velikost textu

Moderní reverzní stacionární fáze na bázi silikagelu, oxidu zirkoničitého a organických monolitů:využití v analýze biologicky aktivních látek

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Moderní reverzní stacionární fáze na bázi silikagelu, oxidu zirkoničitého a organických monolitů:využití v analýze biologicky aktivních látek
Název v angličtině:
Modern reverse stationary phases based on silicagel, zirconium dioxide and organic monoliths: application to analysis of biologically active compounds
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Klára Soukupová, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Jana Sobotníková, Ph.D.
Oponenti:
prof. RNDr. Věra Pacáková, CSc.
doc. RNDr. Josef Cvačka, Ph.D.
Konzultant:
prof. RNDr. Eva Tesařová, CSc.
Id práce:
32371
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra analytické chemie (31-230)
Program studia:
Analytická chemie (P1403)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
7. 10. 2008
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie Moderní reverzní stacionární fáze na bázi silikagelu, oxidu zirkoničitého a organických monolitů; využití v analýze biologicky aktivních látek Synopse k disertační práci Praha 2008 Klára Soukupová Tato disertační práce byla vypracována na Katedře analytické chemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze v letech 2003 – 2008. Autor: Mgr. Klára Soukupová Školitelé: RNDr. Jana Suchánková-Sobotníková, Ph.D Doc. RNDr. Eva Tesařová, CSc. Praha 2008 OBSAH 1. Úvod 2 2. Cíle disertační práce 3 3. Výsledky a diskuze 4 4. Shrnutí 12 5. Citace 14 Příloha 1: Seznam publikací, přednášek a plakátových sdělení 15 Příloha 2: Curriculum Vitae 17 1 1. Úvod Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je moderní instrumentální metodou se širokým spektrem využití převážně v oblasti aplikací analytické chemie. Z běžně používaných separačních módů je nejdominantnější reverzní kapalinová chromatografie (RP HPLC). Tato metoda je velmi žádaná především díky své separační účinnosti, spolehlivosti a velkému výběru stacionárních fází s odlišnými vlastnostmi. Nejpoužívanější stacionární fáze v RP HPLC jsou chemicky vázané fáze, které mají řadu výhod, mezi které patří jejich dobrá dostupnost, velké aplikační pole, rychlé ustavování rovnováhy a možnost kombinace s vodnými mobilními fázemi1. Klasickým nosičem těchto fází je silikagel. Silikagel má mnoho výhod (např. nesmršťuje se, nebobtná), ale na druhé straně vykazuje omezenou chemickou a teplotní stabilitu2. Na základě těchto faktů je snahou modifikovat silikagel3 nebo jej 5 nahradit zcela jiným nosičem, např. oxidem zirkoničitým4, nebo organickými polymery6. Samostatnou skupinu moderních stacionárních fází tvoří materiály na bázi silikagelových a organických monolitů. Nová generace reverzních stacionárních fází vykazuje lepší stabilitu, jak chemickou, tak teplotní, vyšší selektivitu a separační účinnost. Hlavní předností těchto fází je, že jsou na nich výrazně potlačeny nežádoucí interakce typické pro látky bazické povahy. Významným trendem je v současné době miniaturizace nejen kolon, ale i ostatních částí 8. kapalinového chromatografu7, Výhodou miniaturizované HPLC, např. kapilární kapalinové chromatografie (cLC), je velmi malá spotřeba vzorku, malý průtok mobilní fáze, s tím spojená její nižší spotřeba, a menší chromatografické zředění vzorku v koloně, což přináší vyšší citlivost detekce. V cLC se používají kolony, respektive stacionární fáze jako v klasické HPLC, ale liší se velikostí vnitřního průměru, délkou kolony, případně velikostí částic a pórů sorbentu. RP HPLC a RP cLC jsou důležité a účinné metody identifikace a kvantifikace peptidů a proteinů, jejich derivátů nebo jejich metabolitů. Peptidy a proteiny jsou častým