velikost textu

Molekulárně biologické metody v laboratorní diagnostice patogenních leptospir

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Molekulárně biologické metody v laboratorní diagnostice patogenních leptospir
Název v angličtině:
Molecular biological methods in laboratory diagnosis pathogenic leptospires
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Petra Kučerová, Ph.D.
Školitel:
MVDr. Zuzana Čermáková, Ph.D.
Oponenti:
doc. MUDr. Vilma Marešová, CSc.
prof. MVDr. František Treml, CSc.
Id práce:
81261
Fakulta:
Lékařská fakulta v Hradci Králové (LFHK)
Pracoviště:
Ústav klinické mikrobiologie (15-560)
Program studia:
Lékařská mikrobiologie (P5122)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
26. 9. 2013
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
SOUHRN V rámci studia doktorského studijního programu byla navržena, vypracována a do klinického provozu laboratorní diagnostiky akutní formy leptospirózy zavedena real–time PCR metoda založená na detekci genu kódujícího povrchový lipoprotein LipL32. Metoda vykázala velmi dobrou analytickou pozitivní i negativní specificitu, kdy se obě hodnoty rovnaly 100 %. Na 230 laboratorních kmenech leptospir ze sbírkových kultur Royal Tropical Institute v Holandsku byla real-time PCR odzkoušena. Mez detekce byla stanovena na 1 – 5 kopií genomu / ml tekutého biologického materiálu. V praxi byla metoda ověřena na biologických materiálech 295 pacientů se suspektní leptospirózou, vyšetřených v období duben 2010 – duben 2013. Devět osob (3,1 %) a jim přináležejících 15 (3,2 %) biologických materiálů bylo vyhodnoceno jako LipL32 pozitivní. Real-time PCR byla použita při analýze vzorků z vnějšího prostředí na přítomnost leptospir. Z celkového počtu 680 vzorků (povrchové vody, čistírny odpadních vod, vlhké substráty) bylo 5 real-time PCR reakcí (0,7 %) vyhodnoceno jako hraniční, ovšem výsledek jejich sekvenační analýzy byl opakovaně „nekultivovatelné bakterie“. Všechny vzorky byly vyhodnoceny jako negativní. Z uvedené skutečnosti je zřejmé, že metoda není vhodná pro testování takto náročných materiálů Multilokusová sekvenační typizace detekující 5 genů (adk, icdA, rrs2, lipl41 a lipl32 gen) byla použita pro vytvoření knihovny sekvencí pro 11 laboratorních kmenů patogenních leptospir. S její pomocí mohlo být následně stanoveno, o jaký infikující sérovar patogenní leptospiry se u pacientů se suspektní leptospirovou infekcí jednalo. V retrospektivní studii výskytu leptospirózy v České republice v letech 2002 – 2013 bylo vyšetřeno celkem 5840 pacientů se suspektní leptospirózou, z nichž bylo vyhodnoceno 101 osob (1,7%) jako pozitivní. Onemocnění bylo diagnostikováno častěji u mužů (n = 71; 70,3 %) než u žen (n = 30; 29,7 %). Maximum incidence bylo zaznamenáno v roce 2002 (celkem 21 osob) a 2005 (celkem 25 osob), kdy Českou republiku postihly jak rozsáhlé, tak lokální povodně. Nejvyšší počet pozitivních pacientů byl zaznamenán v měsíci listopadu (celkem 20 případů). Nejfrekventovanějším infikujícím typem byl v naší studii sérovar Leptospira grippotyphosa (n=43; 42,6 %). Pro konfirmaci výsledků real–time PCR analýzy byly využity metody mikroaglutinačního a ELISA testu. Vyšetřením 1553 příslušníků Armády České republiky bylo ELISA metodou na přítomnost specifických protilátek určeno ve třídě IgM 292 (18,8 %) a v IgG 392 (25,5 %) pozitivních osob. Naprostá většina pozitivních krevních sér byla s využitím 11 laboratorních kmenů patogenních leptospir používaných v České republice a nepatogenní Leptospira biflexa vyhodnocena metodou mikroaglutinačního testu jako negativní. U 26 krevních sér (1,7 %) byla zaznamenána slabá reakce v titrech 1:50 – 1:200
Abstract v angličtině:
SUMMMARY Title: „Molecular biological methods in laboratory diagnosis of pathogenic leptospires“ During Ph.D. study programe real-time PCR method based on detection of gene encoding surface lipoprotein LipL32 was designed, devised and introduced into clinical laboratory practice of laboratory diagnosis of acute form of leptospirosis. Positive and negative analytical specificity 100 % in both cases was defined and limit of detection in range 1 – 5 copies of genome / ml of liquid biological material was determined. Real-time PCR method was in clinical practice on biological materials gained in period April 2010 – April 2013 from 295 patients suspicious on leptospirosis verified. Total number of 9 persons from whom 15 biological materials originated as LipL32 positive were evaluated. Real-time PCR was tested during the analysis of environmental samples for the presence of Leptospira. From 680 samples (surface water, waste water, wet substrates) were 5 real-time PCR reactions (0.7%) evaluated as borderline, results sequence analysis were repeatedly "uncultivable bacteria." All samples were as negative evaluated. From mention is clear that this method is not suitable for testing these materials. Multilocus sequence typing analysis detecting 5 genes (adk, icdA, rrs2, lipl41 and lipl32 gene) was used to create the library of sequences of 11 laboratory strains of pathogenic Leptospira. With its help could then be determined which infecting serovar of pathogenic leptospires in patients with suspected leptospirosis infection was present. In retrospective study of leptospirosis in the Czech Republic in the years 2002 - 2013 total of 5840 patients with suspected leptospirosis were examined, from whom 101 persons (1.7%) were evaluated as LipL32 positive. The disease was diagnosed more often in men (n = 71, 70.3%) than in women (n = 30, 29.7%). Maximum incidence of leptospirosis was recorded in 2002 (total 21 persons) and 2005 (total 25 persons), when the Czech Republic was affected both large and local flooding. The most frequent infectious type in our study was serovar Leptospira grippotyphosa (n = 43; 42,6 %). To confirm the results of real-time PCR analysis the results of microagglutination test and ELISA were evaluated. Total of 1553 members of the Army of the Czech Republic were using ELISA method for the presence of specific antibodies IgM and IgG examined. In case of IgM 292 (18.8%) and IgG antibodies 392 (25.5%) persons as leptospira-positive were determined. The vast majority of these positive blood serum was using microagglutination test with 11 laboratory strains of pathogenic Leptospira used in the Czech Republic and non- pathogenic Leptospira biflexa as negative evaluated. In 26 blood sera (1.7%) was recorded weak reactions in titers 1:50 - 1:200.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Petra Kučerová, Ph.D. 3.98 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Petra Kučerová, Ph.D. 72 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Petra Kučerová, Ph.D. 78 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Petra Kučerová, Ph.D. 1.11 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Vilma Marešová, CSc. 121 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. MVDr. František Treml, CSc. 41 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 130 kB