10 on the cellulose-based column has been succeeded in the mobile phase composed of ACN/20 mM phosphate buffer, pH 3.0, 40/60 (v/v). Cellulose-based columns have been shown most suitable for enantioseparation of the studied analytes. Even semi-preparative separation mode could be employed with those CSP. 27 The recently introduced synthetic polymer-based CSPs have been suitable for enantioseparation of some of the binaphthyl derivatives in NP and PO separation modes. These CSPs were advantageous for enantioseparation of certain analytes that could not be successfully separated on cyclodextrin-bonded or cellulose-bonded CSPs. 28
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Lucie Loukotková, Ph.D. 596 kB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Lucie Loukotková, Ph.D. 185 kB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Lucie Loukotková, Ph.D. 141 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Lucie Loukotková, Ph.D. 106 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Ladislav Feltl, CSc. 1.19 MB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Miroslav Flieger, CSc. 1.3 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 702 kB