velikost textu

Teoretická studie enzymů spojených s procesem karcinogeneze: DNA polymerázy β a cytochromů P450

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Teoretická studie enzymů spojených s procesem karcinogeneze: DNA polymerázy β a cytochromů P450
Název v angličtině:
Theoretical study of enzymes related to carcinogenesis: DNA polymerase β and cytochromes P450
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Petr Jeřábek, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Václav Martínek, Ph.D.
Oponenti:
prof. RNDr. Gustav Entlicher, CSc.
prof. doc. RNDr. Mgr. Rüdiger Ettrich, Ph.D.
Konzultant:
doc. Jan Florián, Ph.D.
Id práce:
82846
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
17. 12. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
počítačové modelování; DNA polymerasa beta; cytochromy P450; cytochrom b5; kyselina aristolochová I; LRA, FEP, LIE, docking, molekulová dynamika
Klíčová slova v angličtině:
computer modelling; DNA polymerase betaů cytochromes P450; cytochrome b5; Aristolochic Acid I; LRA, FEP, LIE, docking, molecular dynamics
Abstrakt:
ABSTRACT Disertační práce přispěla k poznání funkce dvou typů enzymů participujících na procesech karcinogeneze, DNA polymerázy ϐ (pol ϐ) a cytochromů P450 (CYP). Pol ϐje součástí opravného systému DNA „Base Excision Repair“ (BER), kde tento enzym provádí vkládání nového nukleotidu do řetězce DNA na základě párování s bází templátového řetězce. Mutované formy pol ϐ byly nalezeny v 30% lidských tumorů, což ukazuje na její důležitou úlohu v procesu karcinogeneze. V disertační práci byly studována schopnost pol ϐ rozlišovat mezi „správnou“ a „špatnou“ bází v průběhu jejího vkládání do DNA, tzv. „fidelitu“ (přesnost přiřazení „správného“ nukleotidu, v duchu pravidel komplementarity). K tomu byly využity metody počítačového modelování, vhodné pro porovnání energetických rozdílů mezi komplexy obsahující „správnou“ a „špatnou“ bází. Použita byla metoda výpočtu volných energií LRA. Výsledky signalizují, že jeden z hlavních příspěvků k celkové „fidelitě“ pol ϐ spočívá v lepší stabilizaci tranzitního stavu nukleofilní substituce „správné“ báze, oproti „špatné“. Tento rozdíl přispívá 80-ti násobkem k celkové „fidelit쓨 tohoto enzymu. Identifikovány byly i strukturní prvky, které jsou důležité pro „fidelitu“ pol ϐ i katalýzu tohoto enzymu. Pro studium sledující vliv mutací na „fidelitu“ pol ϐ byly použity metody FEP a LIE. Výsledky z těchto studií byly korelovány s experimentálními daty pro pol ϐ a šest jejích jednobodových mutantů. Použité metody se však ukázaly jako nevhodné, a proto byly navrženy jejich modifikace, které vedly k návrhu nových metod - FEP/LIE a modifikovaný FEP. „Fidelity“ jednotlivých mutantů, vypočítané těmito metodami, se ve většině případů pohybovaly v rozmezí dané směrodatnou odchylkou od odpovídajících experimentálních hodnot. Uvedené modifikované metody byly rovněž použity pro kvantitativní predikci vlivu nových distálních mutací na „fidelitu“ pol ϐ. CYP patří mezi enzymy skupiny oxidáz se smíšenou funkcí, podílejících se v organismu především na metabolizmu nepolárních xenobiotik, včetně řady chemických karcinogenů. Katalytický efekt CYP může být v případě některých substrátů modifikován působením cytochromu b5 (cyt b5), jehož jedním z úkolů je přenos elektronu potřebného pro aktivaci molekulárního kyslíku. Pro lepší pochopení způsobu, jakým CYP interaguje s cyt b5 byly použity metody molekulového modelování, flexibilní protein-proteinový „docking“. Biologická relevance modelovaných komplexů byla dále ověřena sledováním jejich stability za použití metody klasické molekulové dynamiky a „Steered Molecular Dynamics“. Získané výsledky napomohly k návrhu struktury binárního komplexu CYP1A2/cyt b5, ilustrujícího pravděpodobný způsob, jakým oba proteiny interagují. CYP katalyzují také aktivaci některých xenobiotik, při níž vznikají metabolity s genotoxickým účinkem. Jednou z takovýchto látek je kyselina aristolochová I (AAI). Metoda protein-substrátového „dockingu“ byla použita pro studium mechanizmu aktivace (nitroredukce) tohoto prokarcinogenu, katalyzované CYP rodiny 1. Experimentálně bylo zjištěno, že CYP1B1 je v aktivaci AAI mnohem méně efektivní než CYP1A1/2. Výsledky získané v disertační práci umožnily predikci mechanizmu nitroredukce AAI studovanými enzymy. Ten zahrnuje krokový přísun dvou elektronů a dvou protonů, pravděpodobně z hydroxylové skupiny serinu/treoninu jako donoru protonu v binárním komplexu AAI CYP1A1/1A2. CYP1B1 obsahuje místo těchto aminokyselin alanin, který je však, vzhledem k absenci hydroxylové skupiny, v redukci AAI nefunkční.