velikost textu

Identification and characterization of transcription facotrs affecting late stages of male gametophyte development in Arabidopsis thaliana

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Identification and characterization of transcription facotrs affecting late stages of male gametophyte development in Arabidopsis thaliana
Název v češtině:
Identifikace a charakterizace transkripčních faktorů účastnících se regulace pozdních stádií vývoje samčího gametofytu Arabidopsis thaliana
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Nikoleta Dupľáková, Ph.D.
Školitel:
RNDr. David Honys, Ph.D.
Oponenti:
doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.
prof. RNDr Jiří Fajkus, CSc
Id práce:
83196
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra experimentální biologie rostlin (31-130)
Program studia:
Anatomie a fyziologie rostlin (P1524)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
1. 9. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Záver Moja dizertačná práca bola venovaná zvýšeniu poznatkov o fungovaní komplexnej regulačnej siete transkripčných faktorov v samčom gametofyte Arabidopsis thaliana. Transkripčné faktory sú riadiacou jednotkou mnohých významných zmien nielen v rastlinnom organizme a sú zodpovedné za ich správny časový a priestorový priebeh. Ich odhalenie vrátane ich podrobnej funkčnej charakterizácie je dôležitou súčasťou nášho poznania. Okrem vyššie spomenutej snahy, ďalšou úlohou dizertačnej práce bolo vytvorenie inovatívneho konceptu prezentácie a hodnotenia dostupných expresných dát pochádzajúcich z DNA microarray čipov a prevedenie tohto prístupu do praxe vo forme on-line databázy a hodnotiacich nástrojov pre tieto expresné dáta. Výsledky mojej dizertačnej práce je možné zhrnúť do následujúcich bodov: 1. Bola vytvorená on-line sprístupnená databáza nazvaná Arabidopsis Gene Family Profiler (arabidopsisGFP, http://agfp.ueb.cas.cz/). Táto databáza vznikla za účelom poskytnutia nového nástroja pre prezentáciu transkriptomických dát, ktorý umožní užívateľovi rýchly a intuitívny spôsob ich zobrazenia pomocou virtuálnej rastliny. Virtuálna rastlina využíva inovatívny koncept "od jednoduchému k zložitému", ale zároveň ponúka užívateľovi aj tradičné možnosti zobrazenia expresných dát. Naša databáza može slúžiť ako referenčná príručka expresie jednotlivých génov a génových rodín v rastline Arabidopsis thaliana za fyziologických podmienok v rôznych časových obdobiach života rastliny a s ohľadom na jej orgány, pletivá či jednotlivé bunky. 2. Ďalším výstupom mojej dizertačnej práce bola analýza siete neskorých transkripčných faktorov regulujúcich správny vývin samčieho gametofytu po druhej peľovej mitóze (PMII). In-silico identifikácia a výber týchto transkripčných faktorov bol zavŕšený genotypovým a fenotypovým hodnotením zrelých peľových zŕn jednotlivých T-DNA inzerčných línií s vyradenou funkciou rozličných transkripčných faktorov. Celkovo som analyzovala 37 T-DNA línií, ktoré prezentovali 21 neskorých transkripčných faktorov a zastupovali rôzne génové rodiny (C2H2 zinc finger, bZIP proteínová rodina, MADS-box proteínová rodina a ďalšie). Našla som a popísala niekoľko transkripčných faktorov, ktorých inzerčná mutácia spôsobila výrazné zmeny na vzhľade peľového zrna (napr. mŕtve peľové zrná, zvýšený počet peľových zŕn s dvoma alebo jedným jadrom a ďalšie 40 typy odchýlok). K potencionálnym kandidátom pre nájdenie ďalších peľovo špecifických regulátorov vývinu v rôznych metabolických či signálnych cestách patria At2g40620 gén (bZIP proteín), At3g10470 gén (C2H2 zinc finger proteín), At3g57390 gén (MADS-box proteín), At4g05330 gén (C2H2 zinc finger proteín), At5g54680 gén (bHLH proteín) alebo At1g35490 gén (bZIP proteín). 