předmětem bioanalytického, farmaceutického a lékařského výzkumu, proto se úkolem analytického chemika stává vývoj účinné a vysoce selektivní separační metody, která umožní dělení velmi složitých směsí biologicky aktivních látek. Tato disertační práce je zaměřena na studium chromatografického chování vybraných biologicky aktivních pentapeptidů a nonapeptidů na třech odlišných typech stacionárních fází. 2 2. Cíle disertační práce V disertační práci byla pozornost zaměřena na studium chromatografického chování vybraných biologicky aktivních pentapeptidů a nonapeptidů (Tabulka 2.1) na různých reverzních stacionárních fázích (Tabulka 2.2), a to na bázi silikagelu, oxidu zirkoničitého a organických monolitů, v různých systémech mobilní fáze. Na základě získaných dat byly stacionární fáze kriticky porovnány a byla zhodnocena vhodnost jejich použití respektive jejich omezení pro analýzu peptidů. Tabulka 2.1 Přehled použitých pentapeptidů a nonapeptidů. Pentapeptidy Sekvence aminokyselin methionin5–enkefalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Met leucin5–enkefalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu D–alanin2,leucin5–enkefalin Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu leucin5–enkefalinamid Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuNH2 Nonapeptidy Sekvence aminokyselin arginin8–vasopresin (AVP) Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-GlyNH2 lysin8–vasopresin (LVP) Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-GlyNH2 oxytocin (OXT) Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-GlyNH2 arginin8–oxytocin (AVT, vasotocin) Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-GlyNH2 isotocin (ISO) Cys-Tyr-Ile-Ser-Asn-Cys-Pro-Ile-GlyNH2 deaminoCys1,D–arginin–vasopresin Mpa*-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-GlyNH2 (dDAVP, desmopresin) * 3–merkaptopropionová kyselina; Vasopresinové analogy mají mezi Cys 1 a Cys 6 disulfidický můstek. Tabulka 2.2 Přehled testovaných kolon a jejich fyzikálně–chemických vlastností. Velikost Specifický Teplotní Vázaná Kolona Nosič Tvar částic pórů povrch limit Rozsah pH fáze (Å) (m2/g) (°C) Supelcosil silikagel C18 kulovitý 120 170 60 2–7 C18 Discovery pentafluor– silikagel kulovitý 120 300 70 2–8 HS F5 fenylpropyl Discovery poly– ZrO2 kulovitý 300 30 150 1–13 Zr PBD butadien kompaktní Monolit – – 200 24 – – materiál Monolity jsou novým materiálem a všechny jeho vlastnosti nebyly ještě potvrzeny, proto jsou některé kolonky nevyplněné 3 3. Výsledky a diskuse Experimentální výsledky popsané a shrnuté v disertační práci lze rozdělit do 4 částí. V první části je popsán Waltersův test a jeho výsledky získané pro použité stacionární fáze. Další 3 části se dělí podle typu stacionární fáze, která byla použita pro studium chromatografického chování vybraných pentapeptidů a nonapeptidů. V druhé části jsou tedy popsány výsledky chromatografického chování peptidů na komerčně dostupných reverzních stacionárních fází na bázi silikagelu, konkrétně na kolonách Supelcosil C18 a Discovery HS F5. Třetí část tvoří výsledky získané s využitím moderní komerčně dostupné fáze na bázi oxidu zirkoničitého, Discovery Zr PBD a ve čtvrté části byl využit butyl-methakrylátový monolit jako stacionární fáze pro cLC, který byl připraven na Katedře analytické chemie PřF UK v Praze. 3.1 Waltersův test K charakterizaci a klasifikaci stacionárních fází byla navržena řada testovacích metod. Důvodem pro testování fází je jejich velká variabilita a obtíže při výběru fází pro separaci především problematických analytů, např. bazických látek. Před započetím experimentů byly všechny používané kolony otestovány Waltersovým testem, který slouží k charakterizaci stacionárních fází na základě dvou převládajících interakcí v RP HPLC, hydrofobní a polární interakce. Na základě tohoto testu bylo zjištěno, že vybrané stacionární fáze mají rozdílné hodnoty hydrofobního indexu (HI) a liší se i ve své polaritě (SI) (obr. 3.1.1). Tento výběr kolon s odlišnými vlastnostmi vytváří prostor k dobré charakterizaci separačního chování vybraných peptidů a vytváří prostor pro možnou dvou (více) dimenzionální separaci. 