velikost textu

Isolation and study of proteins with zona pellucida binding activity

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Isolation and study of proteins with zona pellucida binding activity
Název v češtině:
Izolace a studium proteinů se zona pellucida vazebnou aktivitou
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Ing. Michal Zigo, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.
Oponenti:
doc. RNDr. Helena Ryšlavá, CSc.
RNDr. Jana Antalíková, Ph.D.
Konzultant:
RNDr. Jiří Liberda, Ph.D.
Id práce:
82900
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
25. 11. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
prase, povrchové proteiny spermie, receptory spermie pro vazbu se zona pellucida
Klíčová slova v angličtině:
boar, sperm surface proteins, sperm-zona pellucida binding receptors
Abstrakt:
Abstrakt Vazba spermie na vajíčko je zprostředkována komplementárními molekulami na povrchu obou gamet a zahrnuje interakci proteinových receptorů spermie se sacharidovými strukturami zona pellucida (ZP). Ukázalo se, že do interakce spermie se ZP je zapojeno mnoho proteinových receptorů a potenciální primární receptory spermie pro vazbu na glykoproteiny ZP byly zkoumány u různých savců. Většina proteinů spermie, u kterých byla zjištěna vazebná aktivita se ZP, patří k proteinům plazmatické membrány. Nicméně přesné metody pro izolaci membránových proteinů spermie nejsou doposud standardizovány. Tato práce je zaměřena na využití různých izolačních protokolů, které vedou k získání extraktů odlišného proteinového složení. Dále jsou zahrnuty dva možné přístupy pro odhalení nových potenciálních vazebných receptorů spermií pro primární vazbu se ZP a jejich identifikace. Proteiny z ejakulovaných a in vitro kapacitovaných kančích spermií byly izolovány za použití různých extrakčních postupů: Triton X-100, Triton X-114, kyselina octová, dodecylsulfát sodný (SDS), N-oktyl-β-D-glukopyranosid (OBG), rehydratační pufr (RHB) a nakonec extrakcí pomocí zmrazení a následného tání. Tyto proteinové extrakty byly charakterizovány pomocí 1-D a 2-D proteinových profilů, barvením na glykoproteiny a substrátovými zymografickými metodami. Výsledky ukázaly kvantitativní a kvalitativní rozdíly v 1-D a 2-D proteinových profilech v závislosti na způsobu použitého izolačního postupu. Rozdíly byly také pozorovány mezi proteinovými profily ejakulovaných a kapacitovaných spermií. Zymogramy podpořily předpoklad, že použití různých izolačních protokolů bude mít za následek různé profily enzymaticky aktivních molekul. Pro identifikaci kandidátů pro vazebné receptory se ZP byla použita metoda Far Western blot a připraven panel monoklonálních protilátek. Identifikované proteiny, které vykazovaly vazebnou afinitu se ZP byly tyto – prekurzor akrosinu, lactadherin P47, „angiotensin-converting enzyme” (ACE), „polycystic kidney disease and receptor for egg jelly” (PKDREJ) a RAB-2A. Akrosin a P47 byly již charakterizovány jako receptory vázající ZP, zatímco ACE hraje zprostředkovatelskou roli při vazbě spermie na ZP. Proteiny PKDREJ a RAB-2A byly poprvé identifikovány na povrchu kančích spermií a navíc u RAB-2A byla zároveň poprvé pozorována jeho vazebná afinita k ZP.
Abstract v angličtině:
Abstract Binding of sperm to the oocyte is mediated by complementary molecules on the surface of both gametes and involves the interaction of sperm protein receptors with the zona pellucida (ZP) saccharide structures. It has been shown that many proteins receptors are involved in the sperm-ZP interaction, and potential primary sperm receptors for ZP glycoproteins have been investigated in various mammals. The majority of proteins with identified sperm-ZP binding activity belong to the plasma membrane proteins. However, the exact methods for isolation of sperm membrane proteins are still to be standardized. This study is focused on investigating how employment of various isolation protocols leads to acquisition of various protein mixtures. Further in the work, two possible approaches towards identification of potential ZP-binding partners are implemented, in order to disclose novel primary ZP-binding receptor candidates. Sperm proteins of ejaculated and in vitro capacitated boar sperms were isolated by: Triton X-100, Triton X-114, acetic acid, sodium dodecyl sulphate (SDS), N-octyl-β-D- glucopyranoside (OBG), rehydration buffer (RHB), and finally by freezing-thawing extraction and they were characterized by 1-D, 2-D protein profiles, glycoprotein staining and substrate zymographic methods. The results have shown quantitative and qualitative differences in 1D and 2D protein profiles depending on the isolation protocol. Differences were also observed between protein profiles of both ejaculated and capacitated sperms. Zymograms supported the prediction that various isolation protocols result in various profiles of enzymatically active molecules. For identification of ZP-binding receptor candidates, Far Western blot and a panel of monoclonal antibodies was used. The proteins that expressed ZP-binding affinity were identified to be: acrosin precursor, lactadherin P47, angiotensin converting enzyme (ACE), polycystic kidney disease and receptor for egg jelly (PKDREJ), and RAB-2A. Acrosin and P47 were already proved to be ZP-binding receptors, while ACE plays a mediatory role during the binding of sperm to ZP. Proteins PKDREJ and RAB-2A were for the first time identified on the surface of pig sperm, and additionally the binding affinity to ZP of RAB-2A was observed.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Ing. Michal Zigo, Ph.D. 3.92 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Ing. Michal Zigo, Ph.D. 57 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Ing. Michal Zigo, Ph.D. 53 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Ing. Michal Zigo, Ph.D. 228 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D. 344 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Helena Ryšlavá, CSc. 81 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jana Antalíková, Ph.D. 158 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1002 kB