velikost textu

Cell signalling and molecular complexes of the TRH receptor

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Cell signalling and molecular complexes of the TRH receptor
Název v češtině:
Buněčná signalizace a molekulární komplexy TRH receptoru
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Zdeňka Drastichová, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Jiří Novotný, DSc.
Oponenti:
MUDr. Zdeněk Hodný, CSc.
RNDr. Jan Říčný, CSc.
Id práce:
82925
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyziologie (31-152)
Program studia:
Fyziologie živočichů (P1521)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
28. 6. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
plazmatická membrána, receptor, G-protein
Klíčová slova v angličtině:
plasma membrane, receptor, G-protein
Abstrakt:
Souhrn První část disertační práce se zabývá identifikací proteinů isolovaných ve frakci obohacené o plasmatické membrány získané z buněčné linie HEK293-E2M11, jejichž hladina byla změněna po dlouhodobém působení thyroliberinu (TRH). Pomocí techniky imunoblotu se specifickými protilátkami proti Na,K-ATPase a vazebných pokusů s [3H]TRH a [35S]GTPγS bylo zjištěno, že frakce obohacená o plasmatické membrány obsahovala v porovnání s postnukleárním supernatantem výrazně vyšší množství Na,K-ATPasy, TRH receptoru and G-proteinů. Pro detekci a identifikaci proteinů ve frakci obohacené o plasmatické membrány, jejichž hladiny byly po dlouhodobém působení TRH (16 h; 10 μM) změněny, byly použity 2D elektroforéza a hmotnostní spektrometrie. Bylo identifikováno 42 proteinů, z nichž pět (mitofilin, MTHSP75, prohibitin, stomatin like-2, peroxiredoxin III) představuje mitochondriální proteiny, které jsou důležité pro zajištění správné struktury a funkce mitochondrií. Hladina těchto proteinů byla zvýšena po dlouhodobém působení TRH, a proto lze usuzovat, že dlouhodobé působení TRH může výrazně ovlivnit mitochondriální membránu a funkci mitochondrií. Druhá část disertační práce se zabývá identifikací molekulárních komplexů TRH receptoru a/nebo Gq/11 proteinu. Pomocí nativní elektroforézy byly identifikovány tři komplexy obsahující TRH receptor a čtyři komplexy obsahující Gq/11α protein. Komplex TRH receptoru detekovaný v oblasti 80 kDa odpovídá dimeru TRH receptoru, což bylo prokázáno pomocí experimentů, při nichž byly proteinové komplexy solubilizovány při různých teplotách. Molekulární komplex detekovaný v oblasti 140 kDa reprezentuje membránově vázaný preasociovaný komplex TRH receptoru a Gq/11 proteinu, což bylo potvrzeno ko-imunoprecipitací a experimenty, při nichž byly využity buněčná linie HEK293- E2 exprimující menší množství G11α proteinu v porovnání s buněčnou linií HEK293-E2M11 a RNA interference, při které byly sníženy hladiny Gβ1 a Gβ2 proteinů. Krátkodobé působení TRH (10–30 min) vedlo k disociaci preasociovaného komplexu TRH receptoru a Gq/11 proteinu a současně ke zvyšování hladiny dimeru TRH receptoru, což mohlo být způsobeno uvolňování dimeru TRH receptoru z preasociovaného komplexu TRH receptoru a Gq/11 proteinu. Po dlouhodobém působení TRH došlo k částečnému opětovnému formování preasociovaného komplexu TRH receptoru a Gq/11 proteinu. Signál Gq/11 proteinu v oblasti 140 kDa detekovaný imunoblotem zřejmě odpovídá nejen preasociovanému komplexu TRH receptoru a Gq/11 proteinu, ale komplexům Gq/11 proteinu s různými receptory spřaženými s Gq/11 proteiny. Membránově vázaný komplex Gq/11 proteinu detekovaný 300 kDa se rozpadal po dlouhodobém působení TRH (4–16 h) podobně jako komplexy Gq/11 proteinu s receptory spřaženými s Gq/11 proteiny, zatímco takové působení vedlo ke tvorbě komplexů Gq/11α proteinu detekované v oblasti 70 kDa v cytosolu. Tyto děje souvisí s down-regulací Gq/11α proteinu a jeho translokací z membránově vázaných do cytosolárních komplexů. 1 Hladiny vysokomolekulárního komplexu TRH receptoru detekovaného v oblasti 500 kDa a komplexu Gq/11α proteinu detekovaného v oblasti 700 kDa byly zvýšeny po krátkodobém působení TRH (10–30 min), což naznačuje, že TRH receptor a Gq/11α protein mohou být přemístěny do těchto komplexů z preformovaného komplexu TRH receptor a Gq/11α proteinu. V případě Gq/11α proteinu byla tato hypotéza podpořena pomocí vazebného pokusu s [35S]GTPγS a autoradiografie. K možným interagujícím partnerům TRH receptoru nebo Gq/11α proteinu v těchto vysokomolekulárních komplexech patří zřejmě GRK2 a fosfolipasa Cβ. Závěrem lze říci, že nativní elektroforéza je vhodnou metodou pro izolaci a zkoumání molekulárních proteinových komplexů. Využitím této metody jsme zjistili, že TRH receptor může tvořit preformovaný komplex s Gq/11 proteinem, a proto ho lze zařadit mezi receptory, které vytváří s příslušnými G-proteiny komplexy i v nestimulovaných buňkách. Stabilita detekovaného preformovaného komplexu TRH receptoru a Gq/11 proteinu stejně jako dalších detekovaných komplexů TRH receptoru nebo Gq/11 proteinu byla výrazně ovlivněna působením thyroliberinem. Tyto výsledky naznačují, že hormonální působení může narušit nebo formovat interakce mezi proteiny a přeuspořádat jednotlivé komponenty v rámci různých proteinových komplexů v plasmatické membráně. 2
