velikost textu

Mechanismy aktivace muskarinového M1 receptoru atypickými agonisty

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Mechanismy aktivace muskarinového M1 receptoru atypickými agonisty
Název v angličtině:
Activation mechanisms of muscarinic M1 receptor by atypical agonists
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Alena Randáková, Ph.D.
Školitel:
MUDr. Vladimír Doležal, DrSc.
Oponenti:
doc. MUDr. Jaromír Mysliveček, Ph.D.
RNDr. Jan Krůšek, CSc.
Id práce:
83572
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyziologie (31-152)
Program studia:
Fyziologie živočichů (P1521)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
29. 2. 2016
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
ABSTRAKT Atypičtí agonisté muskarinových receptorů jsou látky, které se vážou se srovnatelnou afinitou k jednotlivým podtypům receptoru, ale jsou schopny je do určité míry selektivně aktivovat. Molekulární mechanismus této funkční selektivity atypických agonistů není dosud znám a jeho objasnění by mohlo přispět k cílenému vývoji nových funkčně selektivních agonistů vhodných pro léčebné využití. Funkční selektivita atypických agonistů muskarinových receptorů by mohla souviset se způsobem, jakým tyto látky aktivují receptor. Specifická konformační změna receptoru vyvolaná po navázání těchto strukturně složitých agonistů by mohla vést k využití aktivačních mechanismů, které jsou paralelní s aktivačním mechanismem klasických ortosterických agonistů a vést k selektivní aktivaci receptoru. Zjišťovali jsme, zda atypičtí muskarinoví M1 selektivní agonisté xanomelin a N-desmetylklozapin využívají při aktivaci M1 receptoru stejnou kaskádu tzv. aktivačních přepínačů jako klasičtí ortosteričtí neselektivní agonisté karbachol a oxotremorin. Za tímto účelem jsme provedli bodové mutace M1 receptoru v oblasti odpovědné za vazbu ortosterického ligandu (D1053.32, D993.26), v oblasti aktivačního přepínače odpovědného za přenos konformační změny z ortosterického místa do intracelulární části receptoru D712.50 a v oblasti přepínače "ionic lock switch" odpovídající za interakci s G-proteiny (R1233.50, D1223.49). Pomocí funkčních stanovení (akumulace inositolfosfátů a měření změn hladiny intracelulárních vápenatých iontů) jsme sledovali, jak tyto mutace ovlivní přenos signálu na M1 receptoru prostřednictvím atypických agonistů xanomelinu a N-desmetylklozapinu ve srovnání s klasickými agonisty karbacholem a oxotremorinem. Prostřednictvím vazebných pokusů jsme stanovovali vliv jednotlivých mutací na afinitu těchto agonistů. Dále jsme se zaměřili na vliv jednotlivých mutací na afinitu neodmyvatelné vazby xanomelinu a perzistentní aktivaci receptoru xanomelinem. Mutace aminokyselin D1053.32 i D993.26 snížily afinitu všech testovaných agonistů, což se promítlo i ve funkčních stanoveních jako snížení potence aktivovat receptor. Mutace D1053.32 v ortosterickém místě měla výraznější vliv na potenci xanomelinu aktivovat M1 receptor než tomu bylo pro klasické ortosterické agonisty karbachol a oxotremorin. Mutace v oblasti aktivačního přepínače D712.50 a interakce s G-proteiny R1233.50 vedly k úplné ztrátě funkční odpovědi jak klasických tak atypických agonistů. Naše výsledky ukazují, že klasičtí i atypičtí agonisté aktivují M1 receptor stejným mechanismem využívajícím aktivační přepínač D712.50 a přepínač "ionic lock switch". Dále poukazují na klíčovou roli D1053.32 v ortosterickém vazebném místě pro aktivaci M1 receptoru atypickými agonisty i pro perzistentní aktivaci receptoru neodmyvatelně navázaným xanomelinem. Rozdíl mezi jednotlivými agonisty je ve způsobu jakým s D1053.32 interagují. Dále naše výsledky ukazují, že interakce s vestibulem ortosterického vazebného místa je důležitá i pro vazbu atypických agonistů.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Atypical agonists of muscarinic receptors bind to individual receptor subtypes with comparable affinity but activate them selectively to a certain extent. Molecular mechanism underlying this "functional selectivity" is not known and its elucidation may contribute to development of new atypical functionally selective agonists suitable for therapeutic use. Functional selectivity of atypical muscarinic agonists may be caused by a distinct molecular mechanism(s) of how these compounds activate the receptor. Agonist-specific conformations induced by structurally complex atypical agonists may lead to utilization of a parallel activation mechanism that is different than the activation mechanism induced by non-selective classical agonists. In order to examine this possibility we investigated whether the M1 receptor preferring atypical agonists xanomeline and N-desmethylclozapine, and the classical orthosteric agonists carbachol and oxotremorine, activate the M1 receptor through a common cascade of transmission switches. To this end we mutated key amino acids of the M1 receptor that are essential for ligand binding to the orthosteric binding site (D1053.32, D993.26), receptor activation (transmission switch, D712.50), or interaction with G-protein (ionic lock switch, R1233.50 D1223.49). We compared effects of these mutations on binding characteristics and functional responses of atypical and classical agonists. Furthermore we analyzed effects of these mutations on persistent activation of the M1 receptor by wash-resistantly bound xanomeline. Point mutation of D1053.32 and D993.26 decreased affinity of all tested agonists and caused a decrease in potency of receptor activation in functional assays. Mutation of D1053.32 in the orthosteric binding site decreased the potency of the atypical agonist xanomeline more than the potency of the classical orthosteric agonists carbachol and oxotremorine. Point mutation of residue D712.50, involved in receptor activation, or R1233.50, involved in coupling to G-proteins, completely abolished functional responses to both classical and atypical agonists. Our data show that classical as well as atypical agonists activate the M1 receptor by the same molecular mechanism that involves the transmission switch D712.50 and the ionic lock switch (R1233.50, D1223.49). These results further point to the key role of D1053.32 in the orthosteric binding site in receptor activation by atypical agonists and persistent activation of the M1 receptor by wash- resistantly bound xanomeline. The principal difference among tested agonists is in the way they interact with D1053.32. In addition, our data demonstrate an important role of the vestibule of the orthosteric binding site for atypical agonists binding.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Alena Randáková, Ph.D. 2.98 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Alena Randáková, Ph.D. 7.6 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Alena Randáková, Ph.D. 47 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Alena Randáková, Ph.D. 45 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Jaromír Mysliveček, Ph.D. 123 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jan Krůšek, CSc. 134 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 501 kB