8 Supelcosil C18 7 Discovery HS F5 Discovery Zr PBD Monolit 6 Hodnoty parametrů 5 4 3 2 1 0 Hydrofóbní index Silanolový index Obr 3.1.1 Srovnání kolon podle dosažených hodnot hydrofobního indexu a indexu polarity. Dále byl Waltersův test prováděn po skončení jednotlivých optimalizačních kroků, tedy vždy po skončení používání vybrané pufrované mobilní fáze. Z výsledků vyplývá, že používané pufry, 4 vodné složky mobilní fáze, neměly výrazný vliv na vlastnosti (HI, SI) testovaných kolon. Jedinou výjimkou byla zirkoniová kolona Discovery Zr PBD, kde vlivem používaných pufrů, fosforečnanového a octanového, v mobilní fázi došlo k poklesu HI (o 25 %) a nárůstu indexu polarity (o 31 %). 3.2 Silikagelové stacionární fáze První celek tvoří experimenty prováděné na silikagelových komerčně dostupných stacionárních fázích. Jedná se o kolony Supelcosil C18 a Discovery HS F5 od firmy Supelco (Bellefonte, PA, USA). První zmiňovaná kolona je klasická C18 kolona, speciálně deaktivovaná pro analýzu bazických látek. Druhá kolona Discovery HS F5 je relativní novinkou na trhu. Jde o silikagelovou stacionární fázi s navázanou pentafluorfenylpropylovou skupinou. Tento typ kolon vykazuje, dle údajů výrobce, dobré tvary píků, velkou stabilitu a kompatibilitu s MS detekcí. Na obou kolonách bylo sledováno chromatografické chování vybraných pentapeptidů a nonapeptidů v různých mobilních fázích, které byly tvořeny organickou složkou, acetonitrilem (ACN), a vodnou složkou, fosforečnanovým, octanovým nebo mravenčanovým pufrem. Cílem bylo dosáhnout rychlé a účinné separace studovaných analytů. 3.2.1 Pentapeptidy První skupinu studovaných analytů tvoří směs 4 pentapeptidů (viz. Tabulka 2.1). Pro nalezení podmínek, vhodných pro separaci této směsi, byly postupně optimalizovány následující parametry: pH a koncentrace pufru, jako vodné složky mobilní fáze, a také poměr organické složky, ACN, a vybraného pufru. Vyhodnocením naměřených dat bylo zjištěno, že směs pentapeptidů byla nejlépe separována v mobilní fázi obsahující ACN-5·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr pH 5,0 22/78 (v/v) na koloně Supelcosil C18. Separace směsi na této koloně proběhla do 7 min (Obr. 3.2.1.1 A) a všechny sledované parametry separace byly vyhovující (rozlišení (Rs) ≥ 2,8; symetrie píků (As) ≤ 1,3; účinnost vyjádřená počtem pater na metr kolony (tp/m) ~ 38 000). Směs pentapeptidů byla na koloně Discovery HS F5 nejlépe separována v mobilní fázi ACN-8·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr pH 4,5 22/78 (v/v) (Obr. 3.2.1.1 B). V této mobilní fázi separace proběhla do 10 min s dostatečným rozlišením (Rs ≥ 2,8) a symetrií (As ≤ 1,7). Vypočítaná účinnost separace, vyjádřená počtem pater na metr kolony, se pohybovala okolo 26 000 v závislosti na analytu. Porovnáním získaných výsledků byla pro separaci směsi pentapeptidů nesporně lepší kolona Supelcosil C18, tedy klasická C18 stacionární fáze. 5 70 160 3 4 A B 60 3 2 140 2 120 50 Odezva, mAU Odezva, mAU 100 40 5 5 80 30 60 20 1 40 4 10 20 1 0 0 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 t, min t, min Obr. 3.2.1.1 A Obr. 3.2.1.1 B Optimalizovaná separace směsi enkefalinů na koloně Optimalizovaná separace směsi enkefalinů na koloně Supelcosil C18; mobilní fáze ACN–5·10-2 mol·dm-3 Discovery HS F5; mobilní fáze ACN–8·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr pH 5,0 22/78 (v/v) fosforečnanový