velikost textu

Effects of chemopreventive compounds on cytochrome P450s

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Effects of chemopreventive compounds on cytochrome P450s
Název v češtině:
Vliv chemopreventivních látek na cytochromy P450
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Jitka Koblihová
Školitel:
prof. RNDr. Petr Hodek, CSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Otto Helia, CSc.
RNDr. Radka Václavíková, Ph.D.
Id práce:
83616
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
25. 10. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
chempreventivních sloučeniny, cytochrom P450, indukce, metabolismus
Klíčová slova v angličtině:
chempreventive compou, cytochrome P450, induction, metabolism
Abstrakt:
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Vliv chemopreventivních látek na cytochromy P450 Autoreferát dizertační práce RNDr. Jitka Křížková Školitel: prof. RNDr. Petr Hodek, CSc. Praha 2010 Úvod Úvod Podle statistických údajů Světové zdravotnické organizace je rakovina již 50 let celosvětově jednou z hlavních příčin úmrtí v lidské populaci. Rakovina tlustého střeva a konečníku a rakovina gastrointestinálního traktu patří mezi hlavní typy rakovin přispívající k celkové úmrtnosti na rakovinu. Prevence založená na zdravém životním stylu včetně vhodné stravy jsou považovány za jeden z hlavních přístupů, jak dosáhnout snížení rizika rakoviny. V uplynulých letech se významně zvýšila spotřeba a užití potravinových doplňků s obsahem koncentrovaných chemopreventivních fytochemikálií. Flavonoidy, jako nejpopulárnější zástupci této skupiny, jsou přítomny v potravinách (ovoce, zelenina, byliny, nápoje) a v potravinových doplňcích. Je poměrně neznámým faktem, že tyto sloučeniny mohou modulovat aktivitu enzymů metabolizujících cizorodé látky (xenobiotika) [Hodek a kol., 2002]. Z celé řady proteinů reagujících s flavonoidy hrají nejvýznamnější roli právě cytochromy P450 (CYP), monooxygenázy metabolizující xenobiotika (např. léčiva a karcinogeny). Členové podrodiny CYP1A, CYP1A1 a CYP1A2, se účastní aktivace prokarcinogenu, jako jsou například polycyklické aromatické uhlovodíky, aromatické aminy a heterocyklické aminy [Eaton a kol., 1995; Rendic a Di Carlo, 1997]. Vyšší exprese a aktivita CYP1A1 bývá spojována s rizikem rakoviny plic, tlustého střeva a konečníku. CYP1A2 je navíc odpovědný za metabolizmus řady často užívaných léčiv, jako jsou fenacetin, kofein, imipramin, a také se účastní aktivace prokarcinogenů. Enzymy podrodiny CYP1A mohou být indukovány aromatickými uhlovodíky. Aktivace se účastní specifický receptor nazývaný Ah receptor. Po navázání indukující látky na tento receptor se tvoří heterodimer s AhR jaderným translokátorem, který se poté váže na „xenobiotický responzivní element“, a tak působí jako zesilovač transkripce příslušných genů [Ortiz de Montellano, 2005]. 1 Úvod Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) a heterocyklické aminy (HCA) představují dvě skupiny potenciálních karcinogenů aktivovaných podrodinou CYP1A. PAU vznikají během nedokonalého spalování nebo pyrolýzy organických látek a během některých výrobních procesů. Lidé jsou vystavováni PAU různými způsoby. Primární cestou expozice je inhalace znečištěného vzduchu, kouře v důsledku spalování dřeva a cigaretového kouře, a také požití kontaminované vody a potravin, které běžně obsahují mikrogramová množství PAU. Expozice heterocyklickým aminům v potravě je považována za možnou příčinu vzniku rakoviny u lidí. Tyto látky vznikají celkem běžně během tepelné úpravy červeného masa, drůbeže a ryb [Sinha a kol., 2000]. HCA se tvoří v poměrně vysokých koncentracích kondenzací kreatininu s aminokyselinami. Intenzivně je studována úloha 2-amino-1-methyl-6-phenyl- imidazo[4,5-b]pyridinu (PhIP) a dalších HCA jako možných příčin vzniku rakoviny u lidí, konkrétně rakoviny tlustého střeva a prsu [Snyderwine, 1994; Nagao a kol., 1994]. Molekulární podstata aktivace těchto karcinogenů v organizmu však dosud nebyla zcela objasněna, zejména v kontextu jejich interakcí s dalšími xenobiotiky. 