text size

Bordetella Adenylate Cyclase: Molecular mechanism of Action and Its Use for Antigen Delivery

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Title:
Bordetella Adenylate Cyclase: Molecular mechanism of Action and Its Use for Antigen Delivery
Type:
Dissertation
Author:
Mgr. Jana Kamanová, Ph.D.
Supervisor:
doc. Ing. Peter Šebo, CSc.
Opponents:
doc. RNDr. Petr Dráber, DrSc.
doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D.
Thesis Id:
82736
Faculty:
Faculty of Science (PřF)
Department:
Department of Genetics and Microbiology (31-140)
Study programm:
Molecular and Cell Biology, Genetics and Virology (P1519)
Study branch:
-
Degree granted:
Ph.D.
Defence date:
17/12/2009
Defence result:
Pass
Publication of the thesis:
The thesis was excluded from public domain.
Language:
Czech
Abstract (in czech):
SUMMARY (Czech) SUMMARY (Czech) První část této dizertační práce se věnuje molekulárnímu mechanismu působení adenylát-cyklázového toxinu (CyaA). Tento protein z rodiny RTX toxinů je sekretovaný gramnegativní bakterií Bordetella pertussis, která způsobuje infekční onemocnění nazývané černý kašel. CyaA hraje klíčovou roli ve schopnosti tohoto patogena kolonizovat sliznice horních cest dýchacích a to díky schopnosti potlačovat baktericidní funkce myeloidních fagocytujících buněk imunitního systému hostitele. CyaA se váže na integrin CD11b/CD18 (označovaný také jako CR3 nebo αMβ2) těchto buněk, vytváří v jejich buněčných membránách malé kation-selektivní kanály, a dopravuje do jejich cytozolu N-koncovou adenylát- cyklázovou (AC) doménu. Ta je po svém průniku do buněčného cytozolu aktivována navázáním eukaryotického kalmodulinu a katalyzuje velmi efektivní přeměnu ATP na cAMP, jednu z klíčových molekul buněčné signalizace. Tím dochází v napadených buňkách k nárůstu hladiny cAMP, což vyvolá rychlou ztrátu schopností fagocytózy pomocí Fc-receptorů a oxidativního vzplanutí těchto buněk. CyaA má unikátní schopnost přenášet svou AC doménu do cytozolu buněk přímo z cytoplazmatické membrány. Celý proces je velmi pravděpodobně poháněn membránovým potenciálem, a vyžaduje strukturní integritu a kooperaci všech domén RTX podjednotky, posttranslační modifikaci CyaA zbytkem mastné kyseliny a fyziologické koncentrace vápenatých iontů. Zde jsme analyzovali 18 mutantních variant proteinu CyaA, které mají překrývající se delece v AC doméně a nesou CD8+ OVA epitop, a ukázali, že prvních 371 N-koncových aminokyselinových zbytků je postradatelných pro dopravu OVA epitopu do cytozolu dendritických buněk. To napovídá, že AC doména aktivně nepomáhá své dopravě, a procesu cytozolické penetrace se účastní jako pouhý cestující. Dále jsme ukázali to, že CyaA inhibuje baktericidní aktivity makrofágů tím, že vyvolává neproduktivní morfologické změny a reorganizaci aktinového cytoskeletu. Jako první jsme také pozorovali to, že velmi nízké koncentrace CyaA a následná cAMP signalizace způsobují v makrofázích rychlou, a skoro úplnou, inhibici komplementem zprostředkované fagocytózy. Podařilo se nám také ukázat, že reorganizace aktinového cytoskeletu a inhibice komplementem zprostředkované fagocytózy vyvolaná CyaA je způsobena inaktivací signalizace proteinu RhoA. Vedle toho jsme rovněž charakterizovali schopnost CyaA regulovat maturaci dendritických buněk a ukázali, že CyaA potlačuje expresi CD40 a CD54 molekul a zvyšuje produkci IL-10 po působení LPS. Dále jsme ukázali, že dendritické buňky 6 SUMMARY (Czech) jež byly vystaveny působení CyaA, mají nižší schopnost aktivovat proliferaci antigen- specifických CD4+ a CD8+ T buněk, a odhalili jsme klíčovou úlohu cAMP-aktivované PKA v těchto dějích. Naše výsledky prohloubily předchozí znalosti o působení CyaA na myeloidní efektorové buňky imunitního systému. Druhá část této dizertační práce se zabývá použitím adenylát-cyklázového toxoidu (CyaA/AC-) s geneticky odstraněnou enzymatickou aktivitou, jako nového nereplikativního vektoru pro dopravu antigenů do antigen prezentujících buněk (APC). CyaA/AC- toxoidy byly již dříve úspěšně využity k dopravě vložených bakteriálních, virových nebo nádorových antigenních epitopů do cytozolu APC a k navození specifické cytotoxické CD8+ T-buněčné (CTL) odpovědi. Zde jsme analyzovali schopnost CyaA-CSP toxoidů, které nesou CD8+ epitop z CSP (circumsporozoite protein) Plasmodium berghei, vyvolávat protektivní imunitní odpověď v myším modelu malárie. Imunizace myší CyaA-CSP toxoidem vedla k indukci CSP-specifických CD8+ T buněk, ale nedošlo k navození protektivní imunitní odpovědi proti následné aplikaci sporozoitů P. berghei. Nicméně, pokud jsme podali anti-CTLA-4 protilátku během druhé („boost“) imunizace, nebo pokud byl CyaA-CSP použit v kombinaci s oslabeným kmenem bakterialní vakcíny Salmonella, která dopravovala CSP epitop do cytozolu buněk pomocí sekrečního aparátu typu tři, došlo ke zvýšení počtu indukovaných CSP-specifických CD8+ T buněk a k navození protektivní imunity. Tyto výsledky ukazují na potenciál CyaA toxoidů vzbuzovat protektivní imunitní odpoveď proti parazitické infekci a zesilovat účinek jiných vakcín v heterologním schématu imunizace. 7
