velikost textu

Vliv cholestatického poškození jater na eliminaci a transport léčiv

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Vliv cholestatického poškození jater na eliminaci a transport léčiv
Název v angličtině:
Influence of Cholestatic Liver Injury on the Elimination and Transport of Drugs
Typ:
Disertační práce
Autor:
PharmDr. Eva Doleželová, Ph.D.
Školitel:
Prof.PharmDr. František Štaud, Ph.D.
Oponenti:
Doc. MUDr. Ivan Tilšer, CSc.
doc. MUDr. Halka Lotková, Ph.D.
Id práce:
80602
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Farmakologie a toxikologie (DFX)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
16. 12. 2009
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
SOUHRN Játra jsou životně důležitým orgánem zajišťujícím řadu homeostatických funkcí. Stěžejní úloha jater je při tvorbě a sekreci žluči, vychytávání, detoxikaci a vylučování endogenních látek a xenobiotik. Tvorba žluče je důležitá jak pro absorpci lipidů ve střevě, tak pro vylučování různých endogenních látek a xenobiotik (např. žlučové kyseliny, bilirubin, cholesterol, fosfolipidy a léčiva). Tato funkce je výrazně porušena během extrahepatální a intrahepatální cholestázy, tj. stavu charakterizovaném částečnou nebo úplnou zástavou toku žluče. Dochází k jaterní a následně i k systémové kumulaci toxických látek typu žlučových kyselin a bilirubinu, které mohou v závislosti na intenzitě a době trvání cholestázy podmínit vážné poškození organizmu. Ve snaze kompenzovat vzniklou situaci se aktivují tzv. spontánní anticholestatické obranné mechanizmy, jejichž účelem je zmírnit stav pomocí alespoň částečného přesměrování exkrece daných látek z jater do ledvin. Podstatou tohoto procesu je změna exprese, lokalizace a funkce odpovědných transportních proteinů v játrech a ledvinách. Druhým mechanizmem, který významně ovlivňuje tvorbu žluče a pohyb látek mezi krví a žlučí, je tzv. hematobiliární bariéra tvořená intercelulárními kontakty typu „tight-junctions“ (těsné spoje) a „gap-junctions“. Zatímco „gap-junctions“ slouží k výměně látek mezi buňkami, „tight-junctions“ tvoří právě tu bariéru mezi krví a žlučí, jejíž kvalita spolu s transportními procesy na hepatocytech řídí tvorbu žluče. Je prokázáno, že těsné spoje regulují pohyb iontů, vody a rozpuštěných látek paracelulárními prostory mezi hepatocyty. V rámci této dizertační práce byly studovány oba mechanizmy odpovědné za tvorbu a sekreci žluče – transportní proteiny a hematobiliární bariéra. Dále byly studovány akutní a chronickou obstrukční cholestázou navozené změny exprese transportérů a integrity hematobiliární bariéry a změny farmakokinetiky léčiv, které jsou substráty pro vybrané transportní proteiny. V první studii jsme se zaměřili na sledovaní změn biliární a renální exkrece rhodaminu 123, substrátu P-glykoproteinu (P-gp), u potkanů s akutní a chronickou obstrukční cholestázou navozenou podvazem žlučovodu v trvání jednoho a sedmi dnů. Již v mnoha studiích byla potvrzena zvýšená exprese P-gp na úrovni mRNA i proteinu během obstrukční cholestázy. Jde prakticky o jediný známý kanalikulární efluxní transportér, jehož exprese je během tohoto patologického stavu indukovaná. Jedním z možných vysvětlení je pokles koncentrace jeho substrátů v hepatocytech a následně i na kanalikulární membráně v důsledku snížené exprese bazolaterálních „Organic