velikost textu

Výzkum vzájemné interakce membránových receptorů NKR-P1D a Clrb

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Výzkum vzájemné interakce membránových receptorů NKR-P1D a Clrb
Název v angličtině:
Studies on interactions between NKR-P1D and Clrb membrane receptors
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Mgr. Pavel Hanč
Vedoucí:
RNDr. Petr Novák, Ph.D.
Oponent:
Mgr. Tomáš Brdička, Ph.D.
Id práce:
76638
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Imunologie (NIMUN)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
2. 6. 2011
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
NK buňky, membránové proteiny, NKR-P1D, Clrb, nekovalentní interakce, chemické zesítění proteinů, hmotnostní spektrometrie
Klíčová slova v angličtině:
NK cells, membrane proteins, NKR-P1D, Clrb, non-covalent interactions, chemical cross-linking, mass spectrometry
Abstrakt:
Výzkum vzájemné interakce membránových receptorů NKR-P1D a Clrb Interakce myších receptorů NKR-P1D a Clrb byla poprvé popsána jako nový typ „MHC class-I independent missing-self recognition“ poskytující ochranu před NK buněčným zabíjením.[1] Pozdější studie ale přinesla výsledky zpochybňující tato data a naznačující, že NKR-P1D váže Clrb pouze velmi slabě, jestli vůbec.[2] Abychom vnesli světlo na tyto diskrepantní výsledky, rekombinantě jsme připravili extracelulární domény obou receptorů v bakteriích E. coli a proteiny renaturovali in vitro. Kvalita renaturace byla ověřena určením zapojení disulfidických můstků a změřením 1H/15N-HSQC spekter. Pomocí gelové filtrace a analytické ultracentrifugy nebylo možno poskytnout přesvědčivé důkazy pro existenci interakce. Slabá, ale specifická interakce byla pozorována za použití SPR techniky. Tato interakce překvapivě vykazovala pH závislost. Interakce mezi proteiny v roztoku byla následně imobilizována pomocí techniky chemického zesítění proteinů. Byla použita činidla EDC, DSG a DSS. Reakční směsi byly rozděleny pomocí SDS-PAGE a dimery byly štěpeny proteasami v gelu. Pomocí FTMS bylo možné identifikovat peptidy z obou proteinů, které byly spojeny některým ze síťovacích činidel. Díky nedávno vyřešeným strukturám proteinů NKR-P1A a Clrg, které sdílí s NKR-P1D a Clrb 86% a 76% sekvenční identitu bylo možné vytvořit homologní modely obou proteinů i interagujícího páru dimerů. Část dat získaných síťovacím experimentem dle očekávání zapadala do modelu dvou homodimerů interagujících klasickým „face-to-face „způsobem. Nezanedbatelná část pozorovaných spojení ale nemohla být vysvětlena tímto modelem, s ohledem na délku ramének použitých činidel. Tato pozorování nás vedla k návrhu modelu, podle kterého jsou tyto proteiny schopny interakce vždy jednoho homodimeru současně se dvěma homodimery proteinu druhého. Toto by navíc vedlo k výraznému zvýšení celkové avidity, i přesto že afinita jednotlivých monomerů může být velmi nízká, jak shodně naznačují gelová filtrace, analytická ultracentrifuga i povrchová plasmonová resonance. 1. Iizuka, K. et. al., Nat. Immunol., 2003, 4, 801 – 807 2. Carlyle, J. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2004, 101, 3527 – 3532
Abstract v angličtině:
Studies on interactions between NKR-P1D and Clrb membrane receptors Interaction between murine NKR-P1D and Clrb receptors was originally described as a novel type of „MHC class-I independent missing-self recognition“ and was shown to confer protection from killing by natural killer cells.[1] However, further study brought conflicting results suggesting that NKR-P1D does not binds Clrb strongly if it does at all.[2] In order to address the issues arising from these conflicting results, we have recombinantly expressed the extracellular domains of both receptors in E. coli cells and refolded the proteins in vitro. The quality of refolding was confirmed both by determining the disulphide bonding 1H/15N-HSQC pattern using FTMS and measuring spectra. By means of size exclusion chromatography and analytical ultracentrifuge we were unable to provide convincing results for the interaction itself. However, using SPR technique, a weak, specific, pH-dependent interaction was observed. Interaction between the proteins in solution was immobilized using chemical cross-linking technique. Three cross-linking reagents, EDC, DSG and DSS were used. The reaction mixture was separated by means of SDS-PAGE and protein bands corresponding to dimers were digested in gel. Using FT-MS we were able to find peptides from both proteins connected by the cross-linkers. Using recently resolved structures of extracellular domains of NKR-P1A and Clrg receptors bearing 86% and 76% sequence identity with NKR-P1D and Clrb respectively, we were able to build homology models of both NKR-P1D and Clrb and a model of the interacting pair. Part of the data obtained from cross-linking experiments fitted nicely into the model of homodimers of both proteins interacting in a face-to-face fashion as would be expected; however significant portion of the observed cross-links could not be explained by this model. In order to allow for these data, we suggest that these receptors do not only interact in the face-to-face fashion but also in a chain-like or cluster-like fashion with each homodimer contacting two homodimers of the second protein at the same time. This would also lead to significant increase in the overall avidity even though the affinity of monomeric units might be very small as indicated by size exclusion chromatography, analytical ultracentrifuge and surface plasmon resonance. (Thesis in Czech) 1. Iizuka, K. et. al. Nat. Immunol., 2003, 4, 801 – 807 2. Carlyle, J. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci, 2004, 101, 3527 – 3532
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Pavel Hanč 18.73 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Pavel Hanč 29 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Pavel Hanč 11 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Petr Novák, Ph.D. 141 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Tomáš Brdička, Ph.D. 85 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 215 kB