velikost textu

Studium interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s proteinem 14-3-3

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s proteinem 14-3-3
Název v angličtině:
Study of interactions of forkhead transcription factor FOXO4 with DNA and the 14-3-3 protein
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Petr Vácha
Školitel:
doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D.
Oponenti:
RNDr. Jiří Pavlíček, Ph.D.
RNDr. Jan Krůšek, CSc.
Id práce:
83368
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyzikální a makromol. chemie (31-260)
Program studia:
Fyzikální chemie (P1404)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
10. 9. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
14-3-3, FOXO4, ASK1, struktura, fluorescence
Klíčová slova v angličtině:
14-3-3, FOXO4, ASK1, structure, fluorescence
Abstrakt:
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra fyzikální a makromolekulární chemie Autoreferát doktorské práce Studium interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s proteinem 14-3-3 RNDr. Petr Vácha Školitel: Prof. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. Praha 2015 Abstrakt Tato doktorská práce se zabývá studiem interakcí lidského forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s regulačním proteinem 14-3-3. Hlavním cílem této práce byla detailní charakterizace interakce DNA-vazebné domény proteinu FOXO4 se dvěmi kanonickými sekvencemi DNA a dále objasnění úlohy proteinu 14-3-3 v procesu regulace funkce FOXO4. Transkripční faktory FOXO jsou účinnými aktivátory transkripce genů, čímž ovlivňují celou řadu buněčných procesů. Protein FOXO4 patří do rodiny forkhead transkripčních faktorů, což je skupina několika desítek proteinů, jejichž společným znakem je velmi konzervovaná DNA-vazebná doména. Podstata DNA-vazebné specifity těchto proteinů, tedy co přesně determinuje drobné odlišnosti ve vazebných vlastnostech jednotlivých forkhead proteinů, je i přes množství dostupných strukturních dat stále nejasné. Proto byla provedena detailní charakterizace interakcí mezi DNA-vazebnou doménou proteinu FOXO4 a DNA pomocí rezonance povrchového plazmonu (SPR) a časově- rozlišené fluorescenční spektroskopie. Výsledky této práce umožnily objasnit kinetický model vazby FOXO4 na DNA, charakterizovat konformační změnu FOXO4 při tvorbě komplexu s DNA a zároveň i vliv jednotlivých aminokyselinových zbytků na stabilitu komplexu FOXO4 s DNA. Funkce proteinu FOXO4 je regulována prostřednictvím fosforylace a vazby proteinu 14-3-3, který je svým charakterem regulátorem mnoha buněčných procesů. Detailní mechanismus této regulace je však stále nejasný. Protein 14-3-3 ovlivňuje transkripční faktory FOXO hned dvojím způsobem. Prostřednictvím přímé vazby na transkripční faktor FOXO dochází jednak k inhibici vazby FOXO na DNA a dále je touto interakcí překryta jaderná lokalizační sekvence (NLS), což brání transportu FOXO proteinů do jádra. Ke studiu interakce těchto dvou vazebných partnerů bylo použito rovněž metod fluorescenční spektroskopie. Pomocí časově rozlišené fluorescence přirozených či introdukovaných fluorescenčních sond bylo prokázáno, že při navázání proteinu 14-3-3 dochází k ovlivnění několika částí DNA vazebného rozhraní FOXO4. Získané výsledky poukazují na to, že změny ve studovaných oblastech se dějí na základě přímého kontaktu struktur těchto dvou vazebných partnerů. Pro efektivní popis sledovaných změn jsme navrhli realistický strukturní model komplexu FOXO4:14-3-3 na základě šesti intermolekulárních vzdáleností získaných pomocí Försterova rezonančního přenosu energie. Tento model jasně ukazuje, že FOXO4 je umístěn hluboko uvnitř centrálního kanálu dimeru proteinu 14-3-3 a jeho DNA vazebné rozhraní je touto interakcí blokováno.
Abstract v angličtině:
CHARLES UNIVERSITY IN PRAGUE THE FACULTY OF NATURAL SCIENCE Department of Physical and Macromolecular Chemistry The summary of the doctoral thesis Study of interactions of forkhead transcription factor FOXO4 with DNA and the 14-3-3 protein RNDr. Petr Vácha Scientific supervisor: Prof. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. Prague 2015 Abstract This doctoral thesis deals with the interaction of human forkhead transcription factor FOXO4 with DNA and regulating 14-3-3 protein respectively. The main aim of this work was detailed characterization of interaction between DNA binding domain of protein FOXO4 with two canonical DNA sequences and further clarifying the role of the 14-3-3 protein in the regulation of activity of protein FOXO4. FOXO transcription factors are potent activators of the transcription of genes, which affect a variety of cellular processes. FOXO4 protein belongs to the family of forkhead transcription factor, which is a group of several tens of proteins, whose common feature is a highly conserved DNA- binding domain. Summary of the DNA binding specificity of these proteins, namely what precisely determines the small differences in the binding properties of individual forkhead proteins, despite the large amount of available structural data remains still unclear. Therefore, detailed characterization of interactions between DNA binding domain of the protein FOXO4 and DNA using surface plasmon resonance (SPR) and time-resolved fluorescence spectroscopy was performed. The results of this study allowed to clarify the kinetic model of FOXO4 binding to DNA as well as characterize both the conformational change of FOXO4 upon its binding to the target DNA and the importance of particular amino acid residues on the stability of the complex between FOXO4 and DNA. The transcriptional function of FOXO4 is regulated by phosphorylation and binding of the 14-3-3 protein, which is by its nature regulator of many cellular processes. The mechanism of this regulation is still unclear. The 14-3-3 protein affects FOXO transcription factors in two ways. The complex formation inhibits FOXO4 binding to the target DNA and masks nuclear localization sequence (NLS), which consequently blocks the transport of FOXO proteins into the nucleus. Methods of fluorescence spectroscopy were used to study the interaction of these two binding partners. Time-resolved fluorescence of intrinsic as well as extrinsic fluorophores was used to show that the binding of the 14-3-3 protein affects multiple regions of the DNA binding interface of FOXO4. The results suggest that observed changes are induced by direct protein-protein interactions of these two binding partners. In addition, to better describe the interaction between these two proteins, a realistic structural model of the FOXO4:14-3-3 complex was constructed using six intermolecular distances obtained from Förster resonance energy transfer measurements. This model shows clearly that FOXO4 is located deep inside the central channel of the dimer of the 14-3-3 protein and its DNA binding interface is blocked by this interaction.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Petr Vácha 13.23 MB
Stáhnout Příloha k práci RNDr. Petr Vácha 808 kB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Petr Vácha 164 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Petr Vácha 162 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce RNDr. Petr Vácha 1.28 MB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jiří Pavlíček, Ph.D. 92 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jan Krůšek, CSc. 153 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 761 kB