Abstract:
SUMMARY (English) SUMMARY (English) The first part of this PhD. thesis deals with molecular mechanism of action of the adenylate cyclase toxin (CyaA), a key virulence factor of the whooping cough agent Bordetella pertussis. CyaA belongs to the family of RTX (Repeat-in-ToXin) proteins secreted by Gram-negative bacteria and primarily targets myeloid phagocytes, expressing the CD11b/CD18 integrin receptor (also known as αMβ2, CR3 or Mac-1). Upon binding, CyaA permeabilizes cell membranes by forming small cation-selective pores, and subverts cellular signaling by delivering into host cells an adenylate cyclase (AC) enzyme that converts ATP to cAMP. Elevation of the cytosolic cAMP levels by CyaA then knocks down bactericidal functions of host innate immunity. CyaA is unique among other enzymatically active toxins in its capacity to penetrate cells directly from cell surface across the cytoplasmic membrane, without the need for endocytosis. Penetrating activity of CyaA depends on plasma membrane potential and on an intact, acylated and calcium-loaded RTX cytolysin moiety. By examining a set of 18 CyaA constructs that bear overlapping deletions within AC domain and a CD8+ OVA T-cell epitope tag, we showed that the first 371 amino-terminal residues are dispensable for the CyaA capacity to deliver a passenger OVA epitope into cytosol of dendritic cells, as determined in vitro by stimulation of OVA-specific CD8+ T cells. This observation suggested a passive passenger role of the AC domain during its membrane penetration. In addition, we demonstrated that CyaA suppresses the bactericidal activities of macrophages by provoking futile membrane ruffling and showed for the first time that cAMP signaling of the CyaA toxin causes a rapid and complete inhibition of CR3-mediated phagocytosis. We further reported that the molecular mechanism of the repeatedly documented capacity of CyaA to undermine bactericidal activities of macrophages may well rely on RhoA inactivation, as a result of cAMP signaling. Besides that, by flow cytometry analysis and ELISA assays, we characterized the ability of CyaA to modulate maturation of dendritic cells (DCs), and showed that CyaA suppresses LPS-induced CD40 and CD54 molecule expression, and enhances IL-10 cytokine production. Moreover, we demonstrated that CyaA-treated DCs have a reduced capacity to prime proliferation of antigen-specific CD4+ as well as CD8+ T cells, and we unraveled the prominent subversive role of cAMP- activated PKA in these processes. Collectively, these findings corroborate the previous observations that CyaA subverts host immune responses. 4 SUMMARY (English) The second part of the PhD. thesis is focused on the use of adenylate cyclase toxoids for antigen delivery. The penetration of recombinant CyaA/AC- toxoids to cell cytosol could be previously exploited for delivery of passenger CD8+ epitopes to the major histocompatibility complex (MHC) class I presentation pathway, and induction of cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. An efficient therapeutic antitumor immunity in mice, and a full prophylactic protection against lethal lymphocytic choriomeningitis virus challenge was, indeed, conferred upon immunization with CyaA/AC- toxoids that bear appropriate CD8+ T-cell epitopes. We tested here the capacity of the CyaA-CSP toxoids, containing an epitope of the circumsporozoite protein of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei, to induce protective anti-malaria immunity in mice. Immunization of mice with CyaA-CSP toxoid induced high numbers of CSP-specific IFN-γ-secreting CD8+ T cells, while no protective immunity against challenge with P. berghei sporozoites was achieved. However, when the anti-CTLA-4 was administered during boost immunization, or when CyaA-CSP toxoid was employed in a heterologous prime/boost vaccination regimen, using live recombinant Salmonella delivering the CSP epitope through type III secretion system as a primary vaccination strategy, we observed significant enhancement of the CSP-specific CD8+ T cells and induction of protective immunity. Taken together, these results document the potential of CyaA to confer protection against a parasitic infection and to boost efficacy of vaccines in heterologous prime/boost immunizations. 5
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis Mgr. Jana Kamanová, Ph.D. 6.81 MB
Download Abstract in czech Mgr. Jana Kamanová, Ph.D. 125 kB
Download Abstract in english Mgr. Jana Kamanová, Ph.D. 124 kB
Download Opponent's review doc. RNDr. Petr Dráber, DrSc. 99 kB
Download Opponent's review doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D. 120 kB
Download Defence's report 1 MB