velikost textu

Expresní profilování jednotlivých buněk a jejich analýza

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Expresní profilování jednotlivých buněk a jejich analýza
Název v angličtině:
Single cells gene expression profiling and analysis
Typ:
Disertační práce
Autor:
Ing. Vendula Novosadová, Ph.D.
Školitel:
prof. Mikael Kubista, Ph.D.
Oponenti:
RNDr. Vladimír Beneš, CSc.
Mgr. Václav Vopálenský, Ph.D.
Id práce:
83562
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
16. 1. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
qPCR, genové expresní profilování jednotlivých buně, vizualizace dat, astrocyty
Klíčová slova v angličtině:
qPCR, single cell gene expression profiling, data visualization, astrocytes
Abstrakt:
Souhrn Buňky jsou základním stavebním kamenem všech vyšších organismů. Pro pochopení komplexity tkání a celých orgánů je nutné porozumět buněčné heterogenitě a chování jednotlivých buněk. I buňky stejného typu mají v daném okamžiku odlišné chování a různé složení mRNA, které je způsobeno stochastickou expresí genů a proteinů. Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (qPCR) je jednou z nejcitlivějších metod pro detekci mRNA, přesto se však při analýze jednotlivých buněk získává velké množství chybějících dat. Tento fakt je dán nepřítomností transkriptu nebo jeho malým množstvím, které je pod mezí detekce. Z tohoto důvodu je nutné vytvořit nové postupy pro statistickou analýzu. V této práci je diskutován potenciál genového expresního profilování jednotlivých buněk (single cells) pomocí vysokokapacitního přístroje Biomark se zaměřením na analýzu dat a jejich biologickou interpretaci. Ukazuje se, že mezi dva klíčové kroky v analýze jednotlivých buněk patří normalizace a doplnění chybějících dat. Jednotlivé buňky nejsou normalizovány referenčním genem, ale jsou normalizovány na počet buněk, ze kterých je exprese měřena. Chybějící údaje jsou nahrazeny hodnotou rovné jedné čtvrtině nejmenšího měřitelného množství transkriptu v buňce. Práce se dále věnuje možnostem vizualizace dat získaných měřením exprese v jednotlivých buňkách, metodám charakterizace těchto buněk a jejich rozdělení do subpopulací. Vypracovaná metodika byla testována na několika biologických systémech. Jako první byl ukázán vývoj drápatky vodní. Dále byla metoda použita pro ohodnocení vlivu karcinogenů na kvalitu myších spermií a následně na vývoj embrya. V této práci byly jako hlavní biologický systém použity kortikální astrocyty. Byly popsány změny genové exprese iontových kanálů a transportérů účastnících se změny objemu astrocytů a jejich aktivace během vývoje, v dospělosti a po poranění. qPCR data ukázala existenci dvou subpopulací astrocytů u dospělého jedince, které se od sebe liší v hladině exprese genů kódujících draselné a chloridové kanály. Pro objasnění heterogenity astrocytů během vývoje a po lokální cerebrální ischemii byla provedena qPCR a statistická analýza jednotlivých buněk z kortikálních GFAP/EGFP pozitivních buněk. Byly nalezeny tři subpopulace buněk, jak ve vývojovém stádiu, tak po poranění. Byla nalezena silná exprese dosud nepopsaných genů Snap25, Hcn1, Hcn2 a Hcn3, Grin2a, Gria2, Gria3, Grm5 a Kcna3, které mohou být použity jako nové markery pro reaktivní astrocyty. Klíčova slova: qPCR, genové expresní profilování jednotlivých buně, vizualizace dat, astrocyty 5
Abstract v angličtině:
Abstract Cells are the basic units of life. Studying complex tissues and whole organs requires an understanding of cell heterogeneity and responses to stimuli at the single-cell level. Even the cells, which belong to the same cell type, behave differently at a specific moment and contain different amount of mRNA. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) is one the most sensitive methods for the detection of mRNA, however, gene expression profiling in single cells leads to a large amount of missing data due to the fact that the transcript is missing, or is below the level of detection. Therefore, it is necessary to establish a new statistical approach for analysis of single cells. In this thesis the potential of single-cell gene expression profiling using the high throughput instrument Biomark, focusing on data analysis and biological interpretation, is discussed. Data normalization and handling of missing data are two important steps in data analysis that are performed differently at the single-cell level. Single cells are not normalized by reference genes but the number of cells as a normalizer is applied. Missing data are replaced by value, which is equaled one quarter of transcript amount in the cell. Furthermore it is shown how single-cell gene expression data can be viewed and how subpopulations of cells can be identified and characterized. The methodology has been tested on several biological systems. Firstly the development of Xenopus laevis was showed. Furthermore, high throughput qPCR was used for carcinogen effect determination on quality of mouse sperm and afterwards on embryo development. Cortical astrocytes were used as the main biological systems. The changes in gene expression of ion channels and transporters participating in astrocyte swelling, volume regulation and activation of astrocytes in development, adultness and after injury were described. The qPCR data revealed the existence of two astrocytic subpopulations in adult animals markedly differing in their gene expression levels for K+ channels, and Cl- channels. To unravel astrocyte heterogeneity during postnatal development and after focal cerebral ischemia, single cell gene expression profiling in acutely isolated cortical GFAP/EGFP-positive cells from mouse brain was employed. Analyses revealed three subpopulations of astrocytes present within postnatal development and after focal cerebral ischemia. It found a high expression of these genes Snap25, Hcn1, Hcn2 and Hcn3, Grin2a, Gria2, Gria3, Grm5 and Kcna3, which have never been described before and they are possible new markers of astrogliosis. Key words: qPCR, single cell gene expression profiling, data visualization, astrocytes
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Ing. Vendula Novosadová, Ph.D. 28.89 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Ing. Vendula Novosadová, Ph.D. 30 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Ing. Vendula Novosadová, Ph.D. 253 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Vladimír Beneš, CSc. 72 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Václav Vopálenský, Ph.D. 104 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 715 kB