2 Cíl dizertační práce Cíl dizertační práce Cílem předkládané práce je rozšířit současné znalosti o úloze chemopreventivních látek v procesu karcinogeneze. Rostoucí spotřeba potravinových doplňků, které obsahují tyto látky (např. flavonoidy), vyvolává obavy týkající se jejich vedlejších účinků, které nejsou dostatečně známy. Práce se zaměřuje na výzkum účinků chemopreventivních látek, nikoli jako inhibitorů enzymů aktivujících karcinogeny, ale jako induktorů. Mezi jejich opomíjené a málo sledované účinky patří například opakované nebo jednorázové perorální podání, přetrvávání indukce nebo sekvenční expozice organizmu chemopreventivním látkám a karcinogenům. Při řešení uvedené problematiky bylo nutné splnit následující úkoly: • Optimalizovat imunochemickou detekci CYP1A v mikrosomálních vzorcích (játra, tenké střevo) s využitím slepičích protilátek proti CYP1A1 a CYP1A2, a rovněž stanovit specifické aktivity CYP1A1 a CYP1A2 pomocí „markerových“ substrátů. • Posoudit schopnost zástupců různých skupin chemopreventivních látek po perorálním podání indukovat CYP1A1 a CYP1A2 v játrech a tenkém střevu potkana, což jsou dva hlavní orgány odpovědné za metabolizmus xenobiotik, které se podílejí na aktivaci karcinogenů. • Vyhodnotit příslušné účinky chemopreventivních látek na expresi a specifické aktivity cytochromů P450 v různých časových a dávkovacích režimech. • Provést sekvenční studii, v rámci které je potkanům nejprve podána indukující chemopreventivní látka a s určitým časovým odstupem 32P-postlabelling indukující nebo neindukující karcinogen, a metodou vyhodnotit aktivaci karcinogenu na základě tvorby aduktů s DNA. 3 Výsledky a diskuze Výsledky a diskuze Výzkum byl prováděn z několika pohledů, aby bylo možné co nejdůkladněji posoudit indukční účinky chemopreventivních látek na cytochromy P450 podrodiny 1A. Nejprve byla testována široká škála chemopreventivních látek, jmenovitě kurkuminy, stilbeny, organo-siřičité sloučeniny a flavonoidy. Byla stanovena proteinová exprese a aktivita CYP1A1 a CYP1A2 k posouzení schopnosti chemopreventivních látek, perorálně podávaných potkanům, indukovat CYP1A v játrech a tenkém střevě potkana. Tyto dva orgány jsou hlavními místy metabolizmu xenobiotik. Indukční účinky na CYP1A1 a CYP1A2 byly zkoumány v různých časových a dávkovacích režimech pomocí optimalizované metody „Western blotting“ s využitím primárních slepičích protilátek, které byly ošetřeny tak, aby se zabránilo nežádoucím interferencím vlivem keratinového znečištění preparátů, a dále pomocí měření aktivit za použití specifických substrátů 7-ethoxyresorufinu pro CYP1A1 a 7-methoxyresorufinu pro CYP1A2. β-Naftoflavon (BNF), známý induktor podrodiny CYP1A, byl v celé studii použit jako referenční látka. V obou tkáních, v játrech i v tenkém střevě, byla prokázána jeho silná indukční schopnost. β-Naftoflavon proto v celé studii sloužil jako pozitivní kontrola. Režim I Byly posuzovány indukční účinky široké škály chemopreventivních látek na CYP1A1 a CYP1A2 po pětidenní aplikaci látek gaváží do žaludku. Jak vyplývá z obrázku 1, nejúčinnějším neflavonoidním induktorem CYP1A1 byl v obou tkáních diallyl sulfid, jenž rovněž indukoval CYP1A2 v játrech. Nejúčinnějšími flavonoidními induktory aktivit EROD a MROD a exprese CYP1A byly aglykony flavonoidů: β-naftoflavon, flavon, flavanon, morin. 4 Výsledky a diskuze A) B) Obrázek 1 Vliv podání neflavonoidních látek v tenkém střevě (A) a játrech (B). Aktivity EROD (CYP1A1) a MROD (CYP1A2) byly stanoveny v mikrosomech izolovaných z potkaních jater a proximální části tenkého střeva po vystavení neflavonoidním chemopreventivním látkám (60 mg/kg tělesné hmotnosti) po dobu 5 dní. Imunodetekce CYP1A1/2 byla provedena v játrech a v proximální části tenkého střeva potkana. Tenké střevo, jako orgán vysoce exponovaný cizorodým látkám, bylo dále rozděleno na dvě případně tři části. Obrázek 2 ukazuje, že vyšší exprese a aktivita CYP1A1 byla vždy zjištěna v proximální části tenkého střeva v porovnání s distální částí po podání β-naftoflavonu, morinu a rutinu. Avšak podání quercetinu a isoquercitrinu vedlo k nejvyššímu nárůstu ve střední části tenkého střeva (data neuvedena). 