3. Ďalším výstupom vo forme článku, ktorý prezentujem v tejto dizertačnej práci je funkčná charakterizácia atbZIP34 mutanta. Na tejto práci som sa podieľala fenotypovou analýzou zrelých peľových zŕn a jej vyhodnotením. atbZIP34 mutant bol odhalený v priebehu výskumu siete transkripčných faktorov v samčom gametofyte Arabidopsis thaliana. Jeho zrelé peľové zrná vykazujú celý rad odchýlok pozorovaných na úrovni fluorescenčnej a elektrónovej mikroskopie, napríklad defekty v tvare a forme exiny či redukovaný endomembránový systém. Na základe dostupných výsledkov mojej kolegyne Antónie Gibalovej, prvej autorky príslušnej publikácie a ďalších členov autorského kolektívu je predpokladaná úlohu AtbZIP34 faktora v správnom formovaní exiny a jeho zapojenie v regulácii lipidového metabolizmu a/alebo bunkového transportu. Ďalšia analýza transkripčného faktora AtbZIP34 je predmetom dizertačnej práce Antónie Gibalovej. 4. Moja predchádzajúca analýza transkripčných faktorov (viď odstavec 2) odhalila zaujímavú T-DNA líniu, ktorá vykazovala vyšší podiel mŕtvych peľových zŕn a ďalších odchýlok vo fenotype zrelých peľových zŕn v porovnaní s divokými rastlinami Arabidopsis thaliana. Jednalo sa o líniu SAIL_1168_C11, ktorá obsahuje inzerciu v géne At1g70790. Moju pôvodnú predstavu, že ide o transkripčný faktor C2H2 potvrdenú dostupnými databázami transkripčných faktorov som následnými in-silico analýzami nepotvrdila. Pomocou bioinformatických nástrojov som v tomto géne odhalila len C2 doménu, čo aspoň zatiaľ jednoznačne vylučuje jeho funkciu ako transkripčnej regulačnej jednotky. Moje ďalšie testy, ktoré už nie sú predmetom predloženej dizertačnej práce budú zamerané na definitívne vylúčenie alebo nájdenie novej DNA väzbovej domény. Výstupom tejto časti dizertačnej práce je funkčná charakterizácia At1g70790 génu, ktorý sme vzhľadom na zvýšený počet mŕtvych peľových zŕn nazvali DEPOLL (DEath POLLen grains) gén. Výsledkom môjho skúmania bolo zistenie, že bielkovinový produkt DEPOLL génu je zodpovedný za správne utváranie intiny a/alebo funkčného prepojenia plazmatickej membrány a steny peľového zrna. Následná analýza expresných dát depoll peľových zŕn pochádzajúcich z DNA čipu odhalila niekoľko skupín génov s potvrdeným alebo predpokladaným vzťahom k metabolizmu steny peľového zrna (lipid transferové proteíny, polygalakturonázy, invertázy/pektín metylesterázové inhibičné proteíny, xyloglukán endotransglukozylázy/hydrolázy). Výskum týchto génov predstavuje ďalší potenciál pre nájdenie špecifických komponentov nevyhnutných pre správne utváranie intiny peľového zrna vrátane jeho funkčného prepojenia s plazmatickou membránou. V neposlednom rade bude mojou ďalšou úlohou zistenie zapojenia a funkcie DEPOLL proteínu s C2 doménou v konkrétnych metabolických a/alebo signálnych cestách.