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Present doctoral thesis contributed to understanding of mechanistic principles of two enzymes participating in the process of carcinogenesis; DNA polymerase ϐ (pol ϐ) and cytochromes P450 (CYP). Pol ϐ is part of the DNA base-excision repair mechanism (BER). The primary role of pol ϐ in, the BER mechanism, is inserting a new nucleotide into a DNA strand according to Watson-Crick base pairing rules. Pol ϐ plays an important role in the process of carcinogenesis, approximately 30 % of human tumors express pol ϐ mutants. The ability of pol ϐ to discriminate between “right” and “wrong” nucleotide during the insertion process is called fidelity. We employed computational methods to elucidate molecular basis of the fidelity of pol ϐ. First, the relative free energy calculation method LRA was employed to compare differences in free energies between the “right” and “wrong” nucleotide during its insertion into DNA. The results indicated a better stabilization of transition-state of the nucleophilic substitution catalyzed by pol ϐ in the case of the “right” versus “wrong” nucleotide. This difference resulted in an 80-fold contribution to its fidelity. Further, computational methods FEP and LIE were used to examine how mutations effect fidelity of pol ϐ. Results were than correlated with experimental data obtained for six single-point mutants and wild-type form of pol ϐenzyme. These methods were found to be unable to predict subtle changes induced by distal single point mutations. Therefore, modifications were suggested to improve their performance leading to development of modified methods – FEP/LIE and “modified” FEP. These methods provided quantitative estimation of fidelity within acceptable margin of errors for most of the tested mutants. These new methods were further used for quantitative prediction of the effect of new distal mutations on fidelity of pol ϐ. Cytochromes P450 (CYP) represents a large group of enzymes metabolizing nonpolar xenobiotics, including carcinogenic compounds. The catalytic effect of CYP can be modified by cytochrome b5 (cyt b5). Primary role of this enzyme is a reduction of CYPs. Method of flexible protein-protein docking was used to examine the way cyt b5 interact with CYP. Biological relevancy of the modeled complexes was further validated by stability evaluation performed using methods of classical molecular dynamics and steered molecular dynamics. CYPs also catalyze activation of certain xenobiotics that leads to metabolites with genotoxic properties. One of these compounds is Aristolochic Acid I (AAI). Method of flexible protein-ligand docking was used to explore possible activation mechanisms of CYP family 1 catalyzed nitroreduction of AAI. Experimental results showed much lower level of AAI activation by CYP1B1 compared to CYP1A1/2. Stepwise (two electrons and two protons) mechanism suggested for nitroreduction catalyzed by CYP requires a proton donor group in vicinity of nitrogroup. Potential source of these protons is a hydroxylic group of serine or threonine residue in the binary complex of AAI/CYP1A1 and CYP1A2, respectively. While CYP1B1 lacks a suitable proton donor group. This could explain substantial differences in AAI reduction activities between CYP1A1/1A2 and CYP1B1.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Petr Jeřábek, Ph.D. 2.97 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Petr Jeřábek, Ph.D. 11.29 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Petr Jeřábek, Ph.D. 185 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Petr Jeřábek, Ph.D. 184 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Gustav Entlicher, CSc. 88 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. doc. RNDr. Mgr. Rüdiger Ettrich, Ph.D. 214 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1.03 MB