5 Výsledky a diskuze Obrázek 2 Vliv podání chemopreventivních látek v tenkém střevě. Aktivita EROD (CYP1A1) byla stanovena v proximální (P) a distální (D) části tenkého střeva potkana po vystavení chemopreventivním látkám (60 mg/kg tělesné hmotnosti) po dobu 5 dní. Imunodetekce CYP1A1 byla provedena v proximální a distální části tenkého střeva potkana. Režim II Další část studie byla založena na jednorázovém podání chemopreventivních látek za účelem stanovení jejich indukční schopnosti v nízkých dávkách. Rovněž bylo sledováno přetrvávání zvýšené exprese CYP. Příslušné účinky na expresi a specifické aktivity CYP byly opět hodnoceny v tenkém střevě a játrech potkana 24, 48 a 72 hodin od perorálního podání vybraných látek (Obr. 3 a Obr. 4). Obrázek 3 Vliv flavonoidů v tenkém střevě v různých intervalech od podání. Aktivita EROD (CYP1A1) byla stanovena v proximální (P), střední (M) a distální (D) části tenkého střeva potkana 24, 48 a 72 hodin od jednorázového podání flavonoidů (60 mg/kg tělesné hmotnosti). Imunodetekce CYP1A1 byla provedena v proximální, střední a distální části tenkého střeva potkana. 6 Výsledky a diskuze Obrázek 4 Vliv flavonoidů v játrech v různých intervalech od podání. Aktivita EROD (CYP1A1) byla stanovena v jaterních mikrosomech z potkana 24, 48 a 72 hodin od jednorázového podání flavonoidů (60 mg/kg tělesné hmotnosti). Imunodetekce CYP1A1 byla provedena v játerních mikrosomech potkana. Výsledky získané se střevními částmi naznačují významnou roli struktury látky a jejího metabolizmu v procesu dostupnosti v organizmu. Režim III V dalších experimentech byl induktor (β-naftoflavon) a běžně dostupné karcinogeny (benzo[a]pyren nebo PhIP) podávány postupně. Na základě výsledků s β-naftoflavonem ve výše uvedených experimentech byl vybrán interval 72 hodin mezi jednotlivými podáními. Časový odstup byl zvolen tak, aby se zabránilo možné inhibici aktivačních enzymů způsobené přítomností chemopreventivních látek, a zároveň aby indukční efekt stále přetrvával. 7 Výsledky a diskuze Z obrázku 5 je patrné, že v tenkém střevě vedlo podání β-naftoflavonu ke zvýšení aktivity EROD, a také exprese CYP1A1 ve všech částech tenkého střeva při nízké dávce PhIP (PhIP1, 50 mg/kg). Naopak vysoká dávka PhIP (PhIP2, 150 mg/kg) vedla ke ztrátě aktivity EROD u potkanů premedikovaných β-naftoflavonem, zatímco exprese CYP1A1 se výrazně nezměnila. Podobně jako v případě podání obou látek BNF i PhIP2, kombinace β-naftoflavonu a benzo[a]pyrenu nezvýšila aditivně expresi a aktivitu CYP1A1 ve srovnání s jednotlivě podanými látkami. Obrázek 5 Aktivita EROD (CYP1A1) v tenkém střevě. Mikrosomy byly izolovány z proximální, střední a distální části tenkého střeva potkana po vystavení β-naftoflavonu a/nebo karcinogenům. Imunodetekce CYP1A1 byla provedena v proximální, střední a distální části tenkého střeva potkana. 8 Výsledky a diskuze V játrech (Obr. 6) kombinace β-naftoflavonu a benzo[a]pyrenu vedla k značnému zvýšení aktivity EROD a MROD ve srovnání s jednotlivě podanými látkami, zejména u CYP1A2. Toto naznačuje potenciální synergický efekt obou těchto látek. Podobně, jako v případě tenkého střeva, nebyl pozorován žádný výrazný efekt po podání β-naftoflavonu v kombinaci s PhIP. Obrázek 6 Aktivita EROD (CYP1A1) a aktivita MROD (CYP1A2) v játrech. Mikrosomy byly izolovány z jater potkana po vystavení β-naftoflavonu a/nebo karcinogenům. Imunodetekce CYP1A1 a CYP1A2 byla provedena v jaterních mikrosomech potkana. Tvorba aduktů karcinogenu s DNA se obecně považuje za důležitý genotoxický krok v procesu iniciace karcinogeneze. Proto je množství aduktů karcinogenu s DNA dalším markerem pro posuzování rizika vzniku rakoviny. Oba karcinogeny, benzo[a]pyren a PhIP, jsou přeměňovány in vivo, což vede k jejich aktivaci a/nebo detoxikaci. Množství aduktů BaP s DNA se podařilo 32P-postlabelling stanovit metodou v proximální a distální části tenkého střeva (Tab. 1). Premedikace β-naftoflavonu výrazně zvýšila množství aduktu 1 BaP 9 Výsledky a diskuze s DNA (adukt tvořený z 9-hydroxy-BaP) v proximální části tenkého střeva. Celkové množství aduktů BaP s DNA v proximální části je téměř dvakrát vyšší než v distální části. Toto zjištění je v souladu s vyšší expresí CYP v proximální části tenkého střeva ve srovnání s distální částí, která byla zjištěna jak imunochemicky, tak měřením aktivity příslušných CYP. Tabulka 1 Množství aduktů benzo[a]pyrenu s DNA. RAL/108 nukleotidů Vzorek DNA Skvrna 1 Skvrna 2 Skvrna 3 Celkem část tenkého střeva BaP proximalní 3,85 2,82 4,39 11,06 βNF+BaP proximalní 5,15 2,97 3,96 12,08 BaP distální 4,40 1,56 1,64 7,60 βNF+BaP distální 4,02 1,85 2,46 8,33 β-Naftoflavon a/nebo benzo[a]pyren byly podány potkanům a v proximální a distální části tenkého střeva byly stanoveny adukty s DNA. RAL, „relative adduct labelling“ Skvrna 1 – adukt tvořený z 9-hydroxy-BaP Skvrna 2 - hlavní dGp adukt (dG-N2-BPDE) Skvrna 3 – neidentifikovaný adukt 32P-postlabelling Hodnoty získané metodou velmi dobře odpovídají výsledkům imunodetekce a měřením specifických aktivit, kdy premedikace β-naftoflavonem nezvýšila významně žádné sledované hodnoty oproti samotnému podání BaP. Benzo[a]pyren je známý jako silný induktor podrodiny CYP1A, proto je možné, že již po podání samotného BaP nebo BNF bylo dosaženo maximální hladiny indukce. Adukty PhIP s DNA budou v nejbližší době stanoveny nově vyvíjenou technikou kapalinové chromatografie s přepínáním kolon ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií [Singh a kol., 2010]. 