cation transporter 1“ (Oct1) a „Organic anion transporting polypeptide 1a4“ (Oatp1a4) transportérů pro vychytávání látek z krve. Tento fakt by mohl i částečně vysvětlit nesrovnalost mezi zvýšenou expresí P-gp a nezměněnou, resp. sníženou biliární exkrecí rhodaminu 123. Porovnáním renální a biliární exkrece bylo zjištěno, že rhodamin 123 je vylučován především ledvinami, zatímco játra přispívají k jeho exkreci do žluče jenom z 23 %. Pozorovaná snížená produkce žluči a biliární exkrece rhodaminu 123 během akutní cholestázy a zachovaná exkrece do žluče během chronické cholestázy je v rozporu se zvýšenou expresí P-gp v játrech. Částečně lze tento fakt vysvětlit na základě fyzikálně-chemických vlastností léčiva. Jedná se o flourescenční barvivo, které za fyziologického pH nese kladný náboj. Navzdory předpokladu, že rhodamin 123 vstupuje do hepatocytu pasivní difúzí, je nutno, vzhledem k jeho částečné rozpustnosti ve vodě, také počítat s příspěvkem aktivního transportu přes bazolaterální membránu hepatocytu zprostředkovaného Oct1 transportérem. Dalším vysvětlením zvýšené exprese P-gp během cholestázy je zvýšená kumulace lipofilních endogenních i exogenních látek, které prostupují bazolaterální membránou hepatocytů především pasivní difúzí a následně aktivují nukleární faktory (CAR, PXR), které regulují expresi P-gp. Rhodamin 123 je aktivně vylučován do moče prostřednictvím P-gp a změny v expresi tohoto transportéru jsou doprovázeny změnami v renální tubulární sekreční clearance jeho substrátů. Během akutní cholestázy byla tubulární sekreční clearance rhodaminu 123 a exprese P-gp zachována, což bylo vysvětleno již dříve prokázaným nefroprotektivním efektem cytokinů. Sníženou renální exkreci a clearance rhodaminu 123 během chronické cholestázy lze vysvětlit sníženou expresí P-gp. V této studii použitý model extrahepatální cholestázy s obnoveným tokem žluči poskytuje možnost studia funkčních následků cholestázy pro farmakokinetiku a farmakodynamiku endogenních látek i xenobiotik. Druhá práce se zabývá sledováním změn permeability hematobiliární bariéry za použití rhamnózo/melibiózového permeabilitního testu během akutní obstrukční cholestázy navozené u potkanů podvazem žlučovodu v trvání jednoho dne. Biliární exkrece obou cukrů byla zvýšená během prvních 60 minut experimentu (z celkových 240 minut) po jejich i.v. aplikaci. V případě kumulativní biliární exkrece byl poměr rhamnóza/melibióza zvýšený během celého experimentu. Biliární exkrece byla v porovnání s renální eliminací obou cukrů zanedbatelná. V případě i.v. aplikace rhamnózy probíhá exkrece především ledvinami s 65% podílem u potkanů a 74% podílem u lidí. Předpokládá se, že zbytek aplikované dávky rhamnózy je metabolizován na rozdíl od melibiózy, která metabolizmu nepodléhá. V naší studii činila exkrece rhamnózy 62 % z podané dávky a exkrece melibiózy 71 % z podané dávky s vysoce převažujícím podílem renální exkrece. U obou cukrů nebyla exkrece do moče ovlivněna akutní cholestázou. Z poměru koncentrace plazma/žluč rhamnózy vyplývá, že rhamnóza prochází hepatocyty podobně jako enterocyty prostřednictvím pasivní difúze a že se rychle vyrovnávají její koncentrace mezi plazmou a nově vytvořenou žlučí. Z výsledků studie vyplývá, že námi zvolený permeabilitní test je vhodný pro studium změny integrity hematobiliární bariéry během