velikost textu

Variabilita exprese a umlčování transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Variabilita exprese a umlčování transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2
Název v angličtině:
Variability and silencing of transgene expression in potato plants and in tobacco cell line BY-2
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Eva Nocarová, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Lukáš Fischer, Ph.D.
Oponenti:
Mgr. Tomáš Moravec, Ph.D.
RNDr. Aleš Kovařík, CSc.
Id práce:
83181
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra experimentální biologie rostlin (31-130)
Program studia:
Biologie (P1501)
Obor studia:
Anatomie a fyziologie rostlin (XFYZR)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
10. 9. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Závěry U suspenzních kultur buněčné linie tabáku BY-2 odvozených z kalusů po transformaci bylo po transformaci téměř 90 % linií tvořeno buňkami s různou mírou fluorescence GFP. Nově zavedená metoda klonování umožnila získání téměř poloviny klonů s homogenní expresí GFP z primárně heterogenních linií BY-2. Heterogenita exprese GFP u transgenních linií BY-2 měla původ jednak genetický (primární linie obsahovaly buňky s různými inzercemi T-DNA) a jednak epigenetický. Epigenetická heterogenita linií BY-2 souvisela s umlčováním transgenů, tvorbou stabilních epigenetických stavů brzy po transformaci a „permanentní heterogenitou“ projevující se kolísavými změnami v expresi GFP. Snížení nebo umlčení exprese transgenů u bramboru bylo pozorováno přednostně u linií s vyšším počtem insercí T-DNA a s vyšší počáteční expresí GFP. Umlčení vždy postupně postihlo oba vnesené geny, přičemž vymizení exprese GFP předcházelo (v řádu měsíců) ve všech sledovaných případech ztrátě rezistence ke kanamycinu (umlčení genu NPTII), což naznačuje vzájemné propojení mezi umlčováním obou transgenů. Stejná posloupnost v umlčení obou transgenů byla také pozorována u umlčených linií po obnovení exprese transgenů 5-azacytidinem, který způsobuje demetylaci DNA. Byl navržen možný mechanismus postupného umlčování transgenů v rámci celých rostlin zahrnující čtyři následné kroky: 1) posttranskripční umlčení exprese (PTGS) genu pro GFP vyvolané zřejmě náhodně v jedné či více buňkách rostliny; 2) rozšíření po celé rostlině prostřednictvím siRNA; 3) přechod PTGS na transkripční umlčování GFP prostřednictvím metylace promotoru; 4) rozšíření metylace na sousední sekvenci NPTII. Analýza inhibičního efektu 5-azacytidinu na vrcholové segmenty rostlin bramboru umožnila stanovení poločasu rozpadu 5-azacytidinu v kultivačním médiu na přibližně dva dny. U obou rostlinných materiálů došlo k účinnému obnovení exprese transgenů 5-azacytidinem pouze při aplikaci k intenzivně se dělícím buňkám. Kombinací přechodného ošetření listových segmentů bramboru 10μM 5-azacytidinem a de novo regenerací na selekčním médiu s kanamycinem byla optimalizována metoda získávání rostlin bramboru s přechodně nebo stabilně obnovenou expresí dříve umlčených transgenů.
Abstract v angličtině:
Conclusions In suspension cultures of tobacco BY-2 cell line derived from calli after transformation about 90 % of lines contained cells with various GFP fluorescence level after transformation. Newly introduced cloning method allowed obtaining nearly 50 % of clones with homogeneous GFP expression from primarily heterogeneous BY-2 lines. Heterogeneity of GFP expression in transgenic BY-2 lines had two causes - genetic (primary lines contained cells with different T-DNA insertions) and epigenetic one. Epigenetic heterogeneity of BY-2 lines was connected with transgene silencing, formation of stable epigenetic states early after transformation, and “permanent heterogeneity” with fluctuating levels in GFP expression. Reduction or silencing of transgene expression in potato was predominantly observed in lines with higher number of T-DNA insertions and with higher initial GFP expression. Silencing in potato always gradually affected both introduced genes. Silencing of GFP expression preceded (in months) loss of resistance to kanamycin (silencing of NPTII gene) in all monitored cases that indicates interconnections between silencing of both transgenes. The same sequence of silencing of both transgenes in potato was also observed in silenced lines after reactivation of transgene expression by 5-azacytidine, which induce DNA demethylation. Hypothetical four-steps mechanism for the gradual silencing of transgenes on the whole plant level was suggested: 1) posttranscriptional gene silencing (PTGS) of the GFP gene probably occurring accidentally in one or more cells of the plant; 2) spreading throughout the plant through siRNAs; 3) switch from PTGS to transcriptional silencing (TGS) through promoter methylation; 4) spreading of methylation into neighboring sequence NPTII. Analysis of 5-azacytidine inhibition effects on apical cuttings of potato plants allowed estimating 5- azacytidine half-life in cultivation medium to approximately two days. In both plant materials there has been an effective reactivation of transgene expression only after application of 5-azacytidine to intensively dividing cells. Combination of transient treatment of potato leave segments with 10 M 5-azacytidine and de novo regeneration on selection media with kanamycin was optimized to
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Eva Nocarová, Ph.D. 633 kB
Stáhnout Příloha k práci RNDr. Eva Nocarová, Ph.D. 4.83 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Eva Nocarová, Ph.D. 64 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Eva Nocarová, Ph.D. 42 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Lukáš Fischer, Ph.D. 1.6 MB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Tomáš Moravec, Ph.D. 109 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Aleš Kovařík, CSc. 140 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Fatima Cvrčková, Dr. 1.08 MB