10 Výsledky a diskuze Tato práce vznikla za podpory Grantové agentury České republiky (305/09/H008), Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy (MSM 0021620808) a dále Grantové agentury Univerzity Karlovy (4909). 11 Použitá literatura Použitá literatura Eaton D. L., Gallagher E. P., Bammler T. K., Kunze K. L. (1995): Role of cytochrome P4501A2 in chemical carcinogenesis: implications for human variability in expression and enzyme activity, Pharmacogenetics, 5, 259-274. Hodek P., Trefil P., Stiborová M. (2002): Flavonoids-potent and versatile biologically active compounds interacting with cytochromes P450, Chem Biol Interact, 139, 1-21. Nagao M., Ushijima T., Wakabayashi K., Ochiai M., Kushida H., Sugimura T., Hasegawa R., Shirai T., Ito N. (1994): Dietary carcinogens and mammary carcinogenesis. Induction of rat mammary carcinomas by administration of heterocyclic amines in cooked foods, Cancer, 74, 1063-1069. Ortiz de Montellano P. R. (ed.) (2005): Cytochrome P-450: Structure, Mechanism and Biochemistry. Third edition, Plenum Publishers, New York Rendic S., Di Carlo F. J. (1997): Human cytochrome P450 enzymes: a status report summarizing their reactions, substrates, inducers, and inhibitors, Drug Metab Rev, 29, 413-580. Singh R., Arlt V. M., Henderson C. J., Phillips D. H., Farmer P. B., Gamboa da Costa G. (2010): Detection and quantitation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2- amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine adducts in DNA using online column-switching liquid chromatography tandem mass spectrometry, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 878, 2155-2162. Sinha R., Gustafson D. R., Kulldorff M., Wen W. Q., Cerhan J. R., Zheng W. (2000): 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine, a carcinogen in high-temperature-cooked meat, and breast cancer risk, J Natl Cancer Inst, 92, 1352-1354. 12 Použitá literatura Snyderwine E. G. (1994): Some perspectives on the nutritional aspects of breast cancer research. Food-derived heterocyclic amines as etiologic agents in human mammary cancer, Cancer, 74, 1070-1077. 13 Seznam publikací Seznam publikací Původní práce Petr Hodek, Pavel Hanuštiak, Jitka Křížková, Radka Mikelová, Soňa Křížková, Marie Stiborová, Libuše Trnková, Aleš Horna, Miroslava Beklová, René Kizek (2006): Toxicological aspects of flavonoid interaction with biomacromolecules, Neuroendocrinol Lett, 27, 14-17. IF = 0.924 Jitka Křížková, Kamila Burdová, Petr Hodek, René Kizek, Marie Stiborová (2007): Effects of a flavonoid structure on cytochromes P450 induction, Chem Listy, 101, 206-208. IF = 0.683 Jitka Křížková, Kamila Burdová, Jiří Hudeček, Marie Stiborová, Petr Hodek (2008): Induction of cytochromes P450 in small intestine by chemopreventive compounds, Neuroendocrinol Lett, 29, 717-721. IF = 1.359 Petr Hodek, Jitka Křížková, Kamila Burdová, Miroslav Šulc, René Kizek, Jiří Hudeček, Marie Stiborová (2009): Chemopreventive compounds—View from the other side, Chem Biol Interact, 180, 1-9. IF = 2.457 Petr Hodek, Martina Teplá, Jitka Křížková, Marie Stiborová (2009): Modulation of cytochrome P450 enzyme system by selected flavonoids, Neuroendocrinol Lett, 30, 67-71. IF = 1.047 Jitka Křížková, Kamila Burdová, Marie Stiborová, Vladimír Křen, Petr Hodek (2009): The effects of selected flavonoids on cytochromes P450 in rat liver and small intestine, Interdisc Toxicol, 2, 201-204. Dosud bez IF Manuskript v přípravě Jitka Křížková, Petr Hodek, Miroslav Šulc: Chicken antibodies in Western blots: How to avoid potential keratin cross-reactivity 14
Abstract v angličtině:
