velikost textu

Functional studies of selected members of the Arabidopsis formin family

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Functional studies of selected members of the Arabidopsis formin family
Název v češtině:
Funkční studie vybraných zástupců forminové rodiny u Arabidopsis
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Denisa Oulehlová, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Fatima Cvrčková, Dr.
Oponenti:
doc. RNDr. Pavla Binarová, CSc.
doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D.
Konzultant:
doc. RNDr. Viktor Žárský, CSc.
Id práce:
83180
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra experimentální biologie rostlin (31-130)
Program studia:
Biologie (P1501)
Obor studia:
Anatomie a fyziologie rostlin (XFYZR)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
8. 9. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Souhrn Forminy jsou multidoménové proteiny obsahující konzervovanou FH2 doménu (forminhomology 2 domain), která je schopna katalyzovat nukleaci aktinových filament de novo. Funkce forminu, stejne jako jejich regulace, byly podrobne studovány predevším u kvasinek a živocichu, zatímco mnohem méne je známo o rostlinných forminech, které se od kvasinkových i živocišných zástupcu znacne liší v doménovém usporádání. Forminy vyšších rostlin se delí do dvou skupin, trídy I a trídy II a experimentální údaje jsou doposud k dispozici pouze pro první skupinu. V této dizertaci predkládám výsledky z experimentální studie nekolika zástupcu velké rodiny forminu u Arabidopsis, vcetne charakterizace forminu AtFH16 z trídy II. Genom Arabidopsis obsahuje 21 genu kódujících forminy, a prestože se hladina a rozložení jejich exprese znacne liší, všechny jsou transkripcne aktivní. V celkem 14-ti forminových genech jsme získali 17 homozygotních mutantu s T-DNA inzercí. Za standartních kultivacních podmínek jsme nenašli zjevné odlišnosti ve fenotypech mutantu v porovnání s kontrolami. Abychom vyradili z funkce dva dominantní pylové forminy, pripravili jsme dvojitého mutanta atfh3atfh5, avšak i v tomto prípade se vývoj mikrospor a následné klícení a rust pylových lácek nezmenily. Stejne tak nedošlo k narušení polarizovaného rustu pylových lácek u tabáku pusobením antisense oligonukleotidu (ODNs), které byly smerovány na forminy trídy I. Mimo to jsem provedla klonování cDNA genu AtFH3 a upravila jsem jeho stávající predikce (Cvrcková et al., 2004). Abychom mohli studovat lokalizaci pylove specifického AtFH3, dalších forminu a regulátoru bunecné polarity in situ, pripravili jsme a následne testovali sadu krysích polyklonálních protilátek proti syntetickým oligopeptidum konjugovaným s KLH. Nicméne vetšina protilátek rozeznávala u Arabidopsis a tabáku tentýž antigen, který jsme pojmenovali KRAP (KLH-related antigen of plants), a který jsme charakterizovali co do velikosti a bunecné lokalizace. Také jsme zkoumali možné príciny, jež zpusobily nezdar vetšiny imunizací (Oulehlová et al., 2009). Podrobneji jsme charkterizovali formin AtFH16 z trídy II, který má neobvyklé doménové usporádání. Za urcitých pomínek (na tvrdém nakloneném agaru nebo v permanentní tme) se fenotyp mutanta atfh16 odlišoval od kontrol; predevším došlo ke zkrácení a zvlnení etiolovaných hypokotylu, což se ješte zvýraznilo po pusobení cytoskeletálních drog. Tyto výsledky naznacují, že v semenáccích Arabidopsis se AtFH16 nejspíše podílí na bunecné expanzi. Krome toho jsem naklonovala kompletní cDNA genu AtFH16. In vivo jsme pozorovali a následne popsali bunecnou lokalizaci variant odvozených z AtFH16. Z kolokalizacní studie vyšlo najevo, že AtFH16 muže asociovat s vláknitými cytoskeletálními strukturami; v nekterých prípadech znací stabilizované aktinové svazky prostrednictvím svého N-konce, avšak predevším AtFH16 dekoruje mikrotubuly. Dále jsme zjistili, že k lokalizaci na mikrotubuly je nezbytná prítomnost konzervované domény FH2. Naše výsledky naznacují, že forminy trídy I nemusí být nezbytné pro vývoj mikrospor a pro polarizovanáý rust pylových lácek. Dále, formin AtFH16 z trídy II je schopný asociovat s mikrotubuly a mohl by potenciálne propojovat cytoskeletální struktury.
Abstract v angličtině:
Summary Formins are multidomain proteins containing a conserved formin-homology 2 (FH2) domain, which catalyzes de novo nucleation of actin filaments. In yeast and animal cells, both mechanisms and regulation of formin function have been extensively studied, yet much less is known about action of plant formins, which considerably differ from yeast and animal ones in the domain composition. In higher plants, formins are classified into two groups, Class I and Class II, and so far, experimental data are available only for the first group members. Here I present results of experimental study of several members of the large formin family in Arabidopsis, including the characterization of a Class II formin AtFH16. Arabidopsis genome contains 21 formin-encoding genes, and though they greatly differ in their expression levels and pattern, all of them are transcriptionally active. We selected 17 homozygous T-DNA insertional mutants in 14 formin genes. Under standard cultivation conditions, no obvious phenotypic discrepancies between wild type and mutant plants were found. To impair two dominant pollen formins, an atfh3atfh5 double-mutant was prepared and even in this case, both microspore development and pollen tube growth remained unaffected. Consistently, polarized growth of tobacco pollen tubes was not altered after the targeting of Class I formins by antisense oligonucleotides (ODNs). I also cloned cDNA of AtFH3 and revised existing gene predictions (Cvrcková et al., 2004). To study in situ localization of pollen-specific AtFH3 together with other formins and cell polarity regulators, a set of rat polyclonal antibodies against synthetic KLH-conjugated oligopeptides was prepared and tested. However, most rat antisera recognized the same background KLH-related plant antigen (KRAP) in Arabidopsis and tobacco. We characterized KRAP with respect to size and cellular localization and examined possible antigen-specific reasons for the failure of most immunizations (Oulehlová et al., 2009). A Class II formin AtFH16 with an unusual domain composition was closely characterized. Under specific conditions (hard tilted agar or continuous darkness), an atfh16 null mutant exhibited moderate phenotypical changes, especially shortening and waving of etiolated hypocotyls that was further emphasized after treatments with cytoskeletal drugs. Our results indicate involvement of AtFH16 in some aspects of cell expansion in Arabidopsis seedlings. Furthermore, we cloned full-lenght cDNA of AtFH16 and characterized subcellular localization of AtFH16-derived variants in vivo. Co-localization studies revealed that AtFH16 can associate with filamentous cytoskeletar structures; in some cases, it labels stabilized actin cables via its N-terminal part, but mostly, AtFH16 decorates microtubules. We identified that a presence of the conserved FH2 domain is required for AtFH16 localization on microtubules. Our results suggest that Arabidopsis Class I formins might not be essential for microspore development and for subsequent polarized growth of pollen tubes. Further, Class II formin AtFH16 is capable of microtubule association and could be a potential cytoskeletar crosslinker
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Denisa Oulehlová, Ph.D. 12.44 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Denisa Oulehlová, Ph.D. 2.1 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Denisa Oulehlová, Ph.D. 54 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Denisa Oulehlová, Ph.D. 40 kB
Stáhnout Posudek vedoucího doc. RNDr. Fatima Cvrčková, Dr. 901 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Pavla Binarová, CSc. 85 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D. 127 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Jana Albrechtová, Ph.D. 1.11 MB