Abstract v angličtině:
Summary The first part of this thesis is preoccupied with the identification of protein alterations in the membrane fraction of HEK293-E2M11 cells after prolonged TRH treatment. The isolated membrane fraction enriched in plasma membranes contained markedly increased the amount of Na,K-ATPase, TRH receptor and G-proteins compared to the postnuclear supernatant. By using 2D electrophoresis and mass spectrometry, the levels of 42 proteins were identified to be altered in samples of PM- enriched fractions from TRH-treated (16 h; 10 μM) cells. Out of these proteins only ezrin and stomatin-like 2 are known to be localized in the plasma membrane. Five proteins (mitofilin, MTHSP75, prohibitin, stomatin like-2, peroxiredoxin III) whose levels were increased after the prolonged TRH treatment represent proteins localized in mitochondria. All of them are important for proper structure and function of mitochondria. The ratio of anti-apoptotic Bcl-2 to pro-apoptotic Bax was markedly higher in cells treated with TRH than in control untreated cells. Hence, it can be concluded that prolonged TRH treatment may significantly affect mitochondrial membrane and function of mitochondria. The second part of this thesis deals with the identification of molecular protein complexes of TRH-R and/or Gq/11 protein. The presumed effects of TRH on the stability of these complexes have also been investigated. By native electrophoresis, three complexes of TRH-R and four complexes of Gq/11α protein were identified. The TRH-R complex found in the 80 kDa region corresponds to TRH-R dimer, which was proved by experiments analysing the effect of solubilisation at different temperature. The molecular complex detected in the 140 kDa region represents a pre-associated TRH-R–Gq/11 complex, which was verified by co-immunoprecipitation and experiments on cells with decreased levels of the Gα and Gβ subunits of Gq/11 proteins. Short-term (10–30 min) treatment with TRH led to dissociation of the pre-associated TRH-R–Gq/11 complex with concomitant increase in the level of TRH-R dimer while long-term TRH treatment resulted in partial re-association of TRH-R–Gq/11 complex apparently due to up-regulation of TRH-R. The immunoblot signal of Gq/11 protein in the 140 kDa region apparently corresponds not only to the pre-associated TRH-R–Gq/11 complex but also to molecular complexes of Gq/11 protein with other Gq/11-coupled receptors. The Gq/11 complexes found in the 140 kDa and 300 kDa regions were observed to be membrane-bound while Gq/11α complexes in the 70 kDa region were cytosolic. Prolonged TRH treatment induced dissociation of membrane-bound Gq/11 complexes in the 140 kDa and 300 kDa regions and translocation of Gq/11α from the plasma membrane into the cytosol, which was connected with concomitant formation of cytosolic Gq/11α complexes. The second reason for a decrease in the level of membrane-bound Gq/11 complexes was down-regulation of Gq/11α proteins after prolonged TRH treatment. High-molecular-weight complexes of TRH-R or Gq/11α were observed in the 500 kDa or 700 kDa regions, respectively. The levels of both these complexes were found to increase after short-term TRH treatment suggesting that TRH-R and Gq/11α can be translocated from the pre-associated TRH-R– 1 Gq/11 complex. In case of Gq/11α, this hypothesis was confirmed by [35S]GTPγS binding assay followed by autoradiography. The signal of bound [35S]GTPγS in the 700 kDa Gq/11α complex was markedly enhanced after TRH treatment. GRK2 and PLCβ were assessed as potential components of these high- molecular-weight complexes. Altogether, our present studies have demonstrated that native electrophoresis can serve as a highly suitable method for separation and investigation of molecular complexes. By using this approach, we were able to show that the TRH receptor may form a pre-associated complex with its cognate G-protein and therefore it can be included among other GPCRs that constitute such complexes. The stability of this TRH-R–Gq/11 complex as well as other resolved receptor or Gq/11 protein complexes were markedly influenced by TRH treatment, which indicates that hormones can modulate the interactions between proteins and re-arrange proteins within complexes in the plasma membrane. 2
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Zdeňka Drastichová, Ph.D. 2.97 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Zdeňka Drastichová, Ph.D. 105 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Zdeňka Drastichová, Ph.D. 98 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce RNDr. Zdeňka Drastichová, Ph.D. 840 kB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Zdeněk Hodný, CSc. 206 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jan Říčný, CSc. 198 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 797 kB