CHARLES UNIVERSITY IN PRAGUE Faculty of Science Department of Biochemistry Effects of chemopreventive compounds on cytochrome P450s Summary of Ph.D. Thesis RNDr. Jitka Křížková Supervisor: prof. RNDr. Petr Hodek, CSc. Prague 2010 Introduction Introduction According to the World Health Organization statistics, cancer is one of the leading causes of death in the human population worldwide for more than 50 years. Moreover, colorectal and gastrointestinal tract cancers are one of the main types of cancer leading to overall cancer mortality. Prevention consisting in a healthy lifestyle and a natural diet is suggested to be one of the main approaches to reduce cancer risk. In recent years, the consumption and use of dietary supplements containing concentrated chemopreventive phytochemicals increased dramatically. Flavonoids, as the most popular representatives of chemopreventive compounds, present in foods (fruits, vegetables, herbs, beverages) and dietary supplements have the potential to modulate the activity of xenobiotic-metabolizing enzymes [Hodek et al., 2002]. Among proteins interacting with flavonoids, cytochrome P450s (CYPs), monooxygenases metabolizing xenobiotics (e.g. drugs, carcinogens), play the most prominent role. The two members of CYP1A subfamily, CYP1A1 and CYP1A2, are involved in the activation of procarcinogens, such as polycyclic aromatic hydrocarbons, aromatic amines and heterocyclic amines [Eaton et al., 1995; Rendic and Di Carlo, 1997]. Higher CYP1A1 expression and activity seem to be associated with the risk of lung and colorectal cancer. Moreover, CYP1A2 is responsible for metabolizing many frequently used drugs, such as phenacetin, caffeine, imipramine, and it also activates procarcinogens. The enzymes of the CYP1A subfamily can be induced by aromatic hydrocarbons. The activation involves a specific receptor called the Ah receptor. After the binding of an inducing agent to the receptor, a heterodimer with the activated Ah-receptor nuclear transporter is formed, which then binds to a xenobiotic response element and functions as a transcriptional enhancer to stimulate the gene transcription [Ortiz de Montellano, 2005]. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and heterocyclic amines (HCAs) are groups of potential carcinogens activated by CYP1A subfamily. 1 Introduction PAHs are formed during the incomplete combustion or pyrolysis of organic matter and during various industrial processes. Humans are exposed to PAHs by various means; the primary routes of exposure are the inhalation of polluted air, wood smoke, and tobacco smoke, as well as the ingestion of contaminated water and foods normally containing microgram quantities of PAHs. Dietary exposure to heterocyclic amines is considered to be a potential human cancer risk. These compounds are produced during the cooking of red meat, poultry, and fish under normal household conditions [Sinha et al., 2000]. They are formed in relatively high concentrations by the condensation of creatinine with amino acids. The role of 2-amino-1-methyl-6- phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP) and other HCAs in human cancer causation is of interest, in particular for cancers of colon and breast [Snyderwine, 1994; Nagao et al., 1994]. However, the molecular principle of the carcinogen activation in organisms has not been entirely elucidated yet, mainly in the context of interactions of carcinogens or other xenobiotics in organisms. 2 Aims Aims The aim of our study is to expand the current knowledge of chemopreventive compounds and their role in the process of carcinogenesis. The rising consumption of dietary supplements containing these compounds (e.g. flavonoids) evokes concerns regarding their unlimited consumption, as their side effects are not sufficiently known. Our research is directed at their effects not as inhibitors of the carcinogen activating enzymes, but as inducers, whose effects, for example the induction persistance, due to repetitive or single dose p.o. administration or sequential exposure of the organism to chemopreventive compounds and carcinogens, are being omitted. In order to address these effects of chemopreventive compounds on cytochrome P450s, several specific objectives had to be accomplished. • To establish and optimize the immunodetection of CYP1A in microsomal samples (liver, small intestine) using a chicken anti-rat CYP1A1 and CYP1A2, as well as the assay of CYP1A1 and CYP1A2 specific activities with marker substrates. • To screen various groups of chemopreventive compounds for their ability to induce CYP1A1 and CYP1A2 in rat liver and small intestine, the two main organs responsible for xenobiotic metabolism and carcinogen activation, after p.o. administration of chemopreventive compounds. • To examine the relevant effects on the expression of CYPs and their specific activities in different time and dose regimens of the chemopreventive compound treatment. • To carry out a sequential study, which comprises the administration of an inducing or non-inducing carcinogen, preceded by the administration of a chemopreventive compound, and to determine the DNA-adducts formation using 32P-postlabelling. 