velikost textu

Studium deficitu lidské F1Fo-ATPsyntázy

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium deficitu lidské F1Fo-ATPsyntázy
Název v angličtině:
Human F1Fo-ATPsynthase deficiency
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Mgr. Bc. Sabina Suldovská
Vedoucí:
Ing. Markéta Tesařová, Ph.D.
Oponent:
Ing. Leona Černá, PhD.
Id práce:
69341
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Buněčná a vývojová biologie (NBUNVYB)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
24. 9. 2010
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
biogeneze, BN-PAGE, F1FO-ATPsyntáza, enzymové aktivity komplexů dýchacího řetězce, mitochondrie, mitochondriální onemocnění, mutace, oligomycin-senzitivní ATP-hydrolytická aktivita F1FO-ATPsyntázy, OXPHOS, SDS-PAGE
Klíčová slova v angličtině:
biogenesis, BN-PAGE, F1FO-ATPsynthase, enzymatic activities of the respiratory chain complexes, mitochondria, mitochondrial disorders, mutations, oligomycin-sensitive ATP-hydrolytic activity of the F1FO-ATPsynthase, OXPHOS, SDS-PAGE
Abstrakt:
Abstrakt F1FO-ATPsyntáza je klíčovým enzymem buněčného energetického metabolismu. Její případný deficit může být způsoben mutacemi ve dvou strukturních genech MT-ATP6 a MT- ATP8 v mitochondriální DNA či v jaderných genech ATPAF2 a TMEM70 kódující faktory pro biogenezi enzymu a strukturním genu ATP5E. Deficit F1FO-ATPsyntázy vede k rozvoji velmi závažného fenotypu postihující orgány s vysokými energetickými nároky s nástupem v novorozeneckém věku a nepříznivou prognózou. Mutace v uvedených genech navíc nezpůsobují pouze kvalitativní (mutace ve strukturních podjednotkách enzymu) či kvantitativní (mutace v genech pro faktory biogeneze enzymu) defekty, ale také jejich kombinace. Při studiu molekulární podstaty mitochondriálních onemocnění včetně deficitu F1FO-ATPsyntázy se využívá široká škála biochemických i molekulárně-genetických metod pro stanovení správné diagnózy, která je nezbytná pro včasné zahájení symptomatické léčby a genetické poradenství v postižených rodinách. Cílem diplomové práce bylo charakterizovat deficit F1FO-ATPsyntázy v izolovaných mitochondriích z linií kultivovaných buněk stanovením oligomycin-sensitivní ATP- hydrolytické aktivity F1FO-ATPsyntázy, enzymových aktivit komplexů dýchacího řetězce a sledováním změn v množství jednotlivých vybraných podjednotek a celého komplexu F1FO- ATPsyntázy v porovnání s kontrolami. Po optimalizaci metody stanovení oligomycin- sensitivní ATP-hydrolytické aktivity F1FO-ATPsyntázy byly charakterizovány 3 buněčné linie HEK293 se stabilně sníženou expresí genu TMEM70 a 16 buněčných linií kožních fibroblastů od pacientů s podezřením na deficit F1FO-ATPsyntázy. V izolovaných mitochondriích z buněk HEK293 se stabilně sníženou expresí genu TMEM70 byl nalezen pokles oligomycin- senzitivní ATP-hydrolytické aktivity na 25-86% kontrolních hodnot. Snížená ATP- hydrolytická aktivita byla nalezena také v izolovaných mitochondriích z 10 buněčných linií kožních fibroblastů. U 4 liníí fibroblastů s mutací 317-2A>G v genu TMEM70 výrazně snížená aktivita F1FO-ATPsyntázy (43% kontroly) korelovala i se sníženým množstvím podjednotek (α, β, d, OSCP) a holoenzymu F1FO-ATPsyntázy. Navíc enzymové aktivity komplexů dýchacího řetězce dosahovaly >100% kontrolních hodnot a nárůst byl potvrzen i na proteinové úrovni. 6 buněčných linií fibroblastů od pacientů s podezřením na deficit F1FO- ATPsyntázy vykazovalo nízkou oligomycin-senzitivní ATP-hydrolytickou aktivitu (43-76% kontroly), ale množství vybraných podjednotek a holoenzymu F1FO-ATPsyntázy bylo srovnatelné s kontrolou. V genech MT-ATP6 a MT-ATP8 nebyla nalezena patogenní mutace. Závěrem lze říci, že optimalizovaná metoda pro spektrofotometrické stanovení oligomycin-sensitivní ATP-hydrolytické aktivity F1FO-ATPsyntázy v izolovaných mitochondriích z kultivovaných buněk byla úspěšně použita jak v buněčných modelech deficitu F1FO-ATPsyntázy, tak i v liniích kožních fibroblastů od pacientů s podezřením na deficit tohoto enzymu a rozšiřuje tak spektrum metod vhodných pro diagnostiku mitochondriálních onemocnění.
