velikost textu

Studies of NK cell receptors and other proteins using recombinant expression and mass spectrometry

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studies of NK cell receptors and other proteins using recombinant expression and mass spectrometry
Název v češtině:
Studium NK receptorů a jiných proteinů metodami rekombinantní exprese a hmotnostní spektrometrie
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Daniel Kavan, Ph.D.
Školitel:
prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Ludmila Tučková, DrSc.
RNDr. Pavel Řehulka, Ph.D.
Id práce:
83378
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
18. 6. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
NK receptory, rekombinantní proteiny, rekombinantní exprese, hmotnostní spektrometrie
Abstrakt:
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Studium receptorů NK buněk a jiných proteinů pomocí rekombinantní exprese a hmotnostní spektrometrie Autoreferát dizertační práce Daniel Kavan Školitel: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. Praha 2010 Daniel Kavan Úvod Úvod NK buňky a jeden z jejich receptorů CD69 Přirození zabiječi (NK buňky) jsou subpopulací velkých granulárních lymfocytů, kterým na buněčném povrchu schází receptory charakteristické pro B a T bu ňky. Jsou nicméně charakterizovány přítomností NKp46 a NKp30 [Moretta L. et. al. 2002]. Pojmenování buněk přirození zabiječi vzniklo podle funkce v organismu, protože nepotřebují žádnou předchozí aktivaci a přesto jsou schopny eliminovat nenormální (tedy infikované nebo transformované) buňky z tkáně [Kiessling R. et. al. 1975]. Tato funkčnost je založena na kontrole MHC molekul I. T řídy okolních buněk. Výsledná akce (zničení nebo nezničení cílové buňky) je výsledkem rovnováhy aktivačních a inhibičních signálů zprostředkovanými povrchovými receptory a převedenými na konkrétní signální dráhy [Raulet D. H. et. al. 2001]. Specifita NK buněk není závislá na jediném druhu receptoru, jako je tomu u B a T buněk, ale je dána různorodostí jejich povrchových receptorů [Lanier L. L. 2005]. Tyto receptory pak mohou být inhibiční, nebo aktivační. Lektiny C-typu byly poprvé popsány v roce 1988 [Drickamer K. (1988)] a jejich charakteristickým rysem je -1- Úvod Daniel Kavan přítomnost vysoce konzervované sacharid vázající domény (CRD), která je stabilizována dvěma nebo třemi disulfidovými můstky. Rozdílná vazebná specifita je dána účastí variabilních smyček na tvorbě vazebného místa. Tuto strukturní rodinu můžeme rozdělit do několika podskupin, z nichž jsou na povrchu NK buněk nejhojn ěji exprimované lektiny C-typu II. třídy. Tyto proteiny obsahují na extracelulárním C-konci jednu CRD doménu. Tato terciární sruktura byla poprvé rozřešena u molekuly CD94 [Boyington J. C. et. al. 1999]. CRD doména je obvykle glykosylovaná a receptory se vyskytují ve formě homodimerů (výjimkou je heterodimer CD94-NKG2 [Lazetic S. et. al. 1996]). Pokud máme zmínit některézástupce, pak je třeba jmenovat CD69, NKR-P1, NKG2 a Ly49. CD69 je považován za marker aktivovaných lymfocytů. Ačkoli se nejprve z pokusů in vitro předpokládalo, že se podílí na procesu eliminace nádorových buněk, pozdější výzkum na myších prokázal jeho úlohu při tlumení imunitní reakce [Sancho D. et. al. 2005], kdy byly CD69- myši odolnější vůči nádorům, pravděpodobně vzhledem ke zvýšené apoptóze CD69+ NK buněk po kontaktu s nádorem [Esplugues E. et. al. 2003]. Zpracování MS dat Vodíko-deuteriová výměna je chemický děj, při kterém je kovalentně vázaný atom vodíku vyměněn za deuterium, -2- Daniel Kavan Úvod nebo naopak. Zkoumané protony jsou většinou amidické vodíky peptidové vazby. Tato metoda poskytuje údaje o přístupnosti různých částí molekuly a tedy o terciární struktuře proteinu [Zhang Z., Smith D. L. (1993)]. Vyhodnocování pokusů s H/D výměnou pomocí NMR má jedinečné rozlišení, protože můžeme rozlišit každou jednotlivou aminokyselinu (kromě prolinů). Bohužel jsou zde však poměrně vysoké nároky na vzorek a navíc již musíme mít přiřazené píky jednotlivým aminokyselinám, což je samo o sobě dosti složité, navíc některé proteiny vůbec nemusí poskytovat spektra dostatečné kvality. Naopak rozlišení MS u H/D výměny je závislé na efektivitě proteolýzy a pohybuje se v rozmezí 5-10 aminokyselin. Nicméně požadované množství vzorku se pohybuje v mikrogramech a navíc můžeme vyhodnocovat i výsledky z velmi flexibilních forem proteinů. Nejsilnějším rysem H/D výměny ale nejsou úrovně deuterace jako takové, ale spíš jejich vzájemné porovnání (úroveň deuterace proteinu s úrovní deuterace komplexu protein-ligand může napovědět polohu vazebného místa, protože ligand může částečně stínit část proteinu a tím zpomalit deuteraci). -3- Cíle práce Daniel Kavan Cíle práce Předkládaná práce měla dva hlavní cíle. Prvním byla příprava a charakterizace několika forem receptoru CD69 a druhým poskytování bioinformatického zázemí při zpracovávání hmotnostně spektrometrických dat. Pro jejich splnění byly stanoveny tyto konkrétní podcíle: • Najít renaturační protokol, který by zajistil dostatečné množství CD69 pro strukturní studie prováděné pomocí NMR • Provést NMR titrační experimenty a sledovat pomocí NMR strukturní změny, ket kterým dochází v průběhu a po vazbě N-acetyl glukosaminu • Příprava mutantů CD69 • Vývoj makra pro program DataAnalysis pro zpracovávání MS dat z pokusů vodíko-deuteriové výměny • Vývoj softwarových nástrojů pro obrazové znázornění výsledků získaných z vodíko-deuteriové výměny • Zvládnutí dalších bioinformatických úloh týkajících se zpracování MS dat Těchto cílů bylo dosaženo za použití vhodných metodik počínaje molekulárním klonováním, přes biochemické techniky až po pokročilé analytické metody, jakou je např. NMR spektroskopie. -4- Daniel Kavan Výsledky a diskuse Výsledky a diskuse Příprava rozpustných forem molekuly CD69 Přesný postup přípravy stabilních nekovalentních dimerů CD69 je popsán v literatuře (Vaněk et. al. 2008). Podrobným zkoumáním trojrozměrné struktury získané z krystalu (uloženého v RCSB Protein Databank pod přístupovým kódem 3CCK) jsme odhadli, že se na veazebné interakci obou podjedotek dimeru podílí Q93 jedné a D88 spolu s E87 na druhé podjednotce. Ještě výraznější kontakt byl nalezen u R134 jedné a A136 a Y135 druhé (viz obrázek 1). Obr. 1: Model dimeru CD69 [Vaněk O. et. al. 2008]. Těsná interakce Q93 (zeleně) s D88 a E87 (červeně) a R134 (světle modře) s A136 a Y135 (růžově). V82 a S83 na N-konci modře. Disulfidové můstky žlutě. -5- Výsledky a diskuse Daniel Kavan Na základě tohoto byly pak Q93, R134 nebo oba mutovány na alaniny, mutantni molekuly produkovány a analyzovány gelovou filtrací, která ukázala, že jako monomer se chovala jen dvojnáseobně zmutovaná forma, zatímco obě zbývající se jako monomer chovaly jen z části. Zkoumání vazby vápníku a sacharidů různými formami stabilních molekul CD69 Úvodní pokusy s vazbou ligandů byly provedeny, aby se potvrdila schopnost konstruktů CD69 vázat vápník a monosacharidy. V případě vazby vápníku jsme nepozorovali žádné významné rozdíly mezi jednotlivými CD69 formami dimerními (ať kovalentně nebo nekovalentně vázanými) či monomerní formou začínající serinem 100. Každá z těchto molekul vázala 1 mol vápenatých iontů na 1 mol podjednoteks Kd přibližně 58µM. Naopak v případě vazby hexosaminů byly pozorovány výrazné rozdíly, kdy byly hodnoty IC50 pro vazbu N-acetylglukosaminu a N-acetylgalaktosaminu přibližně 10-5 M v případě monomerní formy, ale o řád nižší v případě konstruktu začínajícího valinem 82. Pro nejdelší formy začínajícími glycinem 70 a kovalentně vázaný dimer začínající glutaminem 65 byla tato hodnota nižší dokonce o dva řády (viz obrázek 2). Pro následné vazebné studie byla z důvodu snadné a efektivní renaturace in vitro zvolena molekula začínající glycinem 70. -6- Daniel Kavan Výsledky a diskuse Fig. 2: . Inhibice vazby rozpustných forem CD69 na mikrotitrační destičku potaženou vysokoafinitním ligandem (GlcNAc17BSA) pomocí neoglykoproteinu a monosacharid ů. Zkoumanými proteiny byl monomerní CD69 (A), valine 82 (B), glycine 70 (C) a kovalentní dimer (D). Vazba N-acetyl-β-D-hexosaminů nezpůsobuje žádné výrazné konformační změny molekuly CD69 Pro zjištění strukturních změn rozpustných CD69 po navázání ligandu jsem sledovali změny hydrodynamických vlastností receptoru. Velikost molekuly proteinu po vysycení N-acetylglukosaminem byla sledována a porovnána s velikostí molekuly předem inkubované s N-acetyl ­ manosaminem, jako negativní kontrolou, pomocí gelové -7- Výsledky a diskuse Daniel Kavan filtrace na koloně Suprdex 200 HR a pomocí analytické ultracentrifugace. Ačkoli byl pozorován kratší retenční čas při gelové filtraci, který by mohl znamenat změnu velikosti molekuly, hodnota experimentálně stanoveného sedimentač ­ ního koeficientu byla v obou pokusech totožná. Navíc se nepodařilo najít žádné výrazné změny ani v porovnávaných HSQC NMR spektrech před a po saturaci ligandem. Určení zapojení disulfidových můstků Uspořádání disulfidových můstků v proteinech se v naší laboratoři dříve určovalo porovnáváním jejich redukovaných a neredukovaných tryptických štěpení analyzovaných pomocí LC-MS. Protože je to však velice složitá a nespolehlivá metoda s nejistými výsledky, snažili jsme se pro tento účel vyvinout metodu zcela novou. Prvním problémem v těchto pokusech bývá změna zapojení v průběhu experimentu, které se často děje při vyšších hodnotách pH. Při štěpení kyselými proteasami, jako je pepsin, jsme schopni udržovat v celém průb ěhu kyselé pH, ovšem nízká specifita těchto proteas značně komplikuje vyhodnocování. Z těchto důvodů jsme do procesu štěpení zavedli oxidovanou složku známou z in vitro renaturace. Jako nejlepším činidlem se ukázal cystamin v 200 µM koncentraci. Protože naším dalším požadavkem na novou metodu byla použitelnost i na směsi proteinů, zkusili jsme jako separační techniku zavést SDS elektroforézu -8- Daniel Kavan Výsledky a diskuse s přídavkem cystaminu do vzorkového i běhového pufru. Po klasickém enzymatickém štěpení v gelu jsou výsledné peptidy analyzovány na LC-ESI-MS a jejich hmotnost porovnána teoretickými hmotami štěpení in silico. Vyhodnocování MS dat z vodíko-deuteriové výměny Automatické vyhledávání peptidů v hmotnostních spektrech a určování jejich monoisotopických hmot je založeno na přirozených výskytech jednotlivých isotop ů, průměrném prvkovém složení peptidů a z toho vypočítaného tvaru isotopové obálky, a proto nejsou nástroje pro automatické hledání peptidů obsažené v běžných softwarových aplikacích schopny rozpoznat obálky deformované a posunuté nepřirozeným nadbykem deuteria po H/D výměně. Pro vyhodnocení takových dat je tedy potřeba buď vyvinout zcela novou aplikaci, nebo stávající aplikaci nějakým způsobem rozšířit. Pro vyhodnocování dat z H/D výměny v této práci bylo vytvořeno makro pro aplikaci DataAnalysis (Bruker Daltonics) napsané v jazyce Visual Basic for Application (VBScript). Vyhodnocovací algoritmus je zjednodušeně tento: • Vypočítat přesnou hmotu a počet maximálně teoreticky vyměnitelných amidických vodíků peptidových vazeb • Vyhledat výskyt signálů odpovídajících daným hmotnostem a nábojovým stavům peptidů s vyměněnými vodíky. Aby se minimalizovaly signály s náhodně podobnou hodnotou m/z, bere se v úvahu rozdíl mezi ∆m(1H-2H)=1.0062767 Da a ∆m(12C-13C)=1.0033548 Da -9- Výsledky a diskuse Daniel Kavan • Pokud je nalezen, vyhledt ostatní isotopické vrcholy tohoto peptidu a spočítat jeho průměrnou hmotnost (monoiso ­ topická v tomto případě neexistuje) jako vážený pr ům ěr hmotností všech vrcholů vážený na základě jejich intensity • Opakovat pro každý vstupní peptid od začátku Z výsledků tohoto makra (průměrné hmoty) se následně vypočítají proceta deuterace vztažené buď k plně deuterovanému peptidu (pokud je měřen), nebo k teoreticky vypočítané hodnotě pro plně deuterovaný peptid. Vizualizace výsledků H/D výměny Porovnávání dvou (nebo dokonce více) souborů dat jen ve formě tabulky je velmi nepohodlné a nenázorné, proto jsme vyvinuli souftwarovou soupravu pro znázorňování výsledků H/D výměny doplněnou nástroji usnadňujícími plánování pokusů. Je to sada PHP skriptů pro webový server a je volně přístupná na adresách http://ms.biomed.cas.cz/MSTools/ Fig. 3: Příklad mapy pokrytí. Je možné najednou zobrazit více proteas. Primární struktura je dopněna schematickým znázorněním struktury sekundární. Program také vypočítá pokrytí peptidy v procentech. - 10 - Daniel Kavan Výsledky a diskuse (server v Praze) a zrcadlená na http://www.hxms.com/mstools/ (server v Seattlu). První užitečné zobrazení dat je znázornění pokrytí sekvence nalezenými peptidy (obrázek 3) a přijde na řadu ještě před vlastní H/D výměnou. Na základě této mapy se provádí předvýběr zajímavých peptidů mnohem pohodlněji. Výsledná data se pak dají zobrazit mnoha různými způsoby od velmi kompaktních „heatmap“ (obrázek 4), kde Fig. 4: An example of heatmap. Each strip cluster belongs to one condition/form, each strip in cluster represents one particular time. One of several colour schemes can be chosen. - 11 -
Abstract v angličtině:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Biochemistry Studies of NK cell receptors and other proteins using recombinant expressions and mass spectrometry Summary of Ph. D. Thesis Daniel Kavan Supervisor: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. Prague 2010 Daniel Kavan Introduction Introduction NK cells and CD69 as one of their surface receptors Natural killer cells (NK cells) are the subpopulation of large granular lymfocytes, which lacks the surface receptors typical for B cells or T cells. They are characterized by the presence of NKp46 and NKp30 [Moretta L. et. al. 2002], however. They were named natural killers according to their function in the organism, as they do not need any activation and nevertheless they are able to eliminate abnormal (i. e. infected or transformed) cells from the tissue [Kiessling R. et. al. 1975]. This function is dependent on scanning the major histocompatibility complex (MHC) class I molecules of ambient cells. The resulting action (killing or not killing the target cell) is dependent on the balance of activating and inhibiting signals mediated by the NK cell surface receptors and forwarded to the specific signaling pathway [Raulet D. H. et. al. 2001]. Specificity of NK cells is not based only on one type of antigen receptor as it is in case of T and B cells, but is given by variety of their surface receptors [Lanier L. L. 2005]. These receptors could be distinguished as the activation or inhibitory receptors. C-type lectins were identified in 1988 [Drickamer K. (1988)] and their characteristic feature is the highly -1- Introduction Daniel Kavan conserved carbohydrate recognition domain (CRD) internally stabilized by two or three disulfide bonds. Different binding specificity is provided by the participation of variable loops in binding site formation. We can divide this structural family into several subgroups, from which mainly C-type lectins type II are expressed on the NK cell surface. These proteins contain one CRD on the extracellular C-terminus. This tertiary structure was initially resolved in case of CD94 molecule [Boyington J. C. et. al. 1999]. CRD is usually glycosylated and receptors occure in form of homodimers (except for heterodimer CD94-NKG2 [Lazetic S. et. al. 1996]). To name some members of this group we should mention at least CD69, NKR-P1, NKG2 and Ly49. CD69 is considered as the marker receptor of activated lymphocytes. Although it was suggested to participate in process of eliminating the tumor cells in vitro, later studies in mice indicated its role in silencing the immune reaction [Sancho D. et. al. 2005] and CD69- mice were more resistant to tumors, probably regarding to the increased apoptosis after contact of CD69+ NK cells with the tumor [Esplugues E. et. al. 2003]. MS Data Handling Hydrogen deuterium exchange is a chemical process in which a covalently bonded hydrogen atom is replaced by -2- Daniel Kavan Introduction deuterium or vice versa. The examined protons are usually the backbone amides in a protein. The method provides information about the solvent accessibility of various parts of the molecule, and thus the tertiary structure of the protein [Zhang Z., Smith D. L. (1993)]. Evaluation of H/D exchange experiments by NMR provides unique resolution as every single amino acid (except for proline) can be distinguished. Unfortunately, large amounts of proteins are required and the peaks have to be assigned to amino acids first. This task alone is complicated and some proteins may even not provide spectra of sufficient quality. By contrast the resolution of MS in H/D exchange depends on cleavage efficiency and is usually between five and ten amino acids. Nevertheless the amount of protein necessary for this experiment is in order of micrograms and it is possible to evaluate H/D exchange of flexible structures such as molten globules. The key point of H/D exchange experiments are not the deuteration levels themselves, however. The full potential of this method is in comparison of two or more datasets with each other (for instance comparison of deuteration of protein itself and deuteration of protein with ligand can reveal the position of binding site as the ligand would mask the protein surface and thus slow down the deuteration). -3- Aims of the thesis Daniel Kavan Aims of the thesis This study had two main aims. The first one was to prepare and characterize several forms of CD69 receptor and the other was to provide bioinformatic background for MS data handling. The following specific aims were adopted: • To develop the refolding protocol providing sufficient amount of CD69 for NMR structure studies • To perform NMR titration experiments and examine structural changes during and after GlcNAc binding using NMR • To prepare CD69 mutants • To develop DataAnalysis macro for handling of MS data from H/D exchange experiments • To develop a suite of software tools for visualisation of H/D exchange results • To manage other bioinformatic tasks related to MS data handling In order to achieve this goals, we have adopted the suitable methodology starting with molecular cloning and bacterial recombinant expression, following with biochemical techniques and ending with advanced analytical techniques such as mass spectrometry and NMR spectroscopy. -4- Daniel Kavan Results and Discussion Results and Discussion Preparation of soluble CD69 molecules The preparation of stable non-covalent dimer of human CD69 has been described in Vaněk et. al. 2008. After examining its three-dimensional structure obtained from crystal (deposited in the RCSB Protein Databank under accession code 3CCK), we suggested Q93 on one subunit and D88 with E87 on the other one to participate on the inter-subunit interactions. Even more profound intertwining was observed in case of R134 of one subunit with A136 and Y135 on the other one (see Figure 1). Therefore Q93, R134 Fig. 1: Model of dimeric CD69 [Vanek O. et. al. 2008]. Close interactions of Q93 (green) with D88 and E87 (red) and of R134 (cyan) with A136 and Y135 (pink). V82 and S83 on N-terminus in blue. Disulfide bonds in yellow. -5- Results and Discussion Daniel Kavan or both were mutated into alanines, produced and analyzed using gel filtration that revealed monomeric form just in case of double-mutant. The other two mutants behaved only partially as monomers. Evaluation of Calcium and Carbohydrate Binding Activity of Highly Stable CD69 Proteins Preliminary ligand binding experiments were performed to evaluate the ability of CD69 constructs to bind Fig. 2: . Inhibition of binding of soluble CD69 proteins to microtiter wells coated by the high-affinity ligand, GlcNAc17BSA with neoglycoprotein and monosaccharide ligands. The examined proteins were monomeric CD69 (A), valine 82 (B), glycine 70 (C), and covalent dimer (D). -6- Daniel Kavan Results and Discussion calcium and monosaccharides. With regard to binding of calcium there were no significant differences between dimeric forms of CD69 (both covalent and noncovalent) and the monomeric form starting with serine 100 and each of these proteins bound 1 mol of calcium per 1 mol of protein subunit with Kd of approximately 58µM. On the other hand, significant changes were observed with regard to the binding of HexNAcs. While the IC50 values for binding of GlcNAc and GalNAc was approximately 10-5 M in case of monomeric form, in case of longer construct starting with valine 82 was 10 times lower and even 100 times lower in case of the longest forms as shown on Figure 2 (one starting with glycine 70 and other with glutamine 65). As the preparation of G70 form was easier and more efficient, it was selected for the subsequent binding experiments. Binding of N-acetyl-β-D-hexosamines Did Not Result in Significant Conformational Change in CD69 Proteins To analyze the structural changes of soluble CD69 upon ligand binding, variations in the hydrodynamic properties of the receptor were investigated. The molecular size of the receptor saturated with GlcNAc ligand was studied by gel filtration on Superdex 200 HR and by analytical ultracentrifugation and compared with the receptor preincubated with ManNAc negative control. -7- Results and Discussion Daniel Kavan Although the retention time decrease was observed, which could indicate a change in molecular size, the value of experimentally determined sedimentation coefficient was identical. Moreover neither the comparison of HSQC NMR spectra before and after ligand saturation revealed any significant shifts. Determination of disulfide bonds The disulfide bonds arrangement in proteins used to be determined by comparing reduced and non-reduced tryptic digests analysed using LC-MS techniques in our laboratory. Since it is very complicated and time-consuming method with uncertain results, we tried to develop a novel methodology for this task. The first problem while determining disulfide bonds set-up is the disulfide bonds scrambling that could happen particularly at higher pH. With cleavege using acidic proteases such as pepsin we are able to keep low pH preventing the scrambling, on the other hand due to the weak specificity of such proteases the data evaluation becomes very complex task. Therefore we introduced oxidized compounds known from in vitro refolding protocols into the process of digestion. As the best scrambling- prevention compound showed to be cystamine at a concentration of 200 µM. Since our second demand on the method was the applicability even to the protein mixtures, -8- Daniel Kavan Results and Discussion we tried to separate proteins on SDS gel electrophoresis with addition of cystamine into the sample and running buffers. After in-gel digestion by appropriate specific protease, the resulting peptides are analyzed by LC-ESI-MS and their masses compared with theoretical in silico digest. H/D exchange MS data evaluation As the automatic searching for peptides and determination of its exact monoisotopic mass from mass spectra is based on natural abundance of particular isotopes and/or virtual average amino acid averagine and subsequent calculated shape of isotopic envelope, embedded automatic peptide searching tools in common MS data processing software applications are not able to assign the envelope deformed and shifted by unnatural addition of deuteriums to be a peptide. Therefore it is necessary to develop either some independent tool or some kind of plug-in for the application to accomplish this task. In order to evaluate MS data from H/D experiments mentioned in this thesis the macro for Data Analysis application (Bruker Daltonics) written in Visual Basic for Application (VBScript) was created. The algorithm of this macro is as follows: • Compute the exact mass and number of maximum exchangable backbone hydrogens • Search for peaks at masses corresponding to mass of peptide with exchanged hydrogens and given charge considering the difference of ∆m(1H-2H)=1.0062767 Da -9- Results and Discussion Daniel Kavan and ∆m(12C-13C)=1.0033548 Da for eliminating random peptides of similar mass • If found, find other isotopic peaks belonging to this peptide and calculate peptide's average mass (as monoisotopic mass does not exist in deuterated peptide) as weighted mean of masses with value contribution according to peak intensity • Repeat for every given peptide from the beginning The percentage deuterations are calculated from results of this macro (average masses of found peptides) related either to fully deuterated peptide mass (if measured) or to theoretically calculated value of maximal deuteration. H/D exchange results visualization Since comparing of two (or even more) datasets just in form of tables is inconvenient and non-descriptive, we have developed a software suite for H/D exchange data visualization accompanied with tools for facilitating the Fig. 3: An example of peptide coverage map. More than one protease can be displayed at a time. Primary structure is supplemented with schematic indication of secondary structure. Software also computes the coverage percentage. - 10 - Daniel Kavan Results and Discussion experiment planning. It is web server based set of PHP scripts and is freely available via Internet on http://ms.biomed.cas.cz/MSTools/ (server in Prague) and mirrored on http://www.hxms.com/mstools/ (server in Seattle). The first useful visualization even before any H/D experiment is planned is the peptide coverage map (see Figure 3). Based on this map we can pre-choose the peptides for following experiment more conveniently. Fig. 4: An example of heatmap. Each strip cluster belongs to one condition/form, each strip in cluster represents one particular time. One of several colour schemes can be chosen. - 11 - Results and Discussion Daniel Kavan The resulting data are representable in variety of formats from very compact heatmaps, where all data are in single image (see Figure 4), over protection plots where just conditions/isoforms or deuteration periods are grouped (Figure 5) to H/D exchange plots with one image per analyzed peptide. One of the visualization possibilities is colouring of structure model in Jmol structure viewer with optional animation. Fig. 5: An example of protection plot. In one image either times (this example) or conditions/forms can be grouped. Another possibility is to generate one image per every time-condition combination. The amino acids 13-28 and 107-139 are well protected and probably create the core of the protein while amino acids 58-66 are well accessible. - 12 -
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Daniel Kavan, Ph.D. 23.54 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Daniel Kavan, Ph.D. 333 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Daniel Kavan, Ph.D. 330 kB
Stáhnout Posudek vedoucího prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. 129 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Ludmila Tučková, DrSc. 123 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Pavel Řehulka, Ph.D. 105 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 647 kB