text size

Studium funkce reprodukčních bariér za použití in vivo a in vitro modelů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Title:
Studium funkce reprodukčních bariér za použití in vivo a in vitro modelů
Titile (in english):
Study of the Function of Reproductive Barriers for Use in Vivo and in Vitro Models
Type:
Dissertation
Author:
Mgr. Kateřina Pospěchová
Supervisor:
Doc. RNDr. Vladimír Semecký, CSc.
Opponents:
prof. MUDr. Jan Evangelista Jirásek, DrSc.
prof. MUDr. Josef Stingl, CSc.
Thesis Id:
76961
Faculty:
Faculty of Pharmacy in Hradec Králové (FaF)
Department:
Department of Biological and Medical Sciences (16-16150)
Study programm:
Pharmacy (P5206)
Study branch:
Pharmacology and Toxicology (DFX)
Degree granted:
Ph.D.
Defence date:
24/09/2009
Defence result:
Pass
Language:
Czech
Abstract (in czech):
Souhrn Hlavním limitujícím faktorem pro distribuci léčiv v těle je přítomnost fyziologických bariér. Placentární a hematotestikulární bariéra k nim bezesporu patří. Placenta je důležitý endokrinní orgán zprostředkovávající kontakt mezi matkou a plodem. Kromě dodávky živin plodu a odvodu zplodin metabolismu z plodu hraje placenta důležitou roli též v ochraně plodu. Klíčovou roli roli v ochraně plodu hraje vrstva syncytiotrofoblastu, která funguje nejen jako mechanická bariéra, ale také díky expresi biotransformačních enzymů a transportérů jako tzv. metabolická bariéra. Syncytiotrofoblast exprimuje též nukleární receptory, jež regulují transkripci genů podílejících se na výživě, minerálním metabolismu, proliferaci a diferenciaci, nebo mohou regulovat také expresi enzymů a transportérů. Ve varleti se na ochraně zárodečných buněk podílí hematotestikulární bariéra tvořená zejména těsnými a adhezními spoji mezi Sertoliho buňkami. Mezibuněčné spoje mezi Sertoliho buňkami a buňkami zárodečnými jsou zásadní také pro zachování zdárného vývoje spermií. V rámci disertační práce jsme se zaměřili na studium VDR v placentě, placentárním trofoblastu a choriokarcinomových liniích BeWo a JEG3. VDR je exprimován jak v placentě (exprese na úrovní mRNA i proteinu), tak v kulturách primárního trofoblastu. Nicméně, jeho funkce v placentární fyziologii není zcela jasná. U BeWo a JEG3 choriokarcinomových linií jsme zjistili, že exprese VDR je velmi nízká ve srovnání s placentou a izolovaným trofoblastem. Za použití různých přístupů jsme se snažili odhalit příčinu nízké exprese VDR ve studovaných placentárních liniích. BeWo a JEG3 jsme inkubovali s látkami podporujícími diferenciaci buněk (jednalo se o 17β-estradiol a forskolin), dále s inhibitory deacetylas (trichostatin, sodium butyrát) a inhibitory DNA-metylas (3-deoxy-5-azacytidin). Zjistili jsme, že exprese VDR je částečně obnovena po inkubaci placentárních buněčných linií BeWo a JEG-3 s butyrátem sodným a 3-deoxy-5-azacytidinem. Tyto výsledky svým způsobem vysvětlují příčinu nedostatečné exprese VDR v choriokarcinomových liniích (epigenetická regulace). Mimo genomický efekt jsme prokázali, že vitamin D má také negenomové účinky na VDR nezávislé. Ukázali jsme, že 1α,25(OH)2D3 stimuluje fosforylaci ERK1/2 kináz v chorikarcinomové linii JEG-3, což by mohlo mít za následek