velikost textu

Význam transportních proteinů a biotransformačních enzymů pro ochrannou funkci placenty

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Význam transportních proteinů a biotransformačních enzymů pro ochrannou funkci placenty
Název v angličtině:
Importance of Transport Proteins and Biotransformation Enzymes for Defending Role of the Placenta
Typ:
Disertační práce
Autor:
PharmDr. Zuzana Vacková
Školitel:
Prof.PharmDr. František Štaud, Ph.D.
Oponenti:
Doc. PharmDr. František Trejtnar, CSc.
doc. MUDr. Stanislav Mičuda, Ph.D.
Id práce:
75947
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Farmakologie a toxikologie (DFX)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
18. 9. 2009
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
SOUHRN Souhrn Placenta je jedinečný orgán zajišťující řadu vitálních funkcí, které jsou nezbytné pro správný průběh těhotenství a vývoj jedince. Vedle hlavní funkce přísunu živin, odvodu zplodin metabolismu a výměny plynů plní placenta také úlohu endokrinní, metabolickou a především ochrannou. Placenta je považována za jednu z fyziologických bariér organismu, která zásadním způsobem reguluje transport endogenních i exogenních látek mezi dvěma kompartmenty - krevním oběhem matky a plodu. Do nedávné doby se předpokládalo, že placentární bariéru tvoří především buněčné vrstvy oddělující krev matky a plodu - syncytiotrofoblast a endotel fetálních kapilár. V současné době se však stále více ukazuje, že vedle této mechanické složky se na placentární bariéře podílí i složka aktivní, realizovaná činností efluxních transportérů a biotransformačních enzymů lokalizovaných ve vrstvě syncytiotrofoblastu. Efluxní transportéry jsou membránové proteiny, které aktivně (za spotřeby ATP) "pumpují" širokou škálu substrátů ven z buňky. Kinetiku transportu látek přes placentu ovlivňují zásadním způsobem především dva transportéry: P-glykoprotein (P-gp) a "breast cancer resistant protein" (BCRP). Oproti transportérům tvoří biotransformace látek v placentě pravděpodobně minoritní, avšak nezanedbatelnou složku aktivní bariéry. Jedná se zejména o enzymy cytochromu P450, konjugační enzymy II. fáze metabolismu a enzymy uplatňující se v metabolismu steroidních molekul. V rámci této disertační práce byly studovány obě složky aktivní placentární bariéry - transportní i metabolická. Z efluxních transportérů se naše pozornost soustředila na transportér BCRP jehož expresi a aktivitu jsme studovali na modelu placenty potkana v podmínkách in-vitro a in-situ. Přítomnost BCRP jsme potvrdili v potkaní placentární buněčné linii HRP-1 i v placentě potkana na konci březosti a to jak na úrovni mRNA tak na úrovni proteinu s využitím metod real-time RT-PCR, Western blottingu a imunohistochemie. Paralelně s BCRP jsme sledovali také expresi P-gp, který byl detekován pouze v placentě potkana, zatímco v buněčné linii HRP-1 nebyl přítomen. Aktivitu BCRP v podmínkách in-vitro jsme potvrdili s využitím fluorescenčně značeného substrátu BCRP - BODIPY FL prazosinu a inhibitorů BCRP - GF120918 a Ko143. V souladu s výsledky expresních studií jsme v linii HRP-1 nepozorovali žádnou aktivitu P-gp. Dále jsme studovali vliv BCRP na farmakokinetiku transportu léčiv přes placentární bariéru s využitím duální perfúze placenty potkana in-situ. Jako modelový substrát BCRP jsme zvolili cimetidin, jehož Souhrn průchod přes placentu jsme sledovali jak v matero-fetálním tak feto-maternálním směru. Pro ověření BCRP specifického transportu byly použity inhibitory BCRP - GF120918 a fumitremorgin C. S pomocí tohoto modelu se nám podařilo prokázat, že BCRP hraje v kinetice přestupu látek přes placentu dvojí roli: 1) omezuje průchod substrátů z krve matky do plodu a 2) aktivně urychluje vylučování léčiva již přítomného v krvi plodu. V dalších dvou studiích jsme se zaměřili na sledování exprese a aktivity enzymu 11β-hydroxysteroid dehydrogenázy (11β-HSD) jako feto-placentární bariéry průchodu glukokortikoidů (GK) z krve matky do plodu. První práce se zabývá rolí placentární 11β-HSD v metabolismu GK v průběhu březosti potkana a dále vztahem mezi aktivitou placentární a fetální 11β-HSD a jejich vlivem na poměr mezi aktivními a neaktivními formami GK v krvi plodu. Nejprve byl sledován profil exprese a aktivity placentární 11β-HSD typu 1 a 2 mezi 13. a 21. dnem březosti potkana. U obou typů placentární 11β-HSD byl pozorován pokles v expresi, avšak s odlišným profilem. Zatímco hladiny mRNA 11β-HSD1 nejprve prudce poklesly mezi 13. a 14. dnem březosti a poté zůstávaly víceméně