velikost textu

The study of fluids and secretions from reproductive tracts of pig (Sus scrofa f. domestica) and cattle (Bos primigenius f. taurus)

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
The study of fluids and secretions from reproductive tracts of pig (Sus scrofa f. domestica) and cattle (Bos primigenius f. taurus)
Název v češtině:
Studie tekutin a sekretů z reprodukčních traktů prasete (Sus scrofa f. domestica) a skotu (Bos primigenius f. taurus)
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Tomáš Dráb, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Jiří Liberda, Ph.D.
Oponenti:
doc. RNDr. Věra Jonáková, DrSc.
prof. MUDr. Zdeňka Ulčová-Gallová, DrSc.
Id práce:
83147
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
17. 6. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
reprodukce, fertilisace, proteiny povrchu spermie, zona pellucida, spermadhesiny, protein-sacharidové rozpoznávání, oviduktální proteiny
Klíčová slova v angličtině:
reproduction, fertilisation, sperm protein, zona pellucida, spermadhesin, protein saccharide recognition, oviduct proteins,
Abstrakt:
Abstrakt Protein-sacharidové interakce hrají významnou roli v reprodukci savců, jsou podstatou takových dějů, jako je maturace a vzájemné rozpoznání gamet nebo formování oviduktálního rezervoáru spermií. V mé dizertační práci jsem se zabýval aktivitami glykosidas v folikulární tekutině krávy a prasnice jejich změnami spojenými se zráním folikulu. Detekoval jsem aktivity pěti různých glykosidas v terciálním a preovulačním folikulu u obou druhů. Nejaktivnějšími enzymy byly α-L-fukosidasa v kravské folikulární tekutině a α-D-manosidasa v prasečí. Zároveň aktivita obou těchto enzymů vykazovala největší nárůst během zrání folikulu. Je zajímavé, že právě α-L-fukosa v případě krávy a α- D-manosa v případě prasnice jsou sacharidy, které se důležité pro vznik oviduktálního rezervoáru spermií a aktivita výše zmíněných enzymů se tak nabízí jako hypotetický mechanismus synchronizace uvolňování spermií z jejich oviduktálního rezervoáru s dobou ovulace. Dále jsem ukázal, že aktivita β- D-galaktosidasy a α-D-manosidasy ovlivňují interakci mezi receptory spermií pro zonu pellucida a zonou pellucidou, což může vysvětlit, jak změny zony pellucida spojené s její maturací mohou vést ke snížení polyspermického oplodnění. Abych lépe charakterizoval studované glykosidasy, vyvinul jsem červenou nativní elektroforézu – což je nová eletroforetická metoda vhodná k separaci enzymů podle jejich molekulové hmotnosti a následné vizualizace jejich aktivity přímo v gelu. Červená nativní elektroforesa odhalila přítomnost několika isoforem studovaných glykosidas, z nichž některé se zdají být folikulárního původu. V další části své dizertační práce jsem analyzoval antimikrobiální vlastnosti folikulární, oviduktální a děložní tekutiny a ukázal, že oviduktální tekutina je nejsilnějším inhibitorem růstu E. coli. Při pokusu o identifikaci látek zodpovědných za pozorované antimikrobiální vlastnosti, jsem nejprve zúžil pátrací pole na rozsah molekulových hmotností 3 500 -30 000 a předběžně identifikoval histony H2A typ 2-C, H2B typ 1-K, H3.3 a H4 jako proteiny zodpovědné za antimikrobiální aktivitu tekutin reprodukčního traktu krávy. Jejich roli jsem následní potvrdil inhibicí jejich antimikrobiální aktivity přidání protilátek proti histonům. V poslední části svojí dizertační práce jsem se zabýval sekrety Cowperových žláz u býka i kance. U býka jsem studoval jejich roli v rámci ejakulátu a ukázal jsem, že tyto sekrety výrazně přispívají ke zvýšení jeho viskozity, zpomalují uvolňování spermií z ejakulátu a zesilují vazbu proteinů se semenných váčků na povrch spermií. Všechna tato pozorování mohou být vysvětlena tím, že sekrety býčích Cowperových žláz také výrazně zvyšují agregační stav semenných proteinů. U kance, sekrety Cowperových žláz tvoří kopulační zátku v děložníh hrdle prasnice na konci páření, která zabraňuje výtoku semene a také slouží k zajištění otcovství. My jsme však ukázali, že děložní tekutina prasnice v estrální fázi reprodukčního cyklu je schopna tuto zátku rychle proteolyticky degradovat na rozdíl od děložní tekutiny z prasnice v diestální fázi cyklu. Také jsme detekovali několik serinových proteas a metaloproteas v děložní tekutině, které mohou být zodpovědné za degradaci kopulační zátky. Navíc v průběhu této studie jsme také vyvinuli novou metodu rozpouštění vysoce glykosylovaných sekretů za nativních podmínek s využitím pufrovaných roztoků kyseliny borité.
