velikost textu

Studium struktury komplexu 14-3-3:fosducin.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium struktury komplexu 14-3-3:fosducin.
Název v angličtině:
Study of the structure of 14-3-3:phosducin complex
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Mgr. Miroslava Kacířová
Vedoucí:
doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D.
Oponent:
Ing. Jan Teisinger, CSc.
Id práce:
78436
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyzikální a makromol. chemie (31-260)
Program studia:
Chemie (N1407)
Obor studia:
Biofyzikální chemie (NBIOFYZD)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
16. 9. 2011
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Abstrakt Předkládaná diplomová práce se zabývá biofyzikální charakterizací komplexu dvou regulačních proteinů, fosducinu (Pd) a 14-3-3. Oba proteiny jsou zapojeny do regulační kaskády přenosu signálu v oční sítnici obratlovců. Pd je 33kDa protein nacházející se ve fotoreceptorových buňkách sítnice, ale také i v jiných tkáních. Za jeho hlavní funkci v oku se považuje regulace přenosu signálu jdoucího z oka k očnímu nervu, jako odpověď na ostré světlo, a to vazbou Gtβγ podjednotky heterotrimerního transducinu, jež je součástí tzv. G-proteinové signální dráhy. Vazba znemožní spojení Gtβγ s Gtα transducinu, což zabrání dalšímu přenosu signálu. Dysfunkce Pd by v důsledku dopadu intenzivního světla vedla k poškození sítnice. Dále se také zjistilo, že Pd ovlivňuje hypertensi a to tak, že snižuje krevní tlak u lidí a myší ve spánku. Ve tmou adaptované sítnici je funkce Pd regulována 14-3-3 proteinem. 14-3-3 je 28kDa protein nacházející se v mnohých tkáních eukaryot, především v mozku, a hrající roli v mnohých biochemických procesech, např. apoptose. Role 14-3-3 v sítnici oka spočívá ve vazbě fosforylovaného Pd, jeho udržení ve vnitřním segmentu tyčinek a zabránění tak jeho vazbě s Gtβγ, čímž se zajistí další možnost přenosu signálu k očnímu nervu. Pro vazbu je nutná fosforylace Pd na Ser54 a Ser73. Tvorba homodimeru 14-3-3 je nezbytná pro jeho funkci. Možná je i ochrana Pd vůči proteasam a fosfatasam. Během diplomové práce byly exprimovány proteiny Pd wt, PdQ52K, PdQ52KS73A, 14-3-3ζ wt a 14-3-3ζnoW v bakteriálním systému E.coli BL21(DE3) a úspěšně purifikovány s výtěžkem miligramových množství. Bylo použito několika biofyzikálních technik ke studiu komplexu. Nativní elektroforéza ověřila vznik komplexu po fosforylaci obou fosforylačních míst Pd (Ser54, Ser73), limitovaná proteolýza odhalila strukturní změny Pd po jeho vazbě se 14-3-3, analyticka ultracentrifugace ukázala, že stechiometrie komplexu 14-3-3/Pd je 2:1, tedy dva monomery 14-3-3 vážou jeden fosducin. Dále byla touto technikou odhadnuta disociační konstanta komplexu Kd s výsledkem 5μM. Měření časově-rozlišeného dohasínání anizotropie Trp fluorescence umožnilo pozorovat změny flexibility Pd při vzniku komplexu z Pd fosforylovaného v obou místech, oproti mutantům Pd, kde je pouze jedno fosforylační místo (Ser54, nebo Ser73). Nebyl pozorován signifikantní vliv samotné fosforylace na strukturu Pd.
Abstract v angličtině:
Abstract The aim of this diploma thesis is a biophysical characterization of the protein complex that consists of two regulatory proteins, the phosducin (Pd) and the 14-3-3 protein. These proteins are involved in the regulation of a signal cascade in vertebrate eye´s retina. Pd is a 33kDa protein located in photoreceptor cells in retina, but it has been found in other tissues as well. In retina, phosducin affects transfer of light signaling from eye to brain, by binding Gtβγ subunit of transducin that is the main part of G-protein signaling. In light-adapted retina, unphosphorylated phosducin down-regulates the light response by binding to Gtβγ. This process is important for protecting retina in eyes in response to very intense light. It has also been found that phosducin affects hypertension. Phosducin reduces blood pressure of human and mice, especially during sleep. The function of phosducin is regulated in dark-adapted retina by 14-3-3. 14-3-3 is a 28kDa protein that has been found in many eukaryotic tissues, e.g. brain, and is involved in many processes, e.g. apoptosis. The 14-3-3 protein binds phosphorylated Pd and keeps him in a rod inner segment. For 14-3-3 to Pd binding, two sites on Pd must be phosphorylated, Ser54 and Ser73. This interaction, hinders Pd binding to Gtβγ, and hence enables the formation of heterotrimeric transducin. Transducin is then prepared to transfer a new signal. It is also possible that 14-3-3 protects phosducin against proteases and phosphatases. Pd wt, PdQ52K, PdQ52KS73A, 14-3-3ζ wt a 3-3ζnoW have been produced in E. coli BL21(DE3) cells and purified. Several biophysical techniques were used to study the 14-3-3/Pd complex. Native electrophoresis showed the formation of the complex with doubly phosphorylated Pd (Ser54, Ser73). Limited proteolysis revealed structural changes of Pd in response to 14-3-3 binding. Analytical ultracentrifugation revealed the stoichiometry of the 14-3-3/Pd complex (2:1), where two monomers of 14-3-3 bind one Pd. The dissociation constant was estimated to be 5μM. Time-resolved tryptophan fluorescence measurements were used to study the flexibility of Pd upon the 14-3-3 protein binding. No significant structural change of Pd was observed in response to phosphorylation.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Miroslava Kacířová 1.85 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Miroslava Kacířová 71 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Miroslava Kacířová 66 kB
Stáhnout Posudek vedoucího doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. 232 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Jan Teisinger, CSc. 139 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 371 kB