akutní cholestázy u potkanů. Tento test prokázal, že hematobiliární bariéra je více propustná během akutní cholestázy a toto poškození lze spolehlivě měřit během prvních 60 minut po podání obou cukrů. Ve třetí studii jsme se zaměřili na sledování změn farmakokinetiky metotrexátu (MTX) za použití in vivo modelu extrahepatální (podvaz žlučovodu v trvání jednoho a sedmi dnů) a intrahepatální cholestázy (aplikace lipopolysacharidu, LPS) u potkanů společně se sledováním změn exprese základních transportérů pro MTX na úrovni mRNA i proteinu. Paralelně byla hodnocena kinetika konjugovaného bilirubinu, endogenního substrátu Mrp2, která se běžně používá pro posouzení závažnosti cholestázy. U lidí je biliární exkrece odpovědná za eliminaci 10–30 % z aplikované dávky MTX. Příspěvek transportních proteinů v játrech na exkreci MTX se však zdá být značně vyšší, jelikož poměr biliární/renální exkrece je 0,94, což naznačuje významnou enterohepatální cirkulaci a aktivní reabsorpci léčiva z gastrointenstinálního traktu. Některé kinetické studie naznačují, že biliární exkrece léčiv je během extrahepatální cholestázy poškozena. Také v této studii byla biliární exkrece a biliární clearance MTX během extrahepatální cholestázy snížena, což vedlo k významnému poklesu jeho systémové clearance. V porovnání s extrahepatální cholestázou nebyl pokles biliární clerance u intrahepatální cholestázy tak výrazný. Změna exprese transportérů pro MTX v játrech částečně odpovídá změnám biliární eliminace léčiva. Konkrétně se jedná o tyto transportéry: (1) pro import MTX do hepatocytů – „Organic anion transporting polypeptide 1a1, 1a4 a 1b2“ (Oatp1a1, Oatp1a4 a Oatp1b2); (2) pro exkreci MTX do žluče – „Multidrug resistance-associated protein 2“ (Mrp2) a „Breast cancer resistance protein“ (Bcrp); (3) pro exkreci MTX z hepatocytů zpět do plazmy - „Multidrug resistance-associated protein 3 a 4“ (Mrp3 a Mrp4). Změny exprese transportérů na úrovni proteinu korelují se změnami na úrovni mRNA, což svědčí pro transkripční regulaci jejich exprese během extrahepatální cholestázy. Aplikace LPS vedla ke změnám exprese transportérů většinou na úrovni mRNA. Pouze Oatp1b2 a Mrp3 byly ovlivněny na úrovni proteinu. Ačkoli vedla obstrukční cholestáza ke zvýšení renální exkrece MTX, renální clearance léčiva byla zvýšená nesignifikantně. To dokazuje, že zvýšená exprese renálních efluxních transportérů (např. Mrp2) není schopna kompenzovat systémovou kumulaci látek typu organických aniontů během extrahepatální cholestázy. Na druhou stranu může indukce Mrp2 chránit buňky proximálních tubulů před kumulací MTX, a tak přispívat k nefroprotektivnímu efektu akutní cholestázy. Zvýšená exprese bazolaterálního efluxního transportéru Mrp3 v ledvinách může podpořit tento efekt. Naproti tomu intrahepatální cholestáza vedla ke snížené expresi Mrp2 a Mrp3 v ledvinách. Navíc byla za tohoto patologického stavu pozorována snížená glomerulární filtrace. Proto by mohlo být významné snížení renální clearance MTX připisováno nejen změně exprese transportérů, ale především snížené perfuzi ledvin. Předpokládaným původcem tohoto stavu je produkce cytokinů navozená aplikací LPS v ledvinách. V závěru lze konstatovat, že změny farmakokinetiky MTX a odpovídající změny exprese transportérů ukazují na významné odlišnosti dvou široce používaných modelů cholestázy.
Abstract v angličtině:
SUMMARY The liver is a unique organ with a number of vital functions. Pivotal one is its participation on bile formation and secretion, import, detoxification and excretion of endogenous substances and xenobiotics. Bile formation is essential for both absorption of lipids in intestine and excretion of various endogenous compounds and xenobiotics (e.g. bile acids, bilirubin, cholesterol, phospholipids and drugs). This function is markedly impaired during extrahepatic and intrahepatic cholestasis with partial or complete stoppage of bile flow. Consequently, hepatic and further systemic accumulation of toxic biliary constituents, such as bile acids and bilirubin, occurs. In an effort to compensate this situation, spontaneous anti-cholestatic mechanisms are activated, which provide alternative excretory routes for toxic accumulating compounds (e.g. renal elimination of bile acids and xenobiotics into urine). These mechanisms include changes in the expression, localization and function of respective transporters in liver and kidneys. Another mechanism with a significant impact on bile formation and transport of compounds between bile and blood is blood-biliary barrier formed by connection of hepatocytes by „tight-junctions“ and „gap-junctions“. While „gap-junctions“ exchange substances among cells, „tight-junctions“ represent the real blood-biliary barrier and are, together with transporters, necessary for the bile formation. „Tight-junctions“ regulate transport of water, solutes and ions through the paracellular spaces of hepatocytes. In this work both mechanisms responsible for bile formation and secretion – transporters and blood-biliary barrier – were studied. Furthermore, acute and chronic cholestasis induced changes in transporter expression and integrity of blood-biliary barrier were evaluated. In addition, changes in pharmacokinetics of drugs, acting as substrates of selected transporters, were examined, too. In the first study, we focused on the evaluation of biliary and renal excretion of rhodamine 123, a substrate of P-glycoprotein (P-gp), during acute and chronic extrahepatic cholestasis in rats induced by 1 and 7 days lasting bile duct obstruction. Recently, many studies have confirmed increased expression of P-gp at both mRNA and protein level during obstructive cholestasis. P-gp is the only efflux transporter expressed at the canalicular membrane of hepatocytes with increased expression during cholestasis. One of the explanations is a decline in its substrate concentration in hepatocytes due to down-regulation of basolateral uptake transporters – “Organic cation transporter 1“ (Oct1) and “Organic anion transporting polypeptide 1a4“ (Oatp1a4). This fact could partially explain the disagreement between increased expression of P-gp protein and unchanged or even decreased biliary excretion of rhodamine123. Comparison of rhodamine 123 renal and hepatic excretion showed that this compound is eliminated mostly by the kidney with only approximately 23% of the eliminated amount being excreted into bile. Decreased bile production and biliary excretion of rhodamine 123 during acute cholestasis and preserved bile excretion during chronic cholestasis are in disagreement with increased P-gp expression in livers. Physicochemical properties of the drug could partly explain this fact since rhodamine 123 is a fluorescent dye which exhibits a positive charge. Despite the assumption that it enters the cells by passive diffusion, partial water solubility at physiological pH eventuated the potential contribution of active transport at the basolateral membrane of hepatocytes via Oct1 transporter. Other explanation could be increased accumulation of endogenous and exogenous substances such as bilirubin and bile acids, which cross the basolateral membrane of hepatocytes mostly by passive diffusion and consequently activate nuclear receptors that regulate P-gp expression (CAR, PXR). Rhodamine 123 is actively excreted into urine via P-gp and P-gp expression changes are accompanied with P-gp-mediated renal tubular secretory clearance changes. During acute cholestasis, the net tubular secretion clearance and expression of P-gp protein were preserved, which complies with the reported nephroprotective effect of cytokines released from the liver. Decreased renal excretion and renal clearance of rhodamine 123 during chronic cholestasis may be explained by down-regulation of P-gp expression. In this study, the employed model of extrahepatic cholestasis with reconstituted bile flow offers possibility to investigate functional consequences of cholestasis for the pharmacokinetics and pharmacodynamics of endogenous substances and xenobiotics. In the second study, we investigated changes in permeability of blood-biliary barrier using rhamnose/meliobiose test during acute obstructive cholestasis induced by 1 day lasting bile duct obstruction. Biliary excretion of both sugars was