velikost textu

Stanovenie expresných markerov génov HLA II. triedy

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Stanovenie expresných markerov génov HLA II. triedy
Název v češtině:
Stanovení markerů exprese genů HLA II. třídy
Název v angličtině:
Assessment of expression markers of HLA class II genes.
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Mgr. Marta Zajacová
Vedoucí:
doc. MUDr. Marie Černá, CSc.
Oponent:
doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D.
Id práce:
71712
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Imunologie (NIMUN)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
21. 9. 2010
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Slovenština
Abstrakt:
Abstrakt ÚVOD: Molekuly HLA hrajú centrálnu úlohu v imunitnej odpovedi. HLA II. triedy sa zúčastňujú selekcie T bunkového repertoáru v týmuse a prezentácie antigénnych peptidov CD4-pozitívnym T lymfocytom. HLA II. triedy fungujú ako reštrikčné prvky v prezentácii antigénov T lymfocytom a ich expresia na povrchu buniek je nutná pre spustenie imunitných odpovedí. Regulácia transkripcie génov HLA II. triedy predstavuje komplexný systém zahŕňajúci "cis-acting" DNA sekvenciu a "trans-acting" proteínové faktory. Bol publikovaný alelový polymorfizmus regulačných oblastí génov HLA II. triedy, DQA1, DQB1 a DRB1. Väčšina polymorfizmov je uchovávaná súhlasne s haplotypom. Hierarchia sekvenčnej homológie, ktorá existuje medzi štrukturálnymi génmi, však nemá obdobu medzi ich promótorovými sekvenciami. Zaujalo nás, že najviac prekvapujúci rozpor bol nájdený pre alely viazané k DR4, DQB1*0301 a DQB1*0302, ktoré boli popísané ako časté rizikové faktory pre niektoré autoimunitné choroby. Štrukturálne gény týchto dvoch aliel sú najviac príbuzné, ale ich regulačné sekvencie sú najviac odlišné v porovnaní s ostatnými DQB1 alelami. Tieto sekvenčné rozdiely zodpovedajú funkčnej variabilite: promótorová sila DQB1*0301 alely je trikrát až štyrikrát väčšia než promótorová sila DQB1*0302 alely. Funkčná rozdielnosť medzi alelami HLA II. triedy môže byť spôsobená aj rozdielnym stupňom metylácie tejto oblasti. CIELE: Naším cieľom bolo zistiť koreláciu medzi metyláciou CpG dinukleotidov v promótore génu HLA-DQA1 a genotypom jednotlivých aliel. METÓDY: Do pilotnej štúdie bolo zaradených 89 zdravých darcov vo veku 25-45 rokov. U nich bola vykonaná genotypizácia aliel HLA II. triedy, DRB1, HLA-DQB1 a HLA-DQA1, pomocou metódy PCR so sekvenčne špecifickými primermi. Genomická DNA darcov bola konvertovaná bisulfitom a cieľový úsek v promótore génu HLA-DQA1 bol následne amplifikovaný pomocou metódy nested PCR. Produkt bol rozklonovaný do baktérií Escherichia coli, kmeň XL-1 Blue. Selekcia úspešných transformantov prebiehala na médiu s ampicilínom, IPTG a X-Gal. Výsledky selekcie boli overené metódou colony PCR. Jednotlivé klony baktérií boli následne osekvenované. VÝSLEDKY: Bola zistená rozdielna metylácia niektorých CpG miest v skúmanej oblasti: v mieste - 639 bola alela QAP 4.1 metylovaná viac než alely QAP 1.1 a 1.3; v mieste -540 bola alela QAP 3.1 metylovaná menej než alely QAP 1.1 a 1.3; v mieste -374 bola alela QAP 1.3 metylovaná menej než ostatné alely; v mieste -139 bola alela QAP 1.2 metylovaná menej než alela QAP 1.4. Rozdiel v celkovom množstve metylovaných CpG miest bol pozorovaný medzi alelou QAP 1.1, v porovnaní s alelami QAP 1.4 a 4.1. ZHRNUTIE: Bola nájdená korelácia medzi genotypom a epigenotypom promotorových aliel génu HLA-DQA1. Zistené boli rozdiely v celkovej metylácii aliel, i v metylácii jednotlivých CpG dinukleotidov. Ďalej boli popísané nové polymorfné miesta v tejto oblasti. Kľúčové slová: DNA metylácia, polymorfizmus, promótor, HLA-DQA1
Abstract v angličtině:
Abstract BACKGROUND: HLA molecules play a central role in the immune response. HLA class II are involved in the selection of the T-cell repertoire in the thymus, and in presentation of antigenic peptides to antigen reactive CD4-positive T cells. The HLA class II act as restriction determinants in the presentation of antigens to T lymphocytes and their expression on the cell surface is necessary for triggering the immune responses. Regulated transcription of HLA class II genes is a complex system involving cis-acting sequence elements and trans-acting protein factors. It has been reported that allelic polymorphism exists in the regulatory regions of HLA class II DQA1, DQB1 and DRB1 genes. Most of the polymorphisms appear to be conserved within a haplotype. The hierarchy of sequence homology which exists among the structural genes is not paralleled among their promoter sequences. It is of interest that the most striking discrepancy was found for the DR4 linked alleles, DQB1*0301 and DQB1*0302, which were described as frequent risk factors for a variety of autoimmune diseases. The structural genes of these two alleles are the most closely related, but their regulatory sequences are the most heterogeneous among DQB1 variants. These sequence differences correspond to functional variation: The promoter strength of the DQB1*0301 allele is three- to four- fold greater than the comparable one of DQB1*0302. Another cause of the functional differences between HLA class II alleles might be a different level of methylation of this region. AIMS: We aimed to determine the correlation between methylation of CpG dinucleotides in HLA- DQA1 gene promoter and their genotype. METHODS: 89 healthy donors, age 25-45 years, were included to the pilot study. The genotyping of HLA-DRB1, HLA-DQB1 and HLA-DQA1 was performed using PCR with sequence specific primers. The genomic DNA was converted by bisulfite treatment and the target segment in the promoter of HLA-DQA1 gene was amplified using nested PCR. The PCR product was cloned into Escherichia coli (XL-1 Blue). Successful transformants were selected on medium with ampicillin, IPTG and X- Gal. Succesful transformation was confirmed by colony PCR. Then sequencing of individual clones was performed. RESULTS: We found differential methylation of some CpG sites in the region studied: at site -639, QAP 4.1 allele was methylated to greater extent than QAP 1.1 and 1.3 alleles; at site -540 QAP 3.1 allele was methylated less than QAP 1.1 a 1.3 alleles; at site -374 QAP 1.3 allele was methylated less than any other allele; at site -139 allele QAP 1.2 was methylated less than QAP 1.4 allele. We observed difference in total count of methylated CpG sites in QAP 1.1 allele compared to QAP 1.4 and 4.1 alleles. CONSLUSION: We found correlation between genotype and epigenotype of promoter alleles of HLA-DQA1 gene. Differences in average methylation of alleles, and also differences in methylation state of individual CpG sites were observed. We also described new polymorphic sites in this region. Keywords: DNA methylation, polymorphism, promoter, HLA-DQA1
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Marta Zajacová 1.77 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Marta Zajacová 124 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Marta Zajacová 9 kB
Stáhnout Posudek vedoucího doc. MUDr. Marie Černá, CSc. 129 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D. 123 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby Marie Nohýnková 972 kB