3 Results and discussion Results and discussion To investigate the induction effects of chemopreventive compounds on CYP1A properly, the research was conducted in several stages. At first, a wide variety of chemopreventive compounds was tested, namely curcumins, stilbenes, organosulphur compounds, and flavonoids. The levels of protein expression and activity of CYP1A1 and CYP1A2 was determined to evaluate the ability of chemopreventive compounds, p.o. administered to rats, to induce CYP1A in rat small intestine and liver. These two organs are the main sites of xenobiotic metabolism. The induction effects on CYP1A1 and CYP1A2 were examined in different time and dose regimens by optimized Western blotting analysis with primary chicken antibodies, treated to eliminate their binding to keratin contamination, and specific activity measurements using 7-ethoxyresorufin and 7-methoxyresorufin as specific substrates for CYP1A1 and CYP1A2, respectively. A well-known inducer of CYP1A subfamily, β-naphthoflavone (BNF), was used as a reference compound in the whole study. In both tissues, liver and small intestine, β-naphthoflavone proved its strong inducing capacity. Thus, β-naphthoflavone served as a positive control throughout the study. Regimen I The induction effects of a wide variety of chemopreventive compounds on CYP1A1 and CYP1A2 after 5 day treatment were examined. As shown in Figure 1, in both tissues, the most efficient non-flavonoid inducer of CYP1A1 was diallyl sulphide, which also induced CYP1A2 in liver (Fig. 1B). Generally, in small intestine, the most effective flavonoid inducers of EROD and MROD activities and the CYP protein level were aglycones (β-naphthoflavone, flavone, flavanone, morin). 4 Results and discussion A) B) Figure 1 Effects of non-flavonoid treatment in small intestine (A) and liver (B). EROD and MROD activities of CYP1A1 and CYP1A2, respectively, were determined in rat microsomes from liver and the proximal part of small intestine after exposure to non-flavonoid chemopreventive compounds (60 mg/kg body weight) for 5 days. Immunodetection of CYP1A1/2 in liver and the proximal part of rat small intestine. Moreover, small intestine, as an organ highly exposed to xenobiotics, was dissected into two or three parts. As shown in Figure 2, the higher CYP1A1 level and activity in the proximal part of small intestine compared to the distal part was observed after the β-naphthoflavone, morin, and rutin treatment. However, the quercetin and isoquercitrin administration caused the highest increase in the middle part of small intestine (data not shown). 5 Results and discussion Figure 2 Effects of chemopreventive compound treatment along small intestine. EROD activity of CYP1A1 was determined in the proximal (P) and distal (D) part of rat small intestine after exposure to chemopreventive compounds (60 mg/kg body weight) for 5 days. Immunodetection of CYP1A1 in the proximal and distal part of rat small intestine. Regimen II A further point of view included a single dose administration to determine the induction capability of chemopreventive compounds in a low dose. The persistence of the elevated CYP levels was also investigated. Therefore, the relevant effects on CYP expression and both specific activities were evaluated 24, 48 and 72h after the treatment, in small intestine and liver of rats p.o. administered with the selected compounds (Fig. 3 and Fig. 4). Figure 3 Effects of flavonoid treatment in small intestine in different times after the treatment. EROD activity of CYP1A1 was determined in the proximal (P), middle (M) and distal (D) part of rat small intestine after a single dose treatment with flavonoids (60 mg/kg body weight) 24, 48 and 72 hours after the treatment. Immunodetection of CYP1A1 in the proximal, middle and distal part of rat small intestine. 