velikost textu

Functional analysis of syntaxin 16 phosphorylation using yeast as a model

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Functional analysis of syntaxin 16 phosphorylation using yeast as a model
Název v češtině:
Funkční analýza fosforylace syntaxinu 16 za použití kvasinkového modelu
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Mgr. Barbora Volfová
Vedoucí:
prof. RNDr. Gustav Entlicher, CSc.
Oponent:
doc. RNDr. Petr Dráber, DrSc.
Konzultant:
doc. RNDr. Jiří Novotný, DSc.
Id práce:
66054
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (N1406)
Obor studia:
Biochemie (NBIOD)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
31. 5. 2011
Výsledek obhajoby:
Dobře
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
Membránová fúze, SNARE, Syntaxin, Tlg2p, Sec1p/Munc18, Vps45p, Endocytóza
Klíčová slova v angličtině:
Membrane fusion, SNARE, Syntaxin, Tlg2p, Sec1p/Munc18, Vps45p, Endocytosis
Abstrakt:
Abstrakt Mechanismus fúze intracelulárních membrán v eukaryotických buňkách zahrnuje několik skupin proteinů, včetně rodiny receptorů pro záchytný protein rozpusného N-ethylmaleinimid-senzitivního-faktoru (SNARE) a Sec1/Munc-18 příbuzných proteinů (SM proteinů). Je známo, že transport v buňkách je evolučně konzervovaný od kvasinek po člověka. Proto pro usnadnění výzkumu, můžeme použít jednoduché eukaryotní buňky Saccharomyces cerevisiae. Savčí SNARE protein syntaxin 16 má známý funkční kvasinkový homolog, protein Tlg2p, který byl použit v této studii jako model pro studium vlivu fosforylace na funkci syntaxinu 16. Také jejich vazebné partnery, SM proteiny mVps45p (savčí) a kvasinkový Vps45p, jsou homologní. Fosforylace SNARE proteinů je známá jako možný způsob regulace fúze membrán. Odstranění jednoho z možných fosforylačních míst na Tlg2p - serinu 90 významně ovlivňuje exocytické a endocytické pochody. Práce prezentovaná v této studii ukazuje některé fenotypy mutant založených na tomto fosforylačním místě proteinu Tlg2p. Těmi mutantami jsou S90A (nefosforylovatelná – mutace serinu na alanin) a S90D (fosfomimetická – mutace serinu na asparagovou kyselinu – kyselá karboxylová skupina napodobuje fosfátovou skupinu). Bylo zjištěno, že fosforylace proteinu Tlg2p na serinu 90 neboli mutace Tlg2p- S90D může hrát jistou roli v ochraně proteinu Tlg2p před degradaci nezávislou na Pep4p pravděpodobně pomocí proteazomu. V nepřítomnosti genu PEP4, kdy je zabráněno vakuolární degradaci, je účinek proteazomu vidět jasněji. Protein Pep4p je vakuolární proteáza v kvasinkách zodpovědná za degradaci mnoha bílkovin. Ostatní výsledky také ukazují, že fosforylace Ser90 na Tlg2p neboli S90D fosfomimetická mutace může stabilizovat interakci mezi proteiny Tlg2p a Vps45p, a tím stabilizovat množství Tlg2p v buňce. Bylo také prokázáno, že fosforylace nemá žádný dopad na transport karboxypeptidázy Y a na citlivost na solný/osmotický stres. Dále jsme také ukázali, že je možné připravit in vitro hybridní SNARE komplex obsahující savčí syntaxin 16 a kvasinkové proteiny Tlg1p, Vti1p a Snc2p, a že tento komplex je schopen vázat protein Vps45p v podobném množství jako kvasinkový SNARE complex s proteinem Tlg2p jakožto syntaxinovou částí komplexu. Tato zjištění mohou být velmi užitečná pro budoucí výzkum syntaxinu 16 a samotného transportu v savčích buňkách. (In English) Klíčová slova: Fúze membrán, SNARE, Syntaxiny, Tlg2p, Sec1p/Munc18, Vps45p, Endocytoza 3
Abstract v angličtině:
Abstract Mechanism of fusion of intracellular membranes in eukaryotic cells involves several protein families including soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment protein receptor (SNARE) proteins and Sec1/Munc-18 related proteins (SM proteins). It is known that the transport is evolutionary conserved from yeast to man. Therefore for facilitating of the research, we can use simple eukaryotes Saccharomyces cerevisiae. Mammalian SNARE protein syntaxin 16 has a yeast homologue Tlg2p which is used in this study as a model for studying affects of phosphorylation to the syntaxin 16 function. Also their binding partners, SM proteins mVps45p (mammalian) and yeast Vps45p are homologous. Phosphorylation of SNARE proteins is known as a possible way of regulation of membrane fusion. Abolishment of one of the putative phosphorylation sites in Tlg2p protein, serine 90 leads to dominant effects on the exocytic and endocytic pathways. The work presented in this study shows some phenotypes of mutants based on this phosphorylation site of protein Tlg2p. Those mutants are S90A (cannot be phosphorylated) and S90D (phosphomimetic – acid carboxyl group mimics phosphate group). It was revealed that the phosphorylation of Tlg2p protein at serine 90 or the mutation Tlg2p-S90D may play some role in protecting Tlg2p protein from non-Pep4-dependent degradation, possibly by the proteasome. In the absence of PEP4, when the vacuolar degradation is prevented, the effect of the proteasome can be seen more clearly. Protein Pep4p is a vacuolar protease in yeast responsible for degradation of many yeast proteins. Other results also suggest that phosphorylation of Ser90 on Tlg2p or the S90D phosphomimetic mutation may stabilise the interaction between Tlg2p protein and Vps45p protein, and therefore stabilise the levels of Tlg2p in cell. It was also shown that phosphorylation has no impact on trafficking of carboxypeptidase Y phenotype and salt/osmotic stress sensitivity phenotype. We also showed that it is possible to prepare in vitro hybrid SNARE complex containing mammalian protein syntaxin 16 and yeast proteins Tlg1p, Vti1p and Snc2p and that this complex is able to bind similar amounts of Vps45p protein as yeast SNARE complex with Tlg2p protein as a syntaxin part. These findings may be very usefull for future research of syntaxin 16 and the trafficking in mammalian cells. (In English) Key words: Membrane fusion, SNARE, Syntaxins, Tlg2p, Sec1p/Munc18, Vps45p, Endocytosis 4
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Barbora Volfová 1.08 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Barbora Volfová 19 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Barbora Volfová 9 kB
Stáhnout Posudek vedoucího prof. RNDr. Gustav Entlicher, CSc. 81 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Petr Dráber, DrSc. 114 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. 81 kB
Stáhnout Errata Mgr. Barbora Volfová 97 kB