ovlivnění genové exprese nezávisle na přítomnosti VDR. Tato práce má zásadní význam pro další studium funkce VDR v placentární fyziologii a metabolismu. Další publikovaná práce se zabývá expresí a funkcí BCRP v placentě potkana. Cílem této studie bylo popsat roli Bcrp v placentární farmakokinetice, a to za použití potkaní trofoblastové buněčné linie HRP-1 a duálně perfundované potkaní placenty. Za použití real time RT-PCR a Western blotu byla potvrzena exprese BCRP v HRP-1 a potkaní placentě. Imunohistochemická analýza potvrdila přítomnost placentárního Bcrp v trofoblastu labyrintové zóny placenty. Data tak naznačují, že BCRP je přítomen v trofoblastu placenty a může tak plnit svou úlohu v transplacentární farmakokinetice u experimentálního zvířete. Transportní studie za použití duálně perfundované placenty potkana potvrdila, že BCRP, podobně jako P-glykoprotein, brání vstupu modelových substrátů z mateřského kompartmentu do plodu a zároveň se podílí na eliminaci látek transportovaných BCRP/Bcrp1 z plodu do mateřské cirkulace. Jelikož placentární „bariéra“ potkana je morfologicky i funkčně v mnoha ohledech velmi podobná lidské placentě, výsledky mají velkou prediktivní hodnotu pro transplacentární farmakokinetiku i u člověka. Další práce je zaměřena na studium exprese P-kadherinu ve zdravém varleti potkana. Sleduje rovněž změny týkající se morfologického obrazu varlete a exprese P-kadherinu v průběhu poškození operativně navozeným kryptorchismem a busulfanem. Charakter exprese P-kadherinu v semenotvorném tubulu zdravého varlete se měnil v závislosti na stadiu semenotvorného epitelu. Expozice busulfanem a také kryptorchismus vedly k destruktivním změnám semenotvorných tubulů, spolu se snížením exprese P-kadherinu. Z výše uvedeného vyplývá, že P-kadherin se podílí na struktuře adherentních spojů ve varleti potkana a hraje důležitou roli pro udržení normální spermatogeneze. Jak kryptorchismus tak busulfanové poškození vede k desintegraci adherentních spojů. Závěrem lze říci, že studie týkající se exprese VDR v placentárních buněčných liniích pomůže mnohým dalším badatelům objasnit funkci VDR v placentární fyziologii. Předmětem dalšího studia bude například ověřit, zda se VDR podílí na transkripční regulaci konkrétních biotransformačních enzymů (CYP3A4) či transportérů (P-gp), ať již v placentě či jiných orgánových systémech. Již v současné době pracujeme na studii transkripční regulace vybraných biotransformačních enzymů a transportérů právě prostřednictvím VDR, PXR a CAR, a to nejen na placentárních, ale také na jaterních a střevních buněčných modelech. Z výsledků další studie vyplývá, že efluxní lékový transportér BCRP exprimovaný v placentě je významným faktorem ovlivňujícím prostup léčiv z matky do plodu. Znalost jeho substrátové specifity a funkční aktivity by mohlo být využito v optimalizaci farmakoterapie u těhotných žen. Odhalení úlohy P-kadherinu při narušené spermatogenezi nabízí možnost objasnit některé z příčin a mechanismů mužské neplodnosti, a to zejména ve spojení se studiem dalších proteinů podílejících se na tvorbě mezibuněčných spojů (těsných, adhezivních spojů, nexů), cytoskeletu či bazální membrány.