6 Results and discussion Figure 4 Effects of flavonoid treatment in liver in different times after the treatment. EROD and MROD activity of CYP1A1 and CYP1A2, respectively, were determined in rat liver after a single dose treatment with flavonoids (60 mg/kg body weight) 24, 48 and 72 hours after the treatment. Immunodetection of CYP1A1/2 in rat liver. The results obtained with intestinal parts suggest the important role of the compound structure and its metabolism in the process of bioavailability to humans. Regimen III In subsequent experiments, the inducer (β-naphthoflavone) and common carcinogens (benzo[a]pyrene or PhIP) were administered in successive steps. Based on the results with β-naphthoflavone in the experiments mentioned above, a delay of 72h was chosen, between individual administrations. The time delay was chosen in such a way so as to prevent any potential inhibition of activating enzymes, evoked by the presence of chemopreventive compounds, while the induction effects would still persist. 7 Results and discussion Figure 5 shows that in small intestine, the administration of β-naphthoflavone increased EROD activity and also the CYP1A1 level in all the intestinal parts at a low dose of PhIP (PhIP1, 50 mg/kg). Contrary to that, the high dose of PhIP (PhIP2, 150 mg/kg) caused a loss of EROD activity in β-naphthoflavone pretreated rats, though the protein levels did not change markedly. Similarly to the administration of both, BNF and PhIP2, the combination of β-naphthoflavone with benzo[a]pyrene did not additively increase the protein level and activity of CYP1A1 compared to the sole compound administration. Figure 5 EROD activity of CYP1A1 in small intestine. Microsomes were isolated from the proximal, middle and distal part of rat small intestine after exposure to β-naphthoflavone and/or carcinogens. Immunodetection of CYP1A1 in the proximal, middle and distal part of rat small intestine. 8 Results and discussion In liver (Fig. 6), the combination of β-naphthoflavone and benzo[a]pyrene administration led to a strong increase of EROD and MROD activity compared to separately administered compounds, namely for CYP1A2. This indicates potential synergistic effects of these two compounds. However, no marked effect of the β-naphthoflavone treatment in combination with PhIP was observed, as was the case in small intestine. Figure 6 EROD and MROD activity of CYP1A1 and CYP1A2, respectively, in liver. Microsomes were isolated from rat liver after exposure to β-naphthoflavone and/or carcinogens. Immunodetection of CYP1A1 and CYP1A2 in liver microsomes. Carcinogen-DNA adduct formation is generally believed to represent an important genotoxic step in the initiation of carcinogenesis. Therefore, the level of carcinogen-DNA adducts is another marker for risk assessment of cancer development. Carcinogens, benzo[a]pyrene and PhIP, undergo enzymatic biotransformation in vivo leading to both activation and/or detoxification of 9 Results and discussion the carcinogen. The level of BaP-DNA adducts was evaluated by 32P-postlabelling in the proximal and distal parts of small intestine (Tab. 1). The β-naphthoflavone pretreatment markedly increased the amount of BaP-DNA adduct 1 (adduct derived from 9-hydroxy-BaP) in the proximal part of small intestine. The higher CYP expression in the proximal part of small intestine than in the distal part is in accordance with our findings that the total content of BaP-DNA adducts in the proximal part is nearly twice as high as in the distal part. Table 1 Benzo[a]pyrene-DNA adduct levels in small intestine. RAL/108 nucleotides DNA sample Spot 1 Spot 2 Spot 3 Total Parts of small intestine BaP proximal 3.85 2.82 4.39 11.06 βNF+BaP proximal 5.15 2.97 3.96 12.08 BaP distal 4.40 1.56 1.64 7.60 βNF+BaP distal 4.02 1.85 2.46 8.33 β-Naphthoflavone and/or benzo[a]pyrene were administered to rats and DNA adducts were determined in the proximal and distal part of small intestine. RAL, “relative adduct labelling” Spot 1 – adduct derived from 9-hydroxy-BaP Spot 2 - the major dGp adduct (dG-N2-BPDE) Spot 3 – unknown adduct 32P-postlabelling The results obtained by correlate well with the immunodetection and determined specific activities, where the BNF pretreatment did not increase these measurements markedly in comparison to the sole BaP administration. Benzo[a]pyrene is known to be strong inducer of CYP1A subfamily, and thus it is possible that the maximal level of induction has already been exceeded. 10 Results and discussion PhIP-DNA adducts will be determined shortly by recently developed online column-switching liquid chromatography tandem mass spectrometry technique [Singh et al., 2010]. This work was supported by the Czech Science Foundation (Grant No. 305/09/H008), the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (Grant No. MSM 0021620808) and the Grant Agency of Charles University (Grant No. 4909). 11 References References Eaton D. L., Gallagher E. P., Bammler T. K., Kunze K. L. (1995): Role of cytochrome P4501A2 in chemical carcinogenesis: implications for human variability in expression and enzyme activity, Pharmacogenetics, 5, 259-274. Hodek P., Trefil P., Stiborová M. (2002): Flavonoids-potent and versatile biologically active compounds interacting with cytochromes P450, Chem Biol Interact, 139, 1-21. Nagao M., Ushijima T., Wakabayashi K., Ochiai M., Kushida H., Sugimura T., Hasegawa R., Shirai T., Ito N. (1994): Dietary carcinogens and mammary carcinogenesis. Induction of rat mammary carcinomas by administration of heterocyclic amines in cooked foods, Cancer, 74, 1063-1069. Ortiz de Montellano P. R. (ed.) (2005): Cytochrome P-450: Structure, Mechanism and Biochemistry. Third edition, Plenum Publishers, New York Rendic S., Di Carlo F. J. (1997): Human cytochrome P450 enzymes: a status report summarizing their reactions, substrates, inducers, and inhibitors, Drug Metab Rev, 29, 413-580. Singh R., Arlt V. M., Henderson C. J., Phillips D. H., Farmer P. B., Gamboa da Costa G. (2010): Detection and quantitation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2- amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine adducts in DNA using online column-switching liquid chromatography tandem mass spectrometry, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 878, 2155-2162. Sinha R., Gustafson D. R., Kulldorff M., Wen W. Q., Cerhan J. R., Zheng W. (2000): 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine, a carcinogen in high-temperature-cooked meat, and breast cancer risk, J Natl Cancer Inst, 92, 1352-1354. 12 References Snyderwine E. G. (1994): Some perspectives on the nutritional aspects of breast cancer research. Food-derived heterocyclic amines as etiologic agents in human mammary cancer, Cancer, 74, 1070-1077. 13 List of publications List of publications Petr Hodek, Pavel Hanuštiak, Jitka Křížková, Radka Mikelová, Soňa Křížková, Marie Stiborová, Libuše Trnková, Aleš Horna, Miroslava Beklová, René Kizek (2006): Toxicological aspects of flavonoid interaction with biomacromolecules, Neuroendocrinol Lett, 27, 14-17. IF = 0.924 Jitka Křížková, Kamila Burdová, Petr Hodek, René Kizek, Marie Stiborová (2007): Effects of a flavonoid structure on cytochromes P450 induction, Chem Listy, 101, 206-208. IF = 0.683 Jitka Křížková, Kamila Burdová, Jiří Hudeček, Marie Stiborová, Petr Hodek (2008): Induction of cytochromes P450 in small intestine by chemopreventive compounds, Neuroendocrinol Lett, 29, 717-721. IF = 1.359 Petr Hodek, Jitka Křížková, Kamila Burdová, Miroslav Šulc, René Kizek, Jiří Hudeček, Marie Stiborová (2009): Chemopreventive compounds—View from the other side, Chem Biol Interact, 180, 1-9. IF = 2.457 Petr Hodek, Martina Teplá, Jitka Křížková, Marie Stiborová (2009): Modulation of cytochrome P450 enzyme system by selected flavonoids, Neuroendocrinol Lett, 30, 67-71. IF = 1.047 Jitka Křížková, Kamila Burdová, Marie Stiborová, Vladimír Křen, Petr Hodek (2009): The effects of selected flavonoids on cytochromes P450 in rat liver and small intestine, Interdisc Toxicol, 2, 201-204. No impact factor yet Manuscript in preparation Jitka Křížková, Petr Hodek, Miroslav Šulc: Chicken antibodies in Western blots: How to avoid potential keratin cross-reactivity 14
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Jitka Koblihová 3.03 MB
Stáhnout Příloha k práci RNDr. Jitka Koblihová 4.5 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Jitka Koblihová 1.29 MB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Jitka Koblihová 1.27 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Otto Helia, CSc. 119 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Radka Václavíková, Ph.D. 96 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 640 kB