konstantní, exprese 11β- HSD2 v poslední třetině gravidity pozvolně klesala a vždy převažovala nad 11β-HSD1. Pokles 11β-HSD2 v placentě ke konci posledního trimestru byl dále potvrzen i na úrovni proteinu. Pokles exprese 11β-HSD1 byl doprovázen také poklesem její aktivity. Oproti tomu, NAD+ dependentní dehydrogenázová aktivita 11β-HSD2 analyzovaná v tkáňových homogenátech se ke konci gravidity zvyšovala. Tyto výsledky naznačují existenci posttranslačního regulačního mechanismu, který ovlivňuje aktivitu placentární 11β-HSD2. Ze studia aktivity 11β-HSD2 v přítomnosti dithiotreitolu in-situ vyplynulo, že tento mechanismus je pravděpodobně odlišný od procesu aktivace a deaktivace 11β-HSD2 reverzibilní dimerizací. Dále jsme sledovali hladiny kortikosteronu a 11-dehydrokortikosteronu v krvi plodu a porovnávali je s aktivitou placentární a plodové 11β-HSD. Z výsledků vyplývá, že na regulaci metabolismu GK a jejich hladin v krvi plodu se významně podílí aktivita plodové 11β-HSD a to především ke konci gravidity. V následující práci jsme se zabývali vlivem prenatálně podávaných syntetických steroidů (dexametazonu a betametazonu) na expresi a konverzní kapacitu placentární 11β-HSD typu 2. Ke studiu byl opět použit model potkaní placenty. GK byly podávány březím samicím ve dvou různých dávkách (nízká nebo vysoká) v průběhu 16. - 20. dne březosti. Exprese 11β-HSD v placentách odebraných Souhrn 21. den březosti byla analyzována s pomocí metod real-time RT-PCR a Western blottingem. Konverzní kapacita 11β-HSD2 byla hodnocena pomocí duální perfúze placenty potkana, jako modelový substrát pro 11β-HSD2 byl použit kortikosteron. Naše výsledky ukázaly, že ačkoliv vliv prenatální terapie syntetickými GK na expresi 11β-HSD je minimální nebo, v případě dexametazonu, omezený na transkripční úroveň, konverzní kapacita tohoto enzymu je oběma podávanými GK významně snížená. Narušení placentární bariéry tvořené 11β-HSD2 jsme zaznamenali nejen u vysokých dávek GK, ale také u nízkých dávek dexametazonu. Tato pozorování naznačují, že syntetické steroidy ovlivňují aktivitu 11β-HSD2 především na posttranslační úrovni. Naše výsledky také zdůrazňují význam funkčních studií při hodnocení vlivu exogenních látek na aktivitu enzymů placentární bariéry. Souhrn
Abstract v angličtině:
SUMMARY Placenta is a unique organ which ensures a number of vital functions necessary for normal course of pregnancy and development of a new individual. In addition to its main function of oxygen supply and nutrient and waste product exchange, placenta also serves as an endocrine, metabolic and protective organ. Placenta is considered to be one of the physiological barriers of the organism which regulates transport of both endogenous and exogenous compounds between two compartments - maternal and fetal blood circulations. Up to recently, the placental barrier was supposed to be formed only by cellular layers which separate maternal and fetal blood - syncytiotrophoblast and fetal capillary endothelium. However, it has been demonstrated that the activity of placental efflux transport proteins and metabolic enzymes contributes considerably to the protective function of placental barrier. Efflux transporters are membrane proteins which actively (along with consumption of ATP) "pump" a diversity of substrates out of the cell. It has been shown that the kinetics of transport of various substances across the placenta is affected predominantly by two transporters: P-glycoprotein (P- gp) and breast cancer resistance protein (BCRP). Compared to these transporters, placental biotransformation enzymes are considered to be a minor, but an important part of active placental barrier. Several placental enzymes were suggested to have an impact on the kinetics of transplacental passage of various molecules. These are in particular: cytochrome P450 enzymes, conjugation enzymes of phase II. metabolism and enzymes involved in biotransformation of steroid molecules. In this work both components of the active placental barrier - transport and metabolic - were studied. From the group of efflux transporters we focused on BCRP transporter whose expression and activity was studied using a model of the rat placenta in-vivo and in-situ. The presence of rat BCRP mRNA and protein were confirmed in both rat placental trophoblast cell line HRP-1 and the rat placenta at the end of pregnancy. Simultaneously, we analyzed the expression of P-gp which was detected in the rat placenta but not in HRP-1 cell line. Activity of BCRP in-vitro was confirmed in