pufr pH 4,5 22/78 (v/v) Experimentální podmínky: teplota 25 °C; průtok 1 ml/min; dávkování 10 µl; UV detekce 214 nm. Identifikace píků: (1) uracil; (2) D–Ala,Leu–enkefalin; (3) Met–enkefalin; (4) Leu–enkefalin; (5) Leu–enkefalinamid 3.2.2 Nonapeptidy Druhou skupinou analytů, u kterých bylo studováno retenční chování, byly vybrané nonapeptidy (viz Tabulka 2.1). Jde o látky strukturně odlišné od pentapeptidů. Struktura nonapeptidů je tvořena cyklickou částí uzavřenou disulfidickým můstkem a zbývajícími 3 aminokyselinami, které tvoří volný a pro interakce dobře přístupný konec. Analogicky jako v případě enkefalinů byl nejprve sledován vliv pH a koncentrace použitých pufrů, a vliv poměru ACN a pufrů v mobilní fázi na retenční chování studovaných nonapeptidů – vasopresinů. Vodné složky mobilní fáze byly tvořeny fosforečnanovým a octanovým pufrem. Vyhodnocením získaných výsledků byly jako nejvhodnější systémy pro separaci směsi nonapeptidů vybrány tyto: kolona Supelcosil C18 ACN-1·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr pH 4,5 18/82 (v/v) ACN-3·10-2 mol·dm-3 octanový pufr pH 5,0 20/80 (v/v) kolona Discovery HS F5 ACN-7·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr pH 6,5 20/80 (v/v) ACN-5·10-2 mol·dm-3 octanový pufr pH 6,5 21/79 (v/v) 6 Z výsledků pro kolonu Supelcosil C18 vyplývá, že výsledné mobilní fáze mají při použití rozdílných pufrů podobné hodnoty pH, koncentrace i poměru ACN a pufru, ale výsledné separace se značně liší. Separace v mobilní fázi ACN-fosforečnanový pufr se podařila do 26 min, ale nedošlo k rozdělení Arg- a Lys-vasopresinu (Rs ~ 0,6). V systému ACN-octanový pufr nedošlo ani v optimalizované mobilní fázi k oddělení isotocinu od uracilu (tm), ostatní analyty byly rozděleny do 10 min s dostatečným rozlišením (Rs ≥ 1,2). V této mobilní fázi se změnilo eluční pořadí analytů isotocinu, oxytocinu a desmopresinu oproti mobilní fázi ACN-fosforečnanový pufr. Tento fakt ukazuje na odlišnou selektivitu separačního systému kolony Supelcosil C18 a mobilní fáze ACN-octanový pufr. Vypočítaná účinnost byla v rozmezí 15 000 – 22 000 tp/m v závislosti na analytu pro mobilní fázi ACN-fosforečnanový pufr a 18 000 – 24 000 tp/m v závislosti na analytu pro mobilní fázi ACN- octanový pufr. Výsledky na koloně Discovery HS F5 ukazují, že v mobilní fázi ACN-fosforečnanový pufr došlo k rozdělení všech 6 vasopresinů do 18 min s dostatečným rozlišením (Rs ≥ 1,8) a dobrou symetrií píků (As ≤ 1,3). Ve druhé mobilní fázi tvořené ACN-octanovým pufrem se nepodařilo úplně rozdělit analyty isotocin a Arg-vasotocin a Lys- a Arg-vasopresin až na základní linii. V této mobilní fázi opět došlo ke změně elučního pořadí, kdy isotocin eluoval jako první. Vypočítaná účinnost byla v rozmezí 37 000 – 47 000 tp/m v závislosti na analytu pro mobilní fázi ACN-fosforečnanový pufr a 17 000 – 30 000 tp/m v závislosti na analytu pro mobilní fázi ACN-octanový pufr. Z dosažených výsledků vyplývá, že nejvhodnější pro separaci směsi vasopresinů se jeví kolona Discovery HS F5 a mobilní fáze ACN-7·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr pH 6,5 20/80 (v/v) viz Obr. 3.2.2.1. Dalším vysledovaným faktem je značná nestabilita základní linie při použití mobilní fáze obsahující octanový pufr, což je dáno velkou UV absorpcí tohoto pufru. 120 2 100 80 Odezva, mAU 60 40 3 4 6 20 7 5 1 0 0 5 10 15 20 t, min Obr. 3.2.2.1 Optimalizovaná separace směsi vasopresinů na koloně Discovery HS F5; mobilní fáze ACN-7·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr pH 6,5 20/80 (v/v); teplota 25 °C; průtok 1 ml/min; dávkování 10 µl; UV detekce 214 nm. Identifikace píků: (1) uracil; (2) Arg-vasotocin; (3) Lys-vasopresin; (4) Arg-vasopresin; (5) isotocin; (6) oxytocin; (7) desmopresin. 