Abstract v angličtině:
Abstract Interactions between proteins and saccharide moieties play an indispensable role in mammalian reproduction as they stand behind of such processes as maturation and mutual recognition of gametes and sperm oviductal reservoir formation. In my dissertation thesis I focused on activities of glycosidases from bovine and porcine follicular fluids and their changes connected with follicle development. Activities of five glycosidases were detected in tertiary and preovulatory follicles in both species. The most active enzymes were α-L-fucosidase in cow and α-D-mannosidase in sow and both enzymes also demonstrated the most pronounced increase in their activities during follicle maturation. Interestingly, both α-L-fucose in cow and α-D-mannose in sow were described as saccharides responsible for the formation of the sperm oviductal reservoir and we offered a hypothetical mechanism of synchronisation between sperm release from their reservoir with the time of ovulation based on a surge of activities of corresponding follicular glycosidases through the oviduct. Subsequently, it was demonstrated that β-D-galactosidase and α-D-mannosidase affect sperm-zona pellucida binding in pig, as they both decrease interaction between sperm receptors for zona pellucida and zona pellucida. This may explain the observation that maturation changes of zona pellucida induced by follicular fluid lead to lower level of polyspermic fertilisation. For the sake of a better characterisation of studied glycosidases, I developed red native electrophoresis - a novel electrophoretic method suitable for enzyme separation according to their molecular weight and subsequent visualisation of their activities directly in gel. Red native electrophoresis revealed several isoenzymes of detected glycosidases, some of which seemed to be of follicular origin. In the next part of my dissertation thesis, I analysed antimicrobial properties of follicular, oviductal and uterine fluids and demonstrated that oviductal fluid is the most potent in inhibiting of the growth of E. coli. In attempt to identify compounds responsible for observed antimicrobial properties, I first narrowed the search into molecular weight range of 3 500 - 30 000 and subsequently identified histones H2A type 2-C, H2B type 1-K, H3.3, and H4 as the putative antimicrobial agents in bovine oviductal fluid. Their role was further strongly confirmed by inhibition of antimicrobial properties of fluids by adding antibodies against histones. And finally, I studied secretions of Cowper’s glands. In bull, I concentrated on its role within ejaculate and demonstrated that it increases semen viscosity, decreases the rate of sperm release from ejaculate and enhances binding of seminal proteins to sperm surface. All these observations can be explained by the fact that bovine Cowper’s gland secretion positively affects aggregation of seminal protein. In boar, Cowper’s gland secretion forms a seminal plug in the cervix of sow after copulation preventing thus a semen back flow and ensuring its paternity. However, we demonstrated that uterine fluid from the sow in the oestrous phase of the reproductive cycle is capable of rapid proteolytic degradation of the plug in contrast with fluid from dioestrous sow. We also detected several serine and metalloproteases present in uterine fluid, which are putative agents responsible for the plug degradation. In the course studies on the porcine seminal plug, we also developed a novel method of dissolving of highly glycosylated mucus matrix under native conditions using a buffered boric acid solution.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Tomáš Dráb, Ph.D. 3.04 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Tomáš Dráb, Ph.D. 45 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Tomáš Dráb, Ph.D. 45 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Tomáš Dráb, Ph.D. 1.25 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Věra Jonáková, DrSc. 145 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. MUDr. Zdeňka Ulčová-Gallová, DrSc. 914 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1020 kB