text size

Příprava vazebných partnerů 14-3-3 proteinů pro strukturní studie.

Notice: I hereby declare that I am aware that the information acquired from theses published by Charles University may not be used for commercial purposes or may not be published for educational, scientific or other creative activities as activities of person other than the author.
Title:
Příprava vazebných partnerů 14-3-3 proteinů pro strukturní studie.
Titile (in english):
Preparation of the 14-3-3 Protein Binding Partners for Structural Studies.
Type:
Diploma thesis
Author:
Mgr. Miroslava Kopecká
Supervisor:
doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D.
Opponent:
Ing. Jan Teisinger, CSc.
Thesis Id:
81074
Faculty:
Faculty of Science (PřF)
Department:
Department of Physical and Macromolecular Chemistry (31-260)
Study programm:
Clinical and Toxicological Analysis (N1413)
Study branch:
Clinical and Toxicological Analysis (NKATA)
Degree granted:
Mgr.
Defence date:
02/06/2011
Defence result:
Excellent
Language:
Czech
Keywords (in czech):
Tyrosinhydroxylasa, regulace, exprese, purifikace, NMR
Keywords:
Tyrosine hydroxylase, regulation, expression, purification, NMR
Abstract (in czech):
Abstrakt Tyrosinhydroxylasa patří do skupiny hydroxylas aromatických aminokyselin a katalyzuje počáteční krok biosyntézy katecholaminových neuropřenašečů. Tento enzym má homoteramerní strukturu a skládá se ze tří strukturních domén: N-koncové regulační domény, katalytické domény a C-koncové tetramerizační domény. Aktivita tyrosinhydroxylasy je regulována fosforylací a regulací na úrovni exprese. Fosforylace Ser-19 umožňuje navázání proteinu 14-3-3, které ovlivňuje strukturu regulační domény a chrání ji před její defosforylací a degradací. Struktura regulační domény je stále neznámá, proto jsme se rozhodli pro její objasnění pomocí technik nukleární magnetické rezonance. Byl optimalizován expresní a purifikační protokol regulační domény tyrosinhydroxylasy. Protein byl exprimován jako fúzní protein obsahující histidinovou kotvu na N-konci polypetidového řetězce. Purifikace se skládala ze dvou kroků: z niklové chelatační chromatografie a gelové permeační 1H-NMR chromatografie. Dynamický rozptyl světla a spektroskopie byly využity k ověření monodisperzity proteinu a jeho možného použití pro další experimenty.
Abstract:
Abstract Tyrosine hydroxylase belongs to the group of hydroxylases of aromatic acids and catalyzes a key step in the biosynthesis of catecholamine neurotransmitters. The tyrosine hydroxylase possesses the homotetrameric structure and contains three structural domains: the N-terminal regulatory domain, the catalytic domain and the C-terminal tetramerization domain. The activity of tyrosine hydroxylase is regulated by phosphorylation and through the regulation of its expression. Phosphorylation at Ser-19 induces binding of the 14-3-3 protein, which affects the structure of the regulatory domain and protects it against both dephosphorylation and degradation. Since the structure of the regulatory domain is still unknown, we decided to perform its structural characterization using NMR techniques. First, the expression and purification protocol of the regulatory domain of tyrosine hydroxylase was optimized. The protein was expressed as a His-tag fusion protein and its purification is composed from two steps: the chelating chromatography and the size-exclusion chromatography. The dynamic light scattering and the 1H nuclear magnetic resonance were used to verify its monodispersity, and hence its suitability for further experiments.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis Mgr. Miroslava Kopecká 2.06 MB
Download Abstract in czech Mgr. Miroslava Kopecká 146 kB
Download Abstract in english Mgr. Miroslava Kopecká 5 kB
Download Supervisor's review doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. 232 kB
Download Opponent's review Ing. Jan Teisinger, CSc. 45 kB
Download Defence's report doc. RNDr. Zuzana Bosáková, CSc. 81 kB