Abstract v angličtině:
Conclusions My thesis was devoted to the investigation of a complex regulatory network of transcription factors in the Arabidopsis thaliana male gametophyte. In addition to the abovementioned objective, the second aim of the thesis was the creation of a web-based transcriptome database and data mining tool characterized by an innovative concept of presentation and evaluation of the data from DNA chips. The results of my thesis can be summarized as follows: 1. We created a database called Arabidopsis Gene Family Profiler (arabidopsisGFP) (http://agfp.ueb.cas.cz/) which was made available on-line. This database was developed in order to provide a new tool for presentation of gene expression data (transcriptome), allowing the user to display the data in a quick and intuitive way using the innovative and when launched also unique concept of a virtual plant. The database employs a progressive idea "from simple to complex“, but also provides the user with more traditional data presenting options. The aGFP database can serve as a reference manual for the expression of individual genes and gene families in Arabidopsis thaliana under physiological conditions at different phases of the life cycle and in individual organs and tissues or cell types. 2. A chapter reviewing available servers for deposition of the transcriptome data and on-line tools for their analysis is a part of the submitted PhD thesis. Substantial part of the text deals with the expression data originating from plants, primarily from Arabidopsis thaliana. Our review is intended to help the user to gain quick overview of the available tools and databases and to summarize the potential and advantages as well as disadvantages of their use. By this approach, we wish to make easier access for a common user to the complex transcripromic datasets in user friendly environment. The next result of my PhD thesis is the analysis of the regulatory network of late transcription factors which regulate development of the male gametophyte after the second pollen mitosis (PM II). In-silico identification and selection of the transcription factors was followed by genotypic and phenotypic evaluation of mature pollen grains from individual T-DNA lines with knock-out function of several transcription factors. The total number 37 of the analyzed T-DNA lines is 37. They represent 21 early transcription factors from several gene families (C2H2 zinc finger, bZIP, MADS-box protein family, etc.). I have found and described several transcription factors in which the insertion mutation seriously affected the development and/or structure of the pollen grain (e.g. aborted pollen grains, changes in position and spatial arrangement of the male germ unit (MGU), increased number of pollen grains with one or two nuclei). The following genes from various metabolic and signaling pathways have been identified as potential candidates for pollen-specific developmental regulators: At2g40620 (bZIP protein), At3g10470 (C2H2 zinc finger protein), At3g57390 (MADS-box protein), At4g05330 (C2H2 zinc finger protein), At5g54680 (bHLH protein) and At1g35490 (bZIP protein). 3. The next result presented in the PhD thesis is a published paper on functional characterization of the atbZIP34 mutant. My contribution to the project consisted in the phenotypic analysis of the mature pollen grains and subsequent evaluation of the analysis. atbZIP34 mutant was discovered during analysis of the transcription factors network in the male gametophyte of Arabidopsis thaliana. Its mature pollen grains showed number of abnormalities observed in both fluorescence and electron microscopy, for example, defects in the shape and form of exine or reduced endomembrane system. Based on further results of my colleague, Ms Antonia Gibalova, the first author of the respective publication, and on results of other co-authors , the proposed role of the AtbZIP34 factor is in the regulation of exine formation and its involvement in the regulation of the lipid metabolism and/or subcellular transport. Further analysis of the AtbZIP34 transcription factor is the aim of the PhD thesis of Ms Antonia Gibalova. 4. My previous analysis of the transcription factors (see paragraph 3) discovered the interesting T-DNA line which showed high ratio of dead pollen grains and other phenotypic abnormalities when compared to the wild type pollen of Arabidopsis thaliana. The identified line was SAIL_1168_C11 which carries insertion in the At1g70790 gene. My initial idea that it was a C2H2 transcription factor, confirmed by available transcription factor databases, was not later confirmed by further in-silico analysis. With the help of bioinformatic tools I only discovered the C2 domain, which currently rules out the possibility that the gene functions as a transcription regulatory unit. My next experiments which are not the subject of this submitted PhD thesis will be focused on disproving the presence or finding a new DNA binding domain. The result of this part of 38 the PhD thesis is functional characterization of the At1g70790 gene which we call, based on the increased number of dead pollen grains, DEPOLL (DEath POLLen grains). The result of my research is a finding that the protein product of the DEPOLL gene is responsible for proper formation of the intine and/or functional coupling of the plasma membrane and the pollen grain wall. The consequent analysis of the expression data from the depoll pollen grains on the Affymetrix ATH1 array revealed several groups of genes with confirmed or expected relationship to the metabolism of the pollen grain wall (lipid transfer protein (LTP), polygalacturonase, invertase/pectin methylesterase inhibitor proteins, xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase gene family). Examination of these genes represents further potential for the discovery of specific components which are essential for proper formation of the pollen grain intine including its functional coupling with the plasma membrane. Last but not least, my next step will be uncovering of the specific function of the DEPOLL protein which, with high probability, functions as a transcription inhibitor of many genes which are related to the formation of the pollen grain wall and its involvement in specific metabolic and/or signaling pathways.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Nikoleta Dupľáková, Ph.D. 7.82 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Nikoleta Dupľáková, Ph.D. 86 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Nikoleta Dupľáková, Ph.D. 33 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. David Honys, Ph.D. 1.4 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc. 95 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr Jiří Fajkus, CSc 80 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Jana Albrechtová, Ph.D. 1.05 MB