increased during the first 60 min (from total 240 min) after i.v. application of the compounds. Regarding cumulative biliary excretion, the melibiose/rhamnose ratio was increased throughout the whole experiment. Biliary excretion of both sugars was negligible in comparison with their renal elimination. When administered rhamnose intravenously to mammals, it is eliminated primarily by the kidneys with 65% and 75% contribution in rats and humans, respectively. In comparison to rhamnose, melibiose is not supposed to be metabolised. In this study, total excretion of rhamnose and melibiose was 62% and 71%, respectively, with highly prevailing urinary excretion. Renal clearance was not influenced by cholestasis. Plasma to bile concentration ratios of rhamnose suggested that passive diffusion of this sugar through hepatocytes occurs similarly to that of enterocytes and that rhamnose quickly equilibrates between plasma and new formed bile. In conclusion, the used dual-sugar permeability test is convenient to describe the alteration of the blood-biliary barrier during acute cholestasis in rats. This test demonstrated that the blood-biliary barrier becomes leaky during acute cholestasis and this impairment could be measured during the first 60 min after administration of both sugars. The third study was focused to description of changes in the pharmacokinetics of methotrexate (MTX) using the in vivo model of extrahepatic (bile duct obstruction for 1 and 7 days) and intrahepatic cholestasis (lipopolysaccharide administration, LPS) in rats. Simultaneously, we analyzed changes in the expression of main transporters responsible for MTX transport at both mRNA and protein level. Moreover, kinetics of conjugated bilirubin, an endogenous substrate of Mrp2, was evaluated to qualify the severity of cholestasis. In humans, 10–30% of applied dose of MTX is excreted by bile. Nevertheless, the contribution of hepatic transporters seems to be higher because the ratio of MTX biliary/renal excretion in humans is 0.94. This indicates extensive entero-hepatic cycling and active reabsorption of the drug from gastrointestinal tract. Some kinetic studies demonstrated that biliary excretion of drugs is impaired during extrahepatic cholestasis. This was confirmed in this study as well, when biliary excretion and biliary clearance of MTX was decreased and led to significant reduction of its systemic clearance. In comparison to obstructive cholestasis, reduction of MTX biliary clearance was less intensive during intrahepatic cholestasis. Expression changes of MTX transporters in livers partly corresponded to alterations of MTX biliary excretion. MTX transporters include (1) for uptake into hepatocytes – “Organic anion transporting polypeptide 1a1, 1a4 and 1b2“ (Oatp1a1, Oatp1a4 and Oatp1b2); (2) for efflux into bile – “Multidrug resistance-associated protein 2“ (Mrp2) and “Breast cancer resistance protein“ (Bcrp); (3) for efflux from hepatocytes into plasma – “Multidrug resistance-associated protein 3 and 4“ (Mrp3 and Mrp4). Protein expression of transporters corresponds with that of mRNA suggesting transcriptional regulation of the expression during extrahepatic cholestasis. Administration of LPS produced changes in hepatic transporter expression mostly at the mRNA level. Only Oatp1b2 and Mrp3 were influenced at the protein level. Although we observed a rise in renal excretion of MTX, renal clearance was only slightly increased. This proves that increased expression of efflux transporters such as Mrp2 in kidneys cannot compensate systemic accumulation of anionic compounds during obstructive cholestatis. On the other hand, induction of Mrp2 may protect the kidney proximal tubular cells from the accumulation of MTX during acute cholestasis and thus contribute to nephroprotective effect. The increased expression of Mrp3 may make for this effect. Intrahepatic cholestasis led to down-regulation of Mrp2 and Mrp3 transporters in kidney proximal tubular cells. In addition, glomerular filtration was reduced in LPS-induced cholestasis and the reduction of MTX renal clearance may be attributable not only to altered transporter expression but especially to reduced kidney perfusion. This effect could be caused by increased cytokine production. Changes in MTX pharmacokinetics and respective transporter expression alterations suggest important differences between the two widely used cholestatic models.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce PharmDr. Eva Doleželová, Ph.D. 7.11 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce PharmDr. Eva Doleželová, Ph.D. 93 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky PharmDr. Eva Doleželová, Ph.D. 76 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Prof.PharmDr. František Štaud, Ph.D. 59 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. MUDr. Ivan Tilšer, CSc. 486 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Halka Lotková, Ph.D. 128 kB