velikost textu

Enzymy a další molekulární faktory ovlivňující vývoj leishmanií ve flebotomech

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Enzymy a další molekulární faktory ovlivňující vývoj leishmanií ve flebotomech
Název v angličtině:
Enzymes and other factors affectiing leishmania development in sand flies
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Lucie Ječná, Ph.D.
Školitel:
prof. RNDr. Petr Volf, CSc.
Oponenti:
RNDr. Martin Bilej, DrSc.
RNDr. Petr Kopáček, CSc.
Id práce:
83142
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra parazitologie (31-161)
Program studia:
Parazitologie (P1522)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
6. 3. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
ABSTRAKT Tato doktorská práce se zabývá enzymy a dalšími molekulami ovlivňující vývoj leishmanií v jejich přenašečích. Shrnuje výsledky tří publikovaných prací a jedné práce připravované. První část práce je zaměřena na inhibitory cysteinových proteáz leishmanií (ICP), jelikož existuje hypotéza, že ICP Leishmania mexicana chrání parazity před proteolytickými enzymy přenašeče a tím zajišťuje jejich přežití ve vektorovi. K potvrzení této domněnky byl studován vývoj ICP defektních mutantů L. mexicana ve flebotomovi druhu Lutzomyia longipalpis. Výsledky experimentů prokázaly, že ICP L. mexicana nehraje roli při přežívání leishmanií ve hmyzím přenašeči a navíc jsme zjistili, že rekombinantní ICP neinhibuje in vitro proteázovou aktivitu střevního lyzátu L. longipalpis. Dalším cílem bylo studium mechanismu přichycení leishmanií na střevní epitel jejich přenašečů. Laboratorní experimenty ukazují, že flebotomy lze podle náchylnosti vůči leishmaniím rozdělit do dvou skupin na tak zvané specifické a permisivní vektory. U specifických vektorů se na přichycení leishmanií podílí povrchový lipofosfoglykan (LPG) leishmaní. U permisivních vektorů existuje hypotéza, že LPG k přichycení nutný není. Naše experimenty tuto hypotézu potvrdily a prokázaly, že LPG L. major není potřebný pro přežití parazitů v permisivních vektorech Phlebotomus perniciosus a P. argentipes, ale hraje důležitou roli ve specifickém vektorovi P. duboscqi. Pomocí nové in vitro metody, která využívá kompetitivní vazbu fluorescenčně značených leishmanií na mezenteron flebotomů, jsme sledovali jaká morfologická stádia a druhy leishmanií se na střevní epitel flebotomů vážou. Výsledky prokázaly, že vazba leishmanií na střeva se u jednotlivých stádií výrazně liší. Nektomonády a leptomonády se vázaly na střeva ve vysokých počtech, zatímco procykličtí promastigoti a metacyklická stádia vůbec nebo jen ve velmi nízkých počtech. Porovnáním vazeb několika druhů leishmanií jsme prokázali, že parazit přenášený v přírodě daným vektorem nemusí být nutně tím, který se in vitro váže na jeho střeva nejlépe. Je proto zřejmé, že samotná schopnost in vitro vazby leishmanií na střeva nedokáže vysvětlit specifitu či permisivitu flebotomů k přenášeným leishmaniím. Výše zmíněné poznatky jsme dále rozšířili pomocí studie, ve které jsme porovnávali výsledky experimentálních infekcí flebotomů a in vitro vazebných pokusů se značenými leishmaniemi. Ke studiu jsme použili mutantní linie leishmanií, které byly defektní v povrchových GPI-vázaných molekulách, konkrétně LPG a gp63. Naše výsledky prokázaly důležitost GPI-kotvených proteinů (gp63) při vazbě leishmanií na střevo flebotoma a potvrdily LPG nezávislou teorii přichycení L. major na střeva permisivního vektora P. perniciosus. Naopak jsme ukázali zásadní roli LPG při přichycení L. major na střeva specifického vektora P. papatasi. Role LPG L. infantum při přichycení na střeva P. perniciosus zůstává sporná, neboť LPG mutant L. infantum se v tomto vektorovi nevyvíjel. 5
Abstract v angličtině:
ABSTRACT This Ph.D. thesis focuses on enzymes and other molecules that affect leishmania development in their vectors. It summarizes results of three published project and one publication in preparation. It has been proposed that cysteine peptidase inhibitor (ICP) of Leishmania mexicana protects this protozoan parasite from insect proteolytic enzymes, and therefore promotes their survival in the sand fly vector. To test this hypothesis, L. mexicana mutants deficient in ICP were evaluated for their ability to develop in the sand fly Lutzomyia longipalpis. The experiments showed that ICP of L. mexicana has no major role in promoting leishmania survival in the vectorial part of its life cycle. In addition, recombinant L. mexicana ICP did not inhibit peptidase activity of L. longipalpis midgut extracts in vitro. Another objective of this thesis was to study the attachment of leishmania to the midgut epithelium of their vectors. Laboratory studies examining the development of different Leishmania species in a range of phlebotomine species suggest that sand flies fall into two groups: specific and permissive vectors. In the specific vectors, successful parasite development is mediated by the parasite surface lipophosphoglycan (LPG), while this LPG is not required for the attachment in permissive vectors. Our experiments confirmed this hypothesis and showed that L. major LPG is not required for the parasite survival in permissive species Phlebotomus perniciosus and P. argentipes, but plays an important role in the specific vector P. duboscqi. Using a novel method of competitive binding of fluorescently labeled leishmania promastigotes to the midguts in vitro, we studied stage- and species-specificity of the binding. Our results showed that leishmania binding is strictly stage-dependent; nectomonads and leptomonads bound, while procyclics and metacyclics did not. Furthermore, we showed, by comparing the binding of several leishmania species, that the natural parasite is not necessarily the species binding most efficiently in vitro to the midgut of its vector. We conclude that, although midgut binding seems to be necessary for the parasite establishment, in several parasite–vector combinations, the ability of the parasite to bind in vitro to sand fly gut is insufficient to explain the vectorial competence and parasite–vector specificity. We also compared the results from experimental infections and in vitro binding assays using leishmania mutated in GPI-anchored surface molecules putatively involved in attachment to sand fly midgut: LPG and gp63. Taken together, our data suggest an important role of GPI-anchored proteins, including gp63, in Leishmania attachment to sand fly midgut. In addition, our data confirmed the presence of an LPG-independent parasite binding mechanism of L. major within the midgut of permissive vector P. perniciosus and provide a strong support for the crucial role of L. major LPG in specific vector P. papatasi. In contrast, the LPG role in permissive vector P. perniciosus was suprisingly disputable as this sand fly showed low susceptibility to L. infantum lpg1- mutants. 4
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Lucie Ječná, Ph.D. 2.59 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Lucie Ječná, Ph.D. 94 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Lucie Ječná, Ph.D. 81 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Martin Bilej, DrSc. 152 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Petr Kopáček, CSc. 131 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 847 kB