7 3.3 Zirkoniová stacionární fáze Přínos zirkoniových kolon spočívá především v jejich vynikající chemické stabilitě a jejich teplotní stabilitě. Separační mechanismus je zcela odlišný od silikagelových kolon a je založen na Lewisově teorii kyselin a zásad. Zirkoniová kolona Discovery Zr PBD byla použita pro optimalizaci separace směsí pentapeptidů a nonapeptidů s mobilními fázemi obsahujícími ACN nebo MetOH jako organickou složku a fosforečnanový nebo octanový pufr jako vodnou složku. Tyto pufry, zvláště fosforečnanový, působí jako silné lewisovské báze, které na těchto stacionárních fázích vykazují vysokou eluční sílu. Teplota byla zařazena jako další optimalizační parametr, protože zirkoniové kolony vykazují větší teplotní stabilitu v porovnání se silikagelovými stacionárními fázemi. 3.3.1 Pentapeptidy Zirkoniové kolony jsou na trhu relativní novinkou, proto nebyl v odborné literatuře nalezen žádný odkaz týkající se zirkoniových fází a separace peptidů. Z tohoto důvodu byl jako první zkoušen vliv organického modifikátoru, ACN a MetOH, na retenční chování analytů. Byly pozorovány velké rozdíly mezi oběma testovanými modifikátory (Obr. 3.3.1.1). Z obrázku je patrné, že v mobilní fázi obsahující MetOH došlo ke značnému prodloužení retenčních časů a píky byly nesymetrické. Na základě naměřených výsledků byl pro další měření jako organický modifikátor používán ACN. 160 methanol Obr. 3.3.1.1 2 140 3 acetonitril Vliv organického modifikátoru na retenční chování 120 studovaných analytů. Mobilní fáze obsahovala MetOH / Odezva, mAU 100 5 80 4 ACN a 5·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr o pH 2,0 50/50 60 (v/v); teplota 25 °C; průtok 1 ml/min; dávkovaný objem 1 40 2 10 µl; UV detekce 214 nm. Identifikace píků : (1) uracil, (2) 5 20 3 4 D-Ala-Leu-enkefalin, (3) Met-enkefalin, (4) Leu-enkefalin, 0 (5) Leu-enkefalinamid 0 5 10 15 20 25 30 35 t, min Dále bylo optimalizováno pH a koncentrace fosforečnanového pufru, a poměr ACN a tohoto pufru v mobilní fázi. Jak již bylo uvedeno, zirkoniové stacionární fáze jsou díky svým vlastnostem vhodné pro použití za vyšší teploty, proto byla sledována i teplota jako další optimalizační parametr. Z výsledků optimalizace vyplývá, že nejvhodnější podmínky pro separaci směsi 4 pentapeptidů na zirkoniové koloně jsou ACN-5·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr pH 2,0 45/55 (v/v) při teplotě 70 °C (Obr. 3.3.1.2). Za těchto podmínek došlo k rozdělení všech 4 enkefalinů téměř na základní linii do 7 min (Rs 1,9-2,9; As ≤ 1,4; tp/m ~ 20 000). Oproti silikagelové koloně Supelcosil C18 došlo 8 k záměně elučního pořadí D-Ala, Leu-enkefalinu, který na silikagelové koloně eluuje jako druhý v pořadí a na koloně Discovery Zr PBD jako předposlední. Výhodou zirkoniové kolony Discovery Zr PBD je možnost použití silně kyselé mobilní fáze (pH 2,0) bez nebezpečí poškození kolony, jak je tomu u silikagelových kolon. 180 Obr. 3.3.1.2 3 160 2 140 Optimalizovaná separace směsi enkefalinů na koloně Discovery 120 5 Zr PBD; mobilní fáze ACN-5·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr Odezva, mAU 100 pH 2,0 45/55 (v/v); teplota 70 °C; průtok 1 ml/min; dávkování 4 80 10 µl; UV detekce 214 nm. Identifikace píků: (1) uracil; (2) Met- 60 1 40 enkefalin; (3) Leu-enkefalin; (4) D-Ala,Leu-enkefalin; (5) Leu- 20 enkefalinamid. 0 0 2 4 6 8 t, min 3.3.2 Nonapeptidy Druhou skupinou peptidů, u kterých byl na koloně Discovery Zr PBD studován vliv optimalizačních parametrů (pH, typ a koncentrace pufru, poměr ACN a pufru) na retenční chování, byly nonapeptidy. Mobilní fáze byla složena z ACN, jako organického modifikátoru, a vodné složky, reprezentované fosforečnanovým nebo octanovým pufrem. Z naměřených dat vyplývá, že v testovaných systémech mobilních fází bylo dosaženo úspěšné separace nonