velikost textu

α-N-Acetylgalactosaminidase as a tools in the synthesis of complex oligosaccharide immune stimulators

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
α-N-Acetylgalactosaminidase as a tools in the synthesis of complex oligosaccharide immune stimulators
Název v češtině:
Použití α-N-Acetylgalactosaminidasy jako nástroje vhodného pro syntézu komplexních oligosacharidových stimulátorů imunitního systému
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Hynek Mrázek, Ph.D.
Školitel:
prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc.
Oponenti:
prof. Ing. Tomáš Macek, CSc.
doc. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.
Id práce:
83376
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
14. 9. 2011
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Univerzita Karlova Přírodovědecká Fakulta Katedra Biochemie Použití α-N-acetylgalaktosaminidasy jako nástroje vhodného pro syntézu komplexních oligosacharidových stimulátorů imunitního systému Autoreferát dizertační práce Mgr. Hynek Mrázek Školitel: Prof. RNDr. Karel Bezouška, Dsc. Praha 2011 1 Úvod Glykoproteiny jsou proteiny obsahující kovalentně vázané sacharidové struktury. Sacharidy můžou být připojeny k proteinovému řetězci dvojím způsobem: O-glykosidickou nebo N-glykosidickou vazbou. N-glykosidicky spojené sacharidy jsou vázany k aminokyselině asparaginu, zatím co O-glykosidicky vázané sacharidy jsou spojeny k aminokyselinám serinu nebo threoninu. V glykoproteinech vyšších obratlovců se převážně vyskytují N-glykosidicky vázané sacharidové struktury. V případě N-glykosylace je sacharidový řetězec přenesen na aminokyselinu asparagin, který se nachází v aminokyselinové sekvenci N-X-ST, kde X může být jakákoliv aminokyselina kromě prolinu. Zatímco syntéza N-glykoproteinů se řídí určitými pravidly, u syntézy O-glykoproteinů nebyla žádná taková pravidla pro zatím nalezena. Proteinové glykosylace, která je nejčastější posttranslační modifikací, se účastní velké množství enzymů a enzymových komplexů. Celý proces glykosylace probíhá v endoplazmatickém retikulu a Golgiho aparátu. Glykosidasy hydrolasy Podle EC nomenklatury jsou klasifikovány jako enzymy skupiny EC 3.2.1 katalyzující hydrolýzu O- nebo N- spojených glykosidů. Dále mohou být dělěny podle mechanismu katalytické reakce na retenující a invertující a podle místa štěpení sacharidových struktur na exo (štěpí na koncích sacharidového řetězce) a endo (štěpí vně sacharidového řetězce). α-N-Acetylgalaktosaminidasa α-N-Acetylgalaktosaminidasa (α-NAGA, EC 3.2.1.49) patří mezi exoglykosidasy specificky štěpící terminální GalNAc vázaný k aminokyselinám serinu nebo threoninu nebo vázaný v oligo/polysacharidovém řetězci. Podle enzymatické nomenklatury IUB-MB (International Union of Biochemistry and 2 Molecular Biology) patří tento enzym do skupiny Hydrolas-Glykosidas- Glykosidas hydrolyzující O- nebo S- glycosidickou vazbu. Podle CAZY systému patří prokaryotická α-NAGA do rodiny 36 (Klan GH-D) a eukaryotická α-NAGA do rodiny 27 stejného klanu jako prokaryotická α-NAGA. Syntéza glykopeptidů a glykoproteinů in vitro Syntézu sacharidů můžeme rozdělit do dvou hlavních skupin: lineární a konvergentní. V lineárním přístupu jsou sacharidové podjednotky spojovány přímo s aminokyselinami. Výsledkem tohoto spojení jsou modifikované aminokyseliny nesoucí mono nebo oligosacharidové jednotky, které slouží jako základní stavební struktury při následné syntéze v roztoku nebo na pevné fázi (SPPS - solid-phase peptide synthesis). Naopak v konvergentním přístupu jsou sacharidové struktury připojovány k peptidu/proteinu, který je stále ve fázi syntézi. V závislosti na chemii používané při syntéze je v některých případech nutná ochrana funčních skupin aminokyselin i sacharidů. Po porovnání lineárních a konvergentních přístupů můžeme říct, že konvergentní syntéza glykopeptidových a glykoproteinových mimetik nabízí větší flexibilitu pokud jde o přípravu glykopeptidů. Tímto přístupem lze připravit mnoho dobře definovaných struktur bez předchozí protekce funkčních skupin aminokyselin a sacharidů. Tento přístup umožnuje provádět chemoselektivní ligační reakce, jejichž výsledkem jsou homogenní glykoproteinová mimetika. Přirozené zabíječské buňky (NK buňky) Poprvé byly popsány v roce 1975 jako lymfocyty, které jsou schopné zabíjet infikované či nádorově změněné buňky bez předchozí stimulace, proliferace a diferenciace. Jsou to velké granulární lymfocyty, které se vyvíjí stejně jako ostatní buňky imunitního systému v kostní dřeni. Vývojově jsou NK buňky bližší T lymfocytům, na jejichž povrchu byl nalezen charakteristický 3 marker NK buněk, NKR-P1 receptor. Tato skupina buněk byla nazvána NKT. Tyto buňky se účastní podobně jako Tc lymfocyty cytotoxických reakcí proti infikovaným nebo nádorově změněným buňkám. NK buňky jsou také velmi důležitými producenty cytokinů, které jsou důležité při regulaci specifické imunitní odpovědi, buněčné proliferaci nebo adhezi buněk. Jako příklad můžeme uvést INF-γ, který se uplatňuje při stimulaci makrofágů (Horejsi and Bartunkova, 2001). Lektiny C-typu Lektiny C-typu byly poprvé definovány v 80 letech dvacátého století (Drickamer, 1988). Hlavním rysem této rodiny lektinů je tak zvaná sacharid vázající doména CRD (Carbohydrate Recognication Doman). Pro vazbu sacharidu do CRD domény je nutná přítomnost vápníku. Délka sacharid vázající domény je kolem 125 amino kyselin. CRD je složena z konzervované kombinace dvou α-helixů a dvou anti-paralelních β skládaných listů spojených nahodným klubkem (Bezouska et. al. 1991). Tato sacharid vázající struktura je stabilizována dvěma nebo více disulfidickými můstky. Během evolučního vývoje některé lektiny C-typu ztratily schopnost vázat sacharidové struktury a získaly jinou vazebnou specifitu (Drickamer, 1999). 4 Cíle práce Předkládaná práce měla dva cíle. Prvním cílem bylo nalezení vhodného expresního systému pro produkci rekombinantní enzymaticky aktivní α-N- acetylagalaktosaminidasy s duální α-galaktosidasovou aktivitou. Druhým cílem bylo charakterizovat biochemické a enzymatické vlastnosti tohoto rekombinantního enzymu. Pro jejich splnění byly stanoveny tyto konkrétní podcíle: * Určení aminokyselinové sekvence přirozené α-NAGA izolované z vláknité houby Aspergillus niger. * Vývoj expresního systému vhodného pro rekombinantní produkci α-NAGA v enzymaticky aktivní formě. * Vývoj optimálních podmínek exprese poskytujících dostatečné množství rekombinantního enzymu. * Nalezení optimálního purifikačního protokolu, který by zajistil dostatečné množství α-NAGA pro funkční a strukturní studie. * Charakterizace biochemických a enzymatických vlastností rekombinantní α-NAGA. * Určení míst N-glykosylace rekombinantní α-NAGA. Těchto cílů bylo dosaženo za použití vhodných metodik, počínaje bakteriálním a kvasinkovým expresním systémem, přes biochemické a enzymatické techniky, až po pokročilé analytické metody (chromatografie, analytická ultracentrifuge, hmotnostní spektrometrie, elektronová mikroskopie atd.). 5 Výsledky Zjištění aminokyselinové sekvence α-NAGA a vytvoření počítačového modelu tohoto enzymu V první fázi projektu byl hledán přirozený producent α-NAGA. Na přítomnost α-NAGA aktivity bylo testováno 42 kmenů vláknitých hub, dále bylo provedeno testování velkého množství induktorů a kultivačních podmínek. Jako nejlepší producent α-NAGA se ukázal Aspergillus niger CCIM K2. Dále se ukázalo, že α-NAGA z této vláknité houby vykazuje duální α-GA aktivitu. Enzym byl izolován do vysoké čistoty použitím chromatografických technik (Weignerova et. al. 2008). S takto purifikovaným enzymem byla provedena 2D elektroforéza, na které byly odhaleny dva proteinové bandy. Oba tyto bandy byly analyzovány pomocí N-terminálního sekvenování a hmotnostní spektrometrie (obrázek 1). Obrázek 1. Shrnutí sekvenačních dat α-NAGA. (A) Separace α-NAGA pomocí 2D elektroforézy a následná N-terminální sekvenace odhalila různé aminokyselinové sekvence. (B) Vrchní řádek ukazuje aminokyselinovou sekvenci genu aglA z vláknité houby Aspergillus niger se signální sekvencí (tučně). Spodní řádek ukazuje shrnutí sekvenačních dat získaných Edmanovým odbouráváním a analýzou hmotnostní spektrometrií. 6 Na základě porovnání nalezené aminokyselinové sekvence AglA genu proti α-N-acetylgalaktosaminidázám, jejichž struktura byla již rozřešena, byl sestaven počítačový model α-NAGA (obrázek 2). α-NAGA se skládá z katalytické (melibiázové) domény obsahující TIM barrel, následné beta domény a C-terminální ricinové domény. α-N-Acetylgalaktosaminidasy o známé struktuře obsahují podobné složení proteinových domén avšak bez C-terminální ricinové domény (Kulik et. al. 2010). Obrázek 2. Struktura α-NAGA z Aspergillus niger. (A) α-NAGA se skláda z TIM-barrelu, ve kterém je v N-terminální oblasti umístěno aktivní místo tohoto enzymu, prostřední malé domény skládající se z osmi antiparalelních β podjednotek a ricinové domény na C terminální části (vpravo). Fialové části počítačového modelu jsou nově vytvořeny pomocí již známých struktur α-N-acetylgalaktosaminidas z kuřete (žlutá), a xylanázy z Streptomyces olivaceoviridis E-86 (zelená). (B) a (C) Pohled do aktivního místa α-NAGA aglA enzymu (fialová) a aglB enzymu (zelená) s o-NP-α-GalNAc jako substrátem. Jak se ukázalo aktivní místo aglA obsahuje prostor pro N-acetylovou skupinu substrátu. Tento prostor chybí u enzymu aglB, kde je aminokyselina Trp205, která brání vstupu N-acetylu do aktivního místa. Tento fakt vysvětluje duální aktivitu α-NAGA z Aspergillus niger. 7 Rekombinantní exprese α-NAGA α-NAGA izolována z Aspergillus niger vykazovala jedinečné vlastnosti. Produkce tohoto enzymu byla provedena v kultivačním médiu po dobu 6 dní při teplotě 26˚C, jako induktor byla použita sojová mouka. Enzym vykazoval teplotní optimum při 55˚C a hodnotě pH 1,8. Po celkové deglykosylaci bylo pH optimum posunuto na hodnotu 1,5. Nativní i deglykosylovaný enzym byl stabilní v hodnotách pH 1,5-4,0 při teplotě 4˚C. Nativní enzym byl při této teplotě stabilní několik měsíců. Byla zjištěna hodnota Km purifikovaného enzymu 0.73 mmol/l pro o-NP-α-GalNAc v 50 mM citrát-fosfátovém pufru (pH 3,5) při 35°C. Duální α-GA aktivita byla vysvětlena evolučním mapováním a počítačovým modelováním α-NAGA. Evolučním mapováním bylo zjištěno, že α-NAGA se vyvinula z α-GA (popsáno výše). Rozdíl mezi α-GA a α-NAGA je pravě v tak zvané vazebné kapse, která umožňuje vstup N-acetylaminu do aktivního místa enzymu (obrázek 2). Na základě vlastností deglykosylované α-NAGA byl nejdříve navrhnut prokaryotický expresní systém Escherichia coli pro rekombinantní přípravu tohoto enzymu. Gen kódující α-NAGA byl získán z RNA, která byla izolována z houby Aspergillus niger, tato celková RNA byla reverzní transkripcí přepsána do DNA sekvence. Gen byl klonován do prokaryotického expresního vektoru pPET 30a+. Pro expresi α-NAGA byly použity dva expresní systémy. Jako první byl použit expresní systém E. coli BL-21 (DE3) Gold. V případě tohoto systému byla α-NAGA exprimována ve formě inkluzních tělísek bez enzymové aktivity. Bylo provedeno několik renaturačních experimentů, bohužel však bez uspěchu. Jako druhý prokaryotický expresní systém byl použit E. coli ArticExpressCells. Výhoda tohoto expresního systému je schopnost produkce rekombinantních proteinů při nízké teplotě obvykle kolem 12˚C. Nízká teplota by měla zajišťovat pomalejší produkci, vyšší účinnost skládání proteinu a menší pravděpodobnost agregace. Bohužel, ani v tomto případě nebylo dosaženo produkce aktivní α- NAGA. 8 Na základě těchto experimentů byl navrhnut eukaryotický expresní system Pichia pastoris. Bylo použito několik expresních kmenů a mnoho odlišných kultivačních podmínek, bohužel však ani v tomto případě nebylo dosaženo úspěšné exprese aktivní α-NAGA. Jako poslední kvasinkový expresní systém byl použit expresní sytém Saccharomyces cerevisiea (Ashida et. al. 2000). Produkce rekombinantní enzymaticky aktivní α-NAGA byla v tomto případě úspěšná. Rekombinantně připravený protein byl úspěšně exprimován, biochemicky a enzymově charakterizován. Vlastnosti rekombinantní α-NAGA byly kromě podjednotkového složení a pH aktivity v oblasti neutrálního pH shodné s nativní α-NAGA. Rekombinantní α-NAGA se vyskytuje v roztoku ve dvou aktivních formách, monomerické a dimerické. Obě tyto formy vykazují jak α-NAGA, tak α-GA aktivitu. Výsvětlení tohoto jevu může být tzv. overexprese α-NAGA a umístění tohoto enzymu v různých buněčných organelách. Část enzymu se může vyskytovat v cytoplasmě, kde je redukční prostředí a část v jiných membránových organelách. Tuto hypotézu potvrzuje experiment, kdy bylo do lyzačního pufru přidáno malé množství detergentu, který výrazně zvýšil specifickou enzymovou aktivitu (obrázek 4). Druhý rozdíl mezi rekombinantní a přirozenou α-NAGA je v aktivitě v oblasti neurálního pH. Rekombinantní α-NAGA vykazuje přibližně 15% α-NAGA aktivitu, zatímco přirozená α- NAGA je v této oblasti neaktivní. 9 Obrázek 3. Časový profil produkce α-NAGA v expresním systému S. cerevisiae: (A) SDS- PAGE elektroforéza (B), enzymová aktivita. Optimalizace produkce byla provedena při 30˚C, jako induktor byla použita galaktóza. Rekombinantní α-NAGA byla identifikována pomocí SDS elektroforézy v redukujícím prostředí jako band o hmotnosti přibližně 76 kDa. Přidáním detergentu do lyzačního pufru bylo dosaženo zvýšení enzymové aktivity. Tímto experimentem byl potvrzen výskyt rekombinantního enzymu v různých buněčných kompartmentech. Obrázek 4. α-NAGA a α-GA aktivita měřená v buněčném lyzátu s přídavkem a bez přídavku dodecylmaltosidu jako detergentu. 10 Krok Protein Aktivita Spec.aktivita Čistota Výtěžek (mg) (U) (U mg-1) (násobek) (%) Buněčný lyzát 378.0 150.0 0.4 1.0 100 Phenyl-sepharose HR 31.4 102.3 3.3 8.3 68.2 S-Sepharose FF 12.8 81.0 6.3 15.8 54.0 Superdex 200 1.5 41.9 27.9 69.9 27.9 Mono P 5/200 0.4 18.1 42.3 105.9 12.1 Tabulka 1. Purifikace rekombinantní α-NAGA ze Saccharomyces cerevisiae. Čistota enzymu je vztažena k počátečnímu materiálu. Rekombinantní α-NAGA vykazuje duální enzymatickou aktivitu v oblasti neutrálního pH. Tohoto faktu by bylo možné využít při změně červených krvinek typu A na typ H(0). Molekulová hmotnost přirozené a rekombinantní α-NAGA byla zjištěna pomocí gelové filtrace a analytické ultracentrifugy (Schutz P. 2003). Těmito metodami byla zjištěna molekulová hmotnost rekombinantního enzymu 70 kDa a 130 kDa (Schutz P. 2000). Tento enzym se vyskytuje v roztoku jako monomer a dimer. Hmotnost přirozené α-NAGA byla stanovena na približnou hodnotu 70 kDa. α-NAGA je glykoprotein, který obsahuje celkově osm potenciálních N-glykosylačních míst Asn 14, 52, 58, 88, 168, 320, 401 a 456. Analýzou pomocí hmotnostní spektrometrie byla identifikována místa N-glykosylace (obrázek 6). . Obrázek 5. Efekt pH na aktivitu přirozené α-NAGA (- -●- -) a rekombinantní α-NAGA (─●─). 11 Obrázek 6. Stanovení míst N-glykosylace. (A) α-NAGA byla deglykosylována PNGázou F a štěpena Asp-N proteázou. MALDI-TOF hmotnostní analýza ukázala nový peptidový signál m/z 1128.337. Tento signál odpovídá peptidu 310-319 (m/z pro [M+H]+ 1127.337) s 1 Da zvýšením hmotnosti, která odpovídá změně glykosylovaného asparaginu na kyselinu asparagovou vzniklou deglykosylací PNGázou F. (B) α-NAGA byla štěpena Asp-N a deglykosylována Endo Hf, která štepí sacharidovou vazbu mezi dvěmi GlcNAc jednotkami připojenými k aminokyselině asparaginu. Hmota finálního peptidu je zvýšená o 203,079 Da. Peptidový signál m/z 2004.157 odpovídá opět peptidu 310-325 (m/z for [M+H]+ 1801.076) se zvýšením hmotnosti o 203.079 Da (GlcNAc). Kooperace mezi podjednotkami CD69 receptoru Bylo prokázáno, že vazba HexNAc na rozpustnou formu receptoru CD69 způsobuje velké změny na molekularní úrovni. Tyto změny nebyly pozorovány v případě mutantních receptorů Q93A a R134A, které nemohou tvořit nekovalentní dimerní formu CD69. Podobná situace je na buněčné úrovni, kde signalizace pomocí protilátek či bivalentních ligandů není úspěšná v případě výše popsaných mutantů. Bylo připraveno několik konstruktů vysoce stabilního rozpustného receptoru CD69, který je vhodný na ligandové vazebné studie. První vazebné studie byly provedeny s monosacharidovými jednotkami a vápníkem. V případě vazby vápníku nebyly zjištěny rozdíly mezi vazbou kovalentního dimeru a 12 nekovalentní dimerní formy. Každý z proteinů vázal 1 mol vápníku/mol CD69 podjednotky s Kd přibližně 58 μM. Významné rozdíly byly však zjištěny při vazbě HexNAc. Hodnota IC50 pro rozpustnou formu CD69 s vazbou dvou HexNAc, D-GlcNAc a D-GalNAc byla přibližně 10-5 M pro každý ligand. Tyto hodnoty byly přibližně 10 krát nižší pro kovalentní dimerní protein a 100 krát nižší pro nekovalentní dimerní formu tohoto proteinu. Obrázek 7. Měření přímé interakce rozpustné formy nekovalentního dimeru CD69 receptoru s ManNAc a GlcNAc. (A, B) NMR titrace rozpustného CD69 s ManNAc a GlcNAc. (C, D) Koncentrační závislost saturace receptoru měřená metodami rovnovážné dialýzy a tryptofanové zhášení fluorescence s použitím GlcNAc, ManNAc a Gal. Byly připraveny tři série ligandů potenciálně vhodných pro vazebné studie s receptory NK buněk NKR-P1 a CD69 (Veprek et. al. 2006). Každý z těchto ligandů byl individuálně testován použitím radioznačené formy rozpustného receptoru. V případě NKR-P1 se námi připravené ligandy ukázaly jako průměrné nebo slabé v porovnání s GlcNAc jako kontrolou. Dále bylo zjištěno, že β1-4 spojení je více preferované, než ostatní sacharidové vazby. Větvené sacharidové struktury výrazně snižovaly inhibiční potenciál nezávisle na použité sérii. V případě receptoru CD69 byly získány velmi zajímavé výsledky. Jen 13 malé rozdíly byly nalezeny v případě linaerních ligandů ze série GlcNAc/GalNAc v porovnáním s GlcNAc jako kontrolou. Nicměně zvyšující se inhibiční potenciál byl objeven u série větvených GlcNAc/GalNAc. Na základě těchto předběžných výsledků byly navrženy další větvené sacharidové struktury, které budou použity pro další vazebné studie. Obrázek 8. Biologické testování synteticky připravených HexNAc struktur pomocí inhibičních experimentů. Připravené sloučeniny byly testovány jako inhibitory vazby radioznačených receptorů rNKR-P1A (vlevo) nebo hCD69 (vpravo), které vykazují vysokou afinitu k GlcNAc23BSA ligandu. 14 Použitá literatura Ashida H., Tamaki H., Fujimoto T., Yamamoto K., Kumagai H. (2000). Molecular cloning of cDNA encoding α-N-acetylgalactosaminidase from Acremonium sp. and its expression in yeast. Arch. Biochem. Biophys. 384: 305– 310. Bezouska, K.; Crichlow, G. V.; Rose, J. M.; Taylor, M. E.; Drickamer, K. (1991). Evolutionary conservation of intron position in a subfamily of genes encoding carbohydrate-recognition domains. J. Biol. Chem. 266: 11604-11609. Drickamer K. (1988). Two distinct classes of carbohydrate-recognition domains in animals lectins. J Biol. Chem. 263: 9557-9560. Drickamer K. (1999). C-type lectin-like domains. Curr. Opin. Struct. Biol. 9: 585-590. Hořejší V., Bartůňková J. (2001). Základy imunologie. Triton. Praha. Kulik N., Weignerova L., Filipi T., Pompach P., Novak P., Mrazek H., Slamova K., Bezouska K., Kren V., Ettrich R. (2010). The α-galactosidase type A gene aglA from Aspergillus niger encodes a fully functional α-N- acetylgalactosaminidase. Glycobiology 20: 1410-1419. Schutz P. (2000). Size distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophys. J . 78: 1606-1619. Schutz P. (2003). On the analysis of protein self-association by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Anal. Biochem. 320: 104-124. Veprek, P.; Hajduch, M.; Dzubal, P.; Kuklik, R.; Polakova, J.; Bezouska, K. (2006). Comblike dendrimers containing Tn antigen modulate natural killing and induce the production of Tn specific antibodies. J Med Chem 49 (21): 6400- 6407. Weignerova L., Filipi T., Manglova D., Kren V. (2008). Induction, purification and characterization of alpha-N-acetylgalactosaminidase from Aspergillus niger. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79: 769-774. 15 Seznam publikací Kulik N., Weignerova L., Filipi T., Pompach P., Novak P., Mrazek H., Slamova K., Bezouska K., Kren V., Ettrich R. (2010). The α-galactosidase type A gene aglA from Aspergillus niger encodes a fully functional α-N- acetylgalactosaminidase. Glycobiology 20: 1410-1419. Rey M., Mrazek H., Pompach P., Novak P., Pelosi L., Brandolin G., Forest E., Havlicek V., Man P. (2010). Effective removal of nonionic detergents in protein mass spectrometry, hydrogen/deuterium exchange, and proteomics. Anal. Chem. 82: 5107-5116. Kovalova A., Ledvina M., Saman D., Zyka D., Kubickova M., Zidek L., Sklenar V., Pompach P., Kavan D., Bily J., Vanek O., Kubinkova Z., Libigerova M., Ivanova L., Antolikova M., Mrazek H., Rozbesky D., Hofbauerova K., Kren V., Bezouska K. (2010). Synthetic N-acetyl-D-glucosamine based fully branched tetrasaccharide, a mimetic of the endogenous ligand for CD69, activates CD69+ killer lymphocytes upon dimerization via a hydrophilic flexible linker. J. Med. Chem. 53: 4050-4065. Kavan D., Kubickova M., Bily J., Vanek O., Hofbauerova K., Mrazek H., Rozbesky D., Bojarova P., Kren V., Zidek L., Sklenar V., Bezouska K. (2010). Cooperation between subunits is essential for high-affinity binding of N-acetyl- D-hexosamines to dimeric soluble and dimeric cellular forms of human CD69. Biochemistry 49: 4060-4067. 16 Mrazek H., Benada O., Man P., Vanek O., Kren V., Bezouska K., Weignerova L. (2011). Facile production of Aspergillus niger α-N-acetylgalactosaminidase in yeast. Submitted for Protein expression and purification (under review). Mrazek H., Weignerova L., Bezouska K. (2011). Aktivní forma α-N- acetylgalaktosaminidázy z vláknité houby Aspergillus niger a její rekombinantní exprese. Czech Patent Application. 17
Abstract v angličtině:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Biochemistry α-N-Acetylgalactosaminidase as a tools in the synthesis of complex oligosaccharide immune stimulators Summary of Ph. D. Thesis Mgr. Hynek Mrázek Supervisor: Prof. RNDr. Karel Bezouška, Dsc. Prague 2011 1 Introduction Glycoproteins Glycoproteins consist of proteins to which carbohydrate are covalently linked. The distinction between proteoglycans and glycoproteins residues is in the level and types of carbohydrate modification. Carbohydrates are linked to the protein component through either O-glycosidic or N-glycosidic bonds. The N-glycosidic linkage is through the amide group of asparagine. The O- glycosidic linkage is to the hydroxyl of serine, threonine or hydroxylysine. The predominant carbohydrate attachment in glycoproteins of mammalian cells is via N-glycosidic linkage. The site of carbohydrate attachment to N- linked glycoproteins is found within a consensus sequence of amino acids, N-X- S(T), where X is any amino acid except proline. While the N-glycosylation is governed by the above rules, no exact rules were found for glycosylation of O- type. This process is the step-wise addition of the sugar residues directly onto the polypeptide chain. Biosynthesis of glycoproteins occurs via protein glycosylation (the addition of chains of sugar units, or oligosaccharides, to proteins). Protein glycosylation is a group of complex posttranslational modifications that occur through the function of many enzymes working together in the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi apparatus. Glycoside hydrolases Glycoside hydrolases are classified into EC 3.2.1 as enzymes catalyzing the hydrolysis of O- or S-glycosides yielding smaller sugar moieties. They can be classified as either retaining or inverting enzymes. Glycoside hydrolases can also be classified as exo or endo acting, dependent upon whether they act at the (usually non-reducing) end or in the middle, respectively, of an oligo/polysaccharide chain. 2 α-N-Acetylgalactosaminidase α-N-Acetylgalactosaminidase (α-NAGA; EC.3.2.1.49) is an exoglycosidase specific for the hydrolysis of terminal GalNAc α-linked to amino acids serin or threonine, or to various sugar chains. According to enzyme nomenclature of IUB-MB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) these enzymes belong to Hydrolase-Glycosidase-Glycosidase hydrolyzing O- and S- glycosidic linkage. According to CAZY system prokaryotic α-NAGA belong to enzyme family 36 (Clan GH-D) and eukaryotic α-NAGA to enzyme family 27 the same clan like prokaryotic enzyme. Synthesis of glycopeptides and glycoproteins Two major approaches can be distinguished: the linear and the convergent assembly. In the linear assembly, carbohydrates are coupled to amino acids to give modified amino acids carrying either mono- or oligosaccharides. These are used as building blocks in solution or solid-phase peptide synthesis (SPPS) to provide glycoconjugates and, respectively. In convergent approaches, carbohydrates are coupled to presynthesized peptides or to proteins. Depending on the type of chemistry used for carbohydrate attachment, there might be a need for protecting groups at the peptide and carbohydrate, an approach which is confined to synthetic peptides. Conjugation of carbohydrates to full-length proteins is possible via chemoselective ligation to amino acids with a unique reactivity, for example cysteine residues. Compared to linear approaches, the convergent synthesis of glycopeptide and glycoprotein mimetics offers greater flexibility with respect to the sugars attached to a peptide. Thus, the preparation of several well-defined glycoforms of the same peptide/protein becomes possible. If chemoselective ligation reactions are employed for the sugar attachment, it is possible to modify unprotected peptides and even whole proteins. 3 Convergent approaches using chemoselective ligation reactions provide access to homogeneous glycoprotein mimetics that are likely to impact our understanding of how specific glycoforms mediate physiological processes. Despite the progress made in the field, many challenges remain, e.g., the development of methods for the controlled introduction of multiple (different) glycans into proteins. NK cells (natural killer cells) NK cells have been described only in 1975 as lymphocytes, which are able to kill without prior stimulation, proliferation and differentiation of some tumor or virus-infected cells. They are large granular lymphocytes that develop in the bone marrow with other cells from pluripotent stem cells. Developmentally they are closer to T lymphocytes - this relationship became apparent by the recent discovery of T lymphocytes, which bear on their surface markers characteristic of NK cells (NKR-P1). This group was called NKT and cells are similarly as the Tc lymphocytes involved in cytotoxic reactions, which are directed against tumor or virus-infected altered cells. Production of cytokines is also important in the regulation of specific immune responses, cell differentiation, and cell adhesion. The most important cytokine produced by NK cells, is INF-γ (Horejsi and Bartunkova, 2001), which stimulates macrophages. C-type lectins The C-type lectins were first properly defined in the 80th of the 20th century (Drickamer, 1988). A common feature of this family is called the CRD (Carbohydrate Recognication Doman). CRD requires calcium ions for its binding activity. The lenght of CRD of C-type lectins is around 125 amino acids. CRD is composed of a highly conserved combination of two α-helixes and two anti-parallel β-sheets connected by random coils with 14 invariant and another 18 highly conserved amino acids (Bezouska et. al. 1991). This carbohydrate 4 domain is stabilized by two or more disulphide bonds. Different binding specificity is provided by the participation of variable loops in binding site formation. During evolution some members of C-type lectins have lost the ability to bind carbohydrates or calcium, instead they can gained another substrate specifity (Drickamer, 1999). 5 Aim of the study The aim of this study was to find suitable expression system for recombinat production of enzymatic active α-NAGA with dual activity. The second aim was characterize enzymatic and biochemical properties of this enzyme. In order to achieve this goal, the following specific aims heve been adopted for this study. * To determined amino acid sequence of native of α-NAGA isolated from filamentous fungi Aspergillus niger. * To develop expression system suitable for recombinant expression of α- NAGA in enzymatic active form. * To develop the optimal conditions providing sufficient amount of α- NAGA. * To develop purification protocol providing sufficient amount of α-NAGA for functional and structural studies. * To investigate biochemical and enzymatic properties of α-NAGA. * To determined N-glycosylation sites of α-NAGA. In order to achieve these goals, we have adopted the suitable methodology including the bacterial and yeast expression system, different biochemical and enzymatic techniques (chromatography, analytic ultracentrifuge, mass spectrometry, electron microscopy etc.). 6 Results Determination of amino acids sequence of α-NAGA and computer modeling This issue has been addressed experimentally by screening a large library of filamentous fungi (42 strains) and a series of inducers and cultivation conditions for the presence of α-NAGA activity. Only a single enzyme from A niger CCIM K2 demonstrated this activity together with the one of α-GA. The enzyme was isolated to very high purity using chromatofocusing with narrow range polybuffers, but the highly purified enzyme still had the dual activity. As the final separation technique applied at small scale, two dimensional electrophoresis using narrow pH strips was applied that resolved the preparation into two spots (Weignerova et. al. 2008). Both spots were analyzed by N- terminal sequencing and by mass spectrometry sequencing. Figure 1. Summary of sequencing data for enzyme acting as α-NAGA. (A) Separation of prepared enzymes differing in their indicated N-terminal sequences by 2D electrophoresis, indicating minor heterogeneity in enzyme preparation confirmed by N-terminal sequencing. (B) Upper lane indicates amino acid sequence of aglA gene from Aspergillus niger with signal peptide sequence bold. Lower lane shows summary of sequence data obtained by N-terminal Edman degradation of entire enzyme or isolated peptides after CNBr cleavage (italics) or by mass spectrometric analysis of peptide fragments. 7 Alignment of the found AglA sequence against structurally solved α-N- acetylgalactosaminidases revealed high sequence identity allowing to construct a molecular model of the enzyme (Figure 2). The molecular architecture of α- NAGA is composed of catalytic (mellibiase) domain containing TIM barrel, followed by a beta sandwith, and the C-terminal ricin domain. Related anzymes such as AglB contain similar catalytic domain buy lack the C-terminal ricin-like domain (Kulik et. al. 2010). \ Figure 2. Structure of the α-NAGA from Aspergillus niger. (A) Overall fold shows a TIM- barrel with the active site at the N-terminus, a small domain of eight antiparallel β-strands packed in β-sandwich in the middle, and a ricin-like domain on the right. The generated model (magenta) is overlaid with the crystal structure of the homologs α-N- acetylgalactosaminidase from chicken (yellow), with α-N-acetylgalactosamine and the ricin- like domain from the xylanase from Streptomyces olivaceoviridis E-86 (green). (B) and (C) Molecular surface of the active site of aglA enzyme (magenta) and aglB enzyme (yellow) with o-NP-α-GalNAc. The active site of aglA enzyme has extra space for accommodating the N-acetyl-group of the substrate, while in aglB enzyme this space is occupied by Trp205. 8 Recombinant expression of Aspergillus niger α-NAGA α-NAGA isolated from Aspergillus niger displayed unique properties. The production of α-NAGA carried out in cultivation medium 6 days at 26˚C as the inductor was used soy flour. The enzyme was optimally active at 55˚C and at of pH 1.8. The enzyme deglycosylation shifted the pH optimum to 1.5. Both enzymes forms were stable at of pH 1.5 - 4 and 4˚C. The enzyme was maintained without loss activity several months. The purified enzyme exhibited a Km value of 0.73 mmol/l for o-NP-α-GalNAc in 50 mM citrate-phosphate buffer (pH 3.5) at 35°C (Weinerova et. al. 2008). The dual α-GA activity was also found in the native form of α-NAGA. The dual activity of α-NAGA was explained by evolutionary mapping of this enzyme class and computer model. On the basic of this mapping was observed that the α-NAGA is evolved from α-GA described above. The large differ in active site between α-GA and α-NAGA is so-called binding pocket for N-acetylamine. This binding pocket was revealed by substrate docking experiments. On the basic of these properties were decided to prepare the recombinat form of this enzyme. Since the deglycosylated α-NAGA was active several months without significantly loss of enzyme activity, prokaryotic expression system Escherichia coli was chose. The gene of interest was gained from total RNA isolated from Aspergillus niger and reverze transcripted into DNA sequence. The gene of interest was cloned into prokaryotic expression vector. Two prokaryotic expression strains were used. Firstly, E. coli BL-21 (DE3) Gold. In the case of this strain we observed that the α-NAGA is produced in form of inclusion bodies without enzymatic activity. We have a lot of experiences with renaturation of recombinant proteins in our laboratory. For these reasons were tried many renaturation protocols and techniques. Unfortunately, not one was successful. The E. coli ArticExpressCells were used 9 as a second possibility of expression in prokaryotic expression system. The advantage of this system is low temperature of production around 12˚C. The low temperature should help to correct protein folding and preclude the aggregation of proteins to inclusion bodies. Unfortunately, in this case was no observed the expression of α-NAGA. This failure can be explained a large glycosylation of the α-NAGA, this posttranslation modification is probably very important in refolding process. Of these reasons we decided for using of yeast expression system Pichia pastoris. Unfortunately, the expression was not success. As a last expression system was used Saccharomyces cerevisiae (Ashida et. al. 2000). The production of α-NAGA in this expression system was successful. The recombinant enzyme was purified and biochemically and enzymatically characterised. Biochemical and enzymatic properties of recombinant protein was identical except the subunit structure and activity in neutral pH. The recombinant enzyme occurs in two active forms monomeric and dimeric. The explanation of these two forms can be in overexpression and the placement of this enzyme inside the cell. Part of enzyme can occur in the membrane organels, where are other conditions for refolding of the proteins. The second part of enzyme can be in cytoplasm, where is reduction environment. This hypothesis confirmed the experiments with addition of detergent to lysate mixture. The enzymatic activity increases two times after addition of detergent. The second differ between wild-type and recombinant α- NAGA is activity in neutral pH. The recombinant enzyme displays around 15% activity in this pH unlike the wild-type which has no activity. 10 Figure 3. Time profile of the recombinant intracellular α-NAGA production by S. cerevisiae W303: (A) SDS-PAGE electrophoresis (B) enzyme activity. Time optimization was carried out at 30˚C. Aliquots of the cell culture were harvested 12, 24, 48, 72, 96 and 120 hours after transfer to the SC medium with galactose as an inducer. The recombinant α-NAGA was identified as a band with an apparent molecular mass of approx. 76 kDa. Interestingly, the addition of the detergent into the lysis buffer caused two fold increase in activity. Figure 4. α-NAGA and α-GA activity measured in cell lysates with and without dodecylmaltoside (detergent) in lysis buffer. 11 Step Protein Activity Spec.activity Purity Yield (mg) (U) (U mg-1) (fold) (%) Cell lysate 378.0 150.0 0.4 1.0 100 Phenyl-sepharose HR 31.4 102.3 3.3 8.3 68.2 S-Sepharose FF 12.8 81.0 6.3 15.8 54.0 Superdex 200 1.5 41.9 27.9 69.9 27.9 Mono P 5/200 0.4 18.1 42.3 105.9 12.1 Table 1. Purification of the recombinant α-NAGA from Saccharomyces cerevisiae W303- 1A. Purity is related to the starting material. The pH profil of recombinant α-NAGA was changed, the recombinant enzyme more active in neutral pH compare to wild-type α-NAGA. This fact predetermines this enzyme for the red blood cell gropu A transformation in to the group of H(0), beeing a universal donor. Figure 5. Effect of pH on the activity of wild α-NAGA (- -●- -) and recombinant α-NAGA (─●─). The molecular weight of the native and recombinant α-NAGA was investigated using gel filtration and analytical ultracentrifuge (Schutz P. 2003). The gel filtration of the recombinant α-NAGA showed two active forms with estimated molecular mass of approximately 70 kDa nad 130 kDa. The wild α-NAGA occured only as 70 kDa monomer. The analytical centrifugation confirmed the molecular mass of both enzymes (Schutz P. 2000). 12 α-NAGA was found to be a glycoprotein. There are eight of potential N- glycosylation sites located at Asn 14, 52, 58, 88, 168, 320, 401 and 456. The recombinant α-NAGA was treated with Endo Hf and PNGase F. After Endo Hf treatment we identified peaks corresponding to the peptides containing N-glycosylation sites based on increased m/z of peptides containing N-acetylglucosamine residues (203.079 Da). When α-NAGA was treated with PNGase F and digested with AspN, new peaks appeared. These peaks corresponded to the peptides that arose from the conversion of asparagine to asparatic acid as shown in Figure 6b. Six asparagines of the eight potential N- glycosylation sites in the α-NAGA located at residues 14, 52, 58, 88, 320 and 456 were found to be glycosylated. Figure 6. Determination of N-glycosylation sites. (A) α-NAGA was digested with Asp-N and treated with PNGase F. MALDI-TOF mass spectrometry analysis showed that the high mass peaks had disappeared, while a new peptide signal at m/z 1128.337 appeared. This peak corresponded to the peptide residue 310-319 (calculated m/z for [M+H]+ 1127.337) with a 1 Da mass increase from the conversion of asparagines to aspartic acid by PNGase F. (B) α- NAGA was digested with Asp-N and deglycosylated with Endo Hf, which cleaves the bond between two GlcNAc units attached to asparagines. The final peptide has a mass increase of 203,079 Da. The peptide signal at m/z 2004.157 corresponded to peptide residue 310-325 (calculated m/z for [M+H]+ 1801.076) with a 203.079 Da mass increase for GlcNAc. 13 In conclusion, we prepared stable, active recombinant α-NAGA in large quantities in a simple eukaryotic system of Saccharomyces cerevisiae. The notable advantage of our expression system is in shorter production times, and, up to fourfold increase of the enzyme yields compared to the native production system. Unique properties of this enzyme can find a use for the enzymatic synthesis of various carbohydrate structures and for transformation of the red blood cell group A to the group of H (0), the universal donor. Cooperation between Subunits of CD69 receptor We reported that the binding of HexNAc to soluble CD69 is highly cooperative at molecular level, and this cooperativity is not seen for Q93A and R134A mutants with disturbed formation of noncovalent dimers. Similarly at the cellular level, efficient signaling after CD69 crosslinking by antibody or bivalent ligand is diminished for the above mutants with a damaged subunit cross-talk more dramatically than for CD69 bearing C68A mutation, and thus lacking the disulfide bridge forming the covalent dimer identified previously as the critical signaling element. Several constructs were generated for preparation of highly stable soluble recombinant CD69 proteins, which is suitable for ligands identification experiments. Preliminary ligand binding experiments were performed to evaulate the ability of these constructs to bind calcium nad monosaccharide units. In the case of the ability to bind calcium there has not been difference between the covalent dimeric protein and noncovalent dimeric protein when compared to the monomeric form. Each of these proteins bound 1 mol of calcium/mol of CD69 subunit with Kd of approximately 58 μM. On the other hand, significant differences between these protein constructs were observed with regard to the binding of HexNAc. While the IC50 values for the soluble monomeric CD69 with regard to binding of the two active HexNAc, D-GlcNAc 14 and D-GalNAc, were each approximately 10-5 M, these values were about 10 times lower for the covalent dimeric protein and about 100 times lower for the other two highly stable noncovalent dimeric proteins. Figure 7. Measurements of direct interaction of soluble noncovalent dimer CD69 with ManNAc and GlcNAc. (A, B) NMR titration of soluble CD69 with ManNAc and GlcNAc, respectively. (C, D) Concentration dependence of receptor saturation measured by equilibrium dialysis and tryptophan fluorescence quenching, respectively, using GlcNAc, ManNAc, and Gal as indicated. Synthetic GlcNAc Based Fully Branched Tetrasaccharide, a Mimetic of the Endogenous Ligands fo CD69 Three series of carbohydrate ligands for NK cells receptors NKR-P1 and CD69 were prepared (Veprek et. al. 2006). Individual compounds were tested as inhibitors of binding of the soluble radiolabeled receptor. In the case of NKR- P1, the results indicate that synthesized compounds were average or poor ligands compared to the GlcNAc control and the β1-4 linkage is preferred to other linkages. Branching of the oligosaccharide resulted in significant decrease in the inhibitory potencies independently of the series used. On the other hand more interesting results were obtained in the case of CD69 receptor. Only minor differences have been found in the linear GlcNAc/GalNAc series compared to 15 the GlcNAc monosaccharide control. However, hierarchical increase in inhibitory potencies has been found in the branched GlcNAc/GalNAc series. On the basic of these results the detailed structure-activity studies were performed with branched GlcNAc. Figure 8. Biological testing of the synthesized HexNAc based oligosaccharides using inhibition assay. Indicated compounds were tested as the inhibitors of binding of the radiolabeled rNKR-P1A (left) or hCD69 (right) to the high affinity GlcNAc23BSA ligand. From the complete inhibition curves, IC% values were calculated. 16 References Ashida H., Tamaki H., Fujimoto T., Yamamoto K., Kumagai H. (2000). Molecular cloning of cDNA encoding α-N-acetylgalactosaminidase from Acremonium sp. and its expression in yeast. Arch. Biochem. Biophys. 384: 305– 310. Bezouska, K.; Crichlow, G. V.; Rose, J. M.; Taylor, M. E.; Drickamer, K. (1991). Evolutionary conservation of intron position in a subfamily of genes encoding carbohydrate-recognition domains. J. Biol. Chem. 266: 11604-11609. Drickamer K. (1988). Two distinct classes of carbohydrate-recognition domains in animals lectins. J Biol. Chem. 263: 9557-9560. Drickamer K. (1999). C-type lectin-like domains. Curr. Opin. Struct. Biol. 9: 585-590. Hořejší V., Bartůňková J. (2001). Základy imunologie. Triton. Praha. Kulik N., Weignerova L., Filipi T., Pompach P., Novak P., Mrazek H., Slamova K., Bezouska K., Kren V., Ettrich R. (2010). The α-galactosidase type A gene aglA from Aspergillus niger encodes a fully functional α-N- acetylgalactosaminidase. Glycobiology 20: 1410-1419. Schutz P. (2000). Size distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophys. J . 78: 1606-1619. Schutz P. (2003). On the analysis of protein self-association by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Anal. Biochem. 320: 104-124. Veprek, P.; Hajduch, M.; Dzubal, P.; Kuklik, R.; Polakova, J.; Bezouska, K. (2006). Comblike dendrimers containing Tn antigen modulate natural killing and induce the production of Tn specific antibodies. J Med Chem 49 (21): 6400- 6407. Weignerová L., Filipi T., Manglová D., Kren V. (2008). Induction, purification and characterization of alpha-N-acetylgalactosaminidase from Aspergillus Niger. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79: 769-774. 17 List of publication Kulik N., Weignerova L., Filipi T., Pompach P., Novak P., Mrazek H., Slamova K., Bezouska K., Kren V., Ettrich R. (2010). The α-galactosidase type A gene aglA from Aspergillus niger encodes a fully functional α-N- acetylgalactosaminidase. Glycobiology 20: 1410-1419. Rey M., Mrazek H., Pompach P., Novak P., Pelosi L., Brandolin G., Forest E., Havlicek V., Man P. (2010). Effective removal of nonionic detergents in protein mass spectrometry, hydrogen/deuterium exchange, and proteomics. Anal. Chem. 82: 5107-5116. Kovalova A., Ledvina M., Saman D., Zyka D., Kubickova M., Zidek L., Sklenar V., Pompach P., Kavan D., Bily J., Vanek O., Kubinkova Z., Libigerova M., Ivanova L., Antolikova M., Mrazek H., Rozbesky D., Hofbauerova K., Kren V., Bezouska K. (2010). Synthetic N-acetyl-D-glucosamine based fully branched tetrasaccharide, a mimetic of the endogenous ligand for CD69, activates CD69+ killer lymphocytes upon dimerization via a hydrophilic flexible linker. J. Med. Chem. 53: 4050-4065. Kavan D., Kubickova M., Bily J., Vanek O., Hofbauerova K., Mrazek H., Rozbesky D., Bojarova P., Kren V., Zidek L., Sklenar V., Bezouska K. (2010). Cooperation between subunits is essential for high-affinity binding of N-acetyl- D-hexosamines to dimeric soluble and dimeric cellular forms of human CD69. Biochemistry 49: 4060-4067. Mrazek H., Benada O., Man P., Vanek O., Kren V., Bezouska K., Weignerova L. (2011). Facile production of Aspergillus niger α-N-acetylgalactosaminidase in yeast. Submitted for Protein expression and purification (under review). Mrazek H., Weignerova L., Bezouska K. (2011). Aktivní forma α-N- acetylgalaktosaminidázy z vláknité houby Aspergillus niger a její rekombinantní exprese. Czech Patent Application. 18
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Hynek Mrázek, Ph.D. 6.64 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Hynek Mrázek, Ph.D. 767 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Hynek Mrázek, Ph.D. 737 kB
Stáhnout Posudek vedoucího prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. 1.26 MB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Ing. Tomáš Macek, CSc. 409 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D. 174 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 985 kB