accumulation studies with fluorescently labeled substrate of BCRP- BODIPY FL prazosine. In consistence with the results of expression studies no activity of P-gp was observed in the HRP-1 cell line. Furthermore, we investigated the impact of BCRP activity on the pharmacokinetics of drug transport across the placenta using dually perfused rat placenta. Transport of a model substrate of BCRP - cimetidine - was studied in both materno- fetal and feto-maternal directions. To verify the specifity of BCRP-mediated transport two BCRP inhibitors GF120918 and fumitremorgin C were used. Our results demonstrated that BCRP plays two distinct roles in the kinetics of placental transport of drugs: 1) reduces the passage of drugs from the mother to the fetus and 2) actively accelerates the excretion of the drug already present in the fetal blood. In the following two studies we investigated the expression and activity of the enzyme 11β-hydroxysteroid dehydrogenase (11β-HSD) which acts as a placental barrier to endogenous glucocorticoids (GC). In the first work we explored the role of placental 11β-HSD in the metabolism of GC in the course of rat pregnancy and the relationship between placental and fetal 11β-HSD activities and their effect on the ratio of active and inactive forms of GC in the fetal circulation. At first the expression and activity profiles of placental 11β-HSD type 1 and 2 during 13. and 21. day of pregnancy were studied. Expression of both types of 11β-HSD decreased at the end of pregnancy, however with different profiles. Dramatic decrease of mRNA levels of 11β-HSD1 was observed between 13. and 14. day of pregnancy followed by smaller reduction towards term. On the contrary, 11β-HSD2 was more abundantly expressed and decreased slowly from 13. to 21. day of gravidity. Decay of placental 11β-HSD2 in the last third of pregnancy was further confirmed on protein level. The decrease in 11β-HSD1 expression was followed by the drop in its activity. In contrast, an increase in NAD+-dependent dehydrogenase activity of 11β- HSD2 was found in placental homogenates. These observations suggest the existence of an unknown posttranslational regulation mechanism which affects the activity of placental 11β- HSD2. The results from the functional studies with dithiotreitol in-situ revealed that this mechanism is presumably distinct from the process of activation and deactivation of 11β-HSD2 by reversible dimerization. Furthermore, the levels of corticosterone and 11- dehydrocorticosterone in the fetus were investigated and correlated with the activity of placental and fetal 11β-HSD. The results suggest that the activity of fetal 11β-HSD participates considerably on the regulation of GC levels in fetal blood, particularly at the end of pregnancy. In the following study we examined the impact of antenatal GC administration on expression and conversion capacity of placental 11β-HSD type 2. Again rat placenta was chosen as an experimental model. Synthetic GC (dexamethasone and betamethasone) were administered to pregnant rats in two doses (low or high) during 16. and 21. days of pregnancy. The expression of 11β-HSD in term placentas was analyzed by real-time RT-PCR and Western blotting. Conversion capacity was assayed by dually perfused rat placenta in-situ with corticosterone as a model substrate of 11β-HSD2. Our results showed that although the impact of antenatal steroid therapy on expression of 11β-HSD2 is negligible or, in the case of dexamethasone, limited to transcriptional level, conversion capacity of this enzyme is considerably decreased. The alteration in placental GC barrier was apparent not only at high doses of GC but also at low doses of dexamethasone. These observations suggest that synthetic steroids modulate the activity of 11β-HSD2 on the post-translational level. Furthermore, these results highlight the importance of functional analysis in the investigation of the effects which various exogenous compounds could have on the activity of placental enzymes.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce PharmDr. Zuzana Vacková 7.54 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce PharmDr. Zuzana Vacková 86 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky PharmDr. Zuzana Vacková 72 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Prof.PharmDr. František Štaud, Ph.D. 53 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. PharmDr. František Trejtnar, CSc. 180 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Stanislav Mičuda, Ph.D. 98 kB