Abstract:
Summary: The main limiting factor of distribution of the drugs in the body is the presence of physiological barriers. Placental and blood-testis-barrier are two barriers that were studied in this thesis. The placenta is an important endocrine organ bringing maternal and fetal blood into proximity, allowing exchange of nutrients and waste products. In addition, the placenta acts as the barrier between the mother and fetus, and plays an important role in fetal protection. The key rate-limiting layer in the placenta is the single layer of syncytiotrophoblast. The placental trophoblast contains multiple drug transporters and metabolizing enzymes that control maternofetal exchange of nutrients and hormones, or which form placental “metabolic” barrier. Moreover, several members of the nuclear receptor superfamily are expressed in placental trophoblasts. They regulate transcription of the genes involved in nutrient transport, mineral metabolism, proliferation and differentiation. Moreover it was suggested that they control expression of placental drug transporters and xenobiotic metabolizing enzymes. Germ cells in the testis are protected mainly by the presence of blood testis barrier, formed by the tight or adherens junctions between Sertoli cells. Moreover, intercellular junctions between Sertoli and germ cells are pivotal for spermatogenesis. In this dissertation we focused on the expression and activity of VDR in human placenta, isolated trophoblast and in choriocarcinoma cell lines BeWo and JEG3. VDR is expressed (at the mRNA and protein level) in the human placenta and in the cultures of primary trophoblasts as well. However, its function in placental physiology is still unknown. We revealed that BeWo and JEG-3 choriocarcinoma cell lines express low levels of VDR in comparison with isolated cytotrophoblasts or human placenta. In order to elucidate the mechanism of VDR gene suppression in JEG-3 and BeWo cell lines, we used several approaches to stimulate differentiation of the cytotrophoblast cell lines and to restore expression of VDR in the placental cell lines. We used prototype differentiation agents forskolin and 17β-estradiol, histone deacetylase inhibitors sodium butyrate and trichostatin A and DNA methylase inhibitor 5-deoxy-3´-azacytidin. We showed that VDR mRNA expression is restored after treatment of BeWo and JEG3 cells with sodium butyrate and 5-deoxy-3´-azacytidine. It means that VDR expression is suppressed epigenetically in choriocarcinoma cell lines, which results in low transactivation activity of VDR in the cells. Finally, we observed a non-genomic effect of 1α,25(OH)2D3 in JEG-3 cells and the activation of the extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling pathway. We revealed that 1α,25(OH)2D3 stimulates phosphorylation of ERK1/2 kinases in JEG3 cells, what could affect gene expression independently on VDR expression. These results should be considered in future studies regarding the biological function of VDR and 1α,25(OH)2D3 in the normal and tumour placental trophoblast. The next study was focused on the expression and function of BCRP in transplacental pharmacokinetics of rat. Employing real-time RT-PCR and Western blotting established expression of BCRP in rat placenta and in rat placental cell line HRP-1. Immunohistochemical analysis confirmed the presence of BCRP in trophoblast of labyrinth zone of the placenta. Our data thus indicate that BCRP is expressed in the placenta and therefore can play a role in transplacental pharmacokinetics. Using dually perfused rat placenta, we confirmed that BCRP (similarly to P-gp) reduces the passage of its substrates from mother to the fetus and also removes the drug already present in the fetal circulation. The rat placental barrier is morphologically and functionally similar to human placenta, the results obtained here might have a high predictive value for the transplacental pharmacocinetics in humans. The next study was focused on the expression of P-cadherin in normal, busulphan treated and cryptorchid rat testis. The pattern of expression of P-cadherin in the seminiferous epithelium changed with the stage of the seminiferous epithelium. Our experiments revealed that the busulphan treatment and cryptorchism led to destructive changes in the structure of seminiferous tubules, together with the decrease of the P-cadherin expression. We suggest that P-cadherin participates in the architecture of adherens junctions in testis, plays an important role in maintaining normal spermatogenesis and that cryptorchism and busulphan treatment lead to adherens junction disintegration. In conclusion, the efflux drug transporter BCRP expressed in placenta is the important factor affecting penetration of drugs from mother to fetus. Knowledge of its substrate specifity and functional activity could be used in optimalization of pharmacotherapy of pregnant women. The study concerned with the expression of VDR in placental cell lines could help to other investigators to elucidate the role of VDR in placental physiology. The aim of next study will be to verify if VDR transcriptionally regulates the expression of biotransformation enzymes (CYP3A4) or transporters (P-gp). Presently we are working on the study of transcriptional regulation of CYP3A4 via VDR, PXR and CAR using placental, hepatic and intestinal cell lines. Elucidation the role of P-cadherin in normal and injured spermatogenesis could help us to clarify some of the reasons and mechanisms of man infertility, especially in connection with a study of other proteins participating in forming intercellular junctions (tight, adherens, communicative junctions, cytoskeleton or basement membrane.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis Mgr. Kateřina Pospěchová 1.52 MB
Download Abstract in czech Mgr. Kateřina Pospěchová 105 kB
Download Abstract in english Mgr. Kateřina Pospěchová 92 kB
Download Supervisor's review Doc. RNDr. Vladimír Semecký, CSc. 80 kB
Download Opponent's review prof. MUDr. Jan Evangelista Jirásek, DrSc. 98 kB
Download Opponent's review prof. MUDr. Josef Stingl, CSc. 130 kB