Abstract v angličtině:
Abstract F1FO-ATPsynthase is a key enzyme in energy metabolism of the cell. Its deficit is caused usually by mutations in two structural genes MT-ATP6 and MT-ATP8 encoded by the mitochondrial DNA or in nuclear genes ATPAF2 and TMEM70 encoding the biogenesis factors and structural gene ATP5E. Deficiency of the F1FO-ATPsynthase leads to progressive and serious phenotype affecting organs with high energy demands. The first symptoms usually occurs in neonatal age and prognosis of the disease is fatal. Mutations in these genes result in both qualitative and quantitative defects of the F1FO-ATPsynthase. The study of molecular bases of mitochondrial disorders including F1FO-ATPsynthase deficiency uses large number of biochemical and molecular-genetic methods to determine a proper diagnosis which is essential for the symptomatic therapy and genetic counselling in affected families. The aim of the diploma thesis was to characterise the F1FO-ATPsynthase deficiency in isolated mitochondria from the lines of cultured cells by the determination oligomycin- sensitive ATP-hydrolytic activity of the F1FO-ATPsynthase, enzymatic activities of the respiratory chain complexes and to analyse changes in the steady-state levels of the representative subunits and whole complex of the F1FO-ATPsynthase in comparison with controls. 3 cell lines HEK293 with stably down-regulated expression of the TMEM70 gene and 16 cell lines of the skin fibroblasts from patients with the suspicion of the F1FO- ATPsynthase deficiency were characterised by the optimalized method for the measurement of the oligomycin-sensitive ATP-hydrolytic activity. In isolated mitochondria from HEK293 cells with stably down-regulated TMEM70 gene, the decrease in the oligomycin-sensitive ATP-hydrolytic activity among 25-86% of control values was found. Decreased ATP- hydrolytic activity was found in isolated mitochondria from 10 cell lines of the skin fibroblasts as well. Markedly decreased activity of the F1FO-ATPsynthase (43% of the control) in 4 fibroblasts lines with mutation 317-2A>G in TMEM70 gene correlated with decreased abundance of the subunits (α, β, d, OSCP) and holoenzyme F1FO-ATPsynthase. Furthermore enzymatic activities of the respiratory chain complexes reached up >100% of control values and the increase was in corcondance with increased steady-state levels of corresponding subunits. In 6 fibroblasts lines from patients with suspicion of the F1FO- ATPsynthase deficiency, decreased oligomycin-sensitive ATP-hydrolytic activity (43-76% of the controls) was observed but no changes in the abundance of the representative subunits and holoenzyme F1FO-ATPsynthase were found out. In MT-ATP6 and MT-ATP8 genes, no pathogenic mutations were detected. In conclusion, the optimalized method to determinate oligomycin-sensitive ATP- hydrolytic activity of the F1FO-ATPsynthase in isolated mitochondria from cultivated cells was applied with success in the cell models as in lines of the skin fibroblasts from patient with suspicion of the F1FO-ATPsynthase deficiency. It could spread the spectrum of proper methods for diagnostics of the mitochondrial disorders.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Bc. Sabina Suldovská 2.31 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Bc. Sabina Suldovská 70 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Bc. Sabina Suldovská 65 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Ing. Markéta Tesařová, Ph.D. 29 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Leona Černá, PhD. 123 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Petr Folk, CSc. 125 kB