velikost textu

Studium receptor-ligandového páru NKR-P1F a Clrg

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium receptor-ligandového páru NKR-P1F a Clrg
Název v angličtině:
Study of receptor-ligand pair NKR-P1F and Clrg
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Mgr. Kristýna Kotýnková
Vedoucí:
RNDr. Petr Man, Ph.D.
Oponent:
Ing. Bohdan Schneider, D.Sc. (Tech.), CSc., DSc.
Id práce:
77026
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (N1406)
Obor studia:
Biochemie (NBIOD)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
30. 5. 2011
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
NK buňky, Clrg, NKR-P1F, rekombinantní proteiny, in vitro renaturace, krystalizace proteinů
Klíčová slova v angličtině:
NK cells, Clrg, NKR-P1F, recombinant proteins, in vitro renaturation, protein crystallization
Abstrakt:
Studim receptor – ligandového páru NKR-P1F a Clrg Myší receptor – ligandový pár NKR-P1F a Clrg je důležitou součástí receptorového „zipu“, který vzniká při kontaktu mezi NK buňkou a cílovou buňkou. Tento pár představuje jeden z příkladů nedávno objevených interakcí typu lektin-lektin, které jsou důležité při rozpoznání u mnoha imunocytů. Za účelem studia struktury těchto proteinů a jejich vzájemné interakce byly připraveny vektory pET-30a(+) pro bakteriální expresi. Tyto vektory kódovaly části extracelulárních domén obou proteinů. Po indukci IPTG byly proteiny produkovány ve formě inkluzních tělísek, ze kterých byly renaturovány in vitro. Renaturované proteiny byly purifikovány kombinací ionexové a gelové chromatografie. Konstrukt pro protein NKR-P1F poskytoval při použití standardních renaturačních protokolů pouze malé výtěžky solubilního proteinu, a navíc vyvstaly problémy s reprodukovatelností výsledků renaturace. V případě Clrg nebyly standardní postupy skládání úspěšné. Kvůli tomu bylo přistoupeno k mutaci lichého cysteinu, který nezapadal do obvyklého vzoru pro tyto receptory. Cystein byl mutován na serin a produkt výsledného C148S konstruktu již bylo možnorenaturovat in vitro. Dále bylo zjištěno, že přídavek (benzyldimethylamonnia)propansulfonátu do renaturačního pufru zvyšuje výtěžek solubilního Clrg proteinu. Identita a čistota obou proteinů, stejně jako kvalita renaturace byly zkontrolovány pomocí hmotnostní spektrometrie s iontově cyklotronovou rezonancí. Za použití modifikovaných protokolů elektroforézy a enzymatického štěpení s kombinací kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie bylo určeno zapojení disulfidových můstků u obou proteinů. Pozorované zapojení odpovídalo očekávanému vzoru pro molekuly odvozené od C-lektinů. Protein Clrg byl analyzován pomocí analytické ultracentrifugace. Metodou sedimentační rychlosti byla získána hodnota sedimentačního koeficientu a bylo zjištěno, že protein se v roztoku vyskytuje převážně ve formě monomeru. Krystalizace proteinu Clrg byla úspěšná a bylo tedy možno naměřit difrakční data na synchrotronovém radiačním zdroji Bessy II, Helmholtz Zentrum Berlín. Fázový problém byl vyřešen molekulárním nahrazením s využitím struktury lidského proteinu CD 69. Struktura Clrg je vůbec první rozřešenou strukturou z celé Clr rodiny. Financováno z grantů Ministerstva školství České Republiky (MSM_21620808 a 1M0505), a Grantové Agentury České Republiky (GAČR 305/09/H008 and 303/09/0477).
Abstract v angličtině:
Study of receptor-ligand pair NKR-P1F and Clrg Mouse NKR-P1F:Clr-g receptor:ligand pair is important component of the receptor “zipper” that occurs at the contact between natural killer cell and its target cell, and represents a recently discovered example of lectin-lectin interactions important for recognition among immune cell subsets. In order to study structure of these proteins and interactions between them, we have prepared pET-30a(+) bacterial expression vectors coding parts of extracellular domains of the two receptors. After induction of protein production with IPTG, the proteins precipitated into inclusion bodies, from which they could be refolded in vitro. Refolded proteins were purified using combination of ion exchange and size exclusion chromatography. NKR-P1F construct yielded only small amounts of soluble protein using standard refolding protocols. Furthermore we have experienced difficulties with reproducibility of the refolding results. In the case of Clrg the standard protocols for protein refolding were not sufficient. In order for the Clrg to fold properly, the odd cysteine which does not fit into the pattern usual for this family of receptors was substituted for serine and resulting C148S construct was shown to be more useful. Further, using (benzyldimethylammonio)propanesulfonate in refolding buffer has brought better yields of soluble protein Clrg. Identity, purity and quality of refolding of both proteins was confirmed using ion cyclotron resonance mass spectrometry. Using modified electrophoresis and digest protocols in combination with liquid chromatography and mass spectrometry we found that disulfide bonding of both proteins fitted into the pattern expected for C-type lectin like molecules. Protein Clrg was analyzed by analytical ultracentrifugation. Using sedimentation velocity method we obtained sedimentation coefficient and found that the protein was mostly monomeric in solution. The crystalization of Clrg was successful and diffraction data were collected at the synchrotron radiation source Bessy II of the Helmholtz Zentrum Berlin. Phase problem was solved by molecular replacement using structure of human CD 69. The structure of Clrg protein is the first resolved structure in the whole Clr family. (In Czech) Supported by grants from Ministry of Education of Czech Republic (MSM_21620808 and 1M0505), and from The Grant Agency of Czech Rep. (GACR 305/09/H008 and 303/09/0477).
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Kristýna Kotýnková 6.07 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Kristýna Kotýnková 26 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Kristýna Kotýnková 8 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Petr Man, Ph.D. 136 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Bohdan Schneider, D.Sc. (Tech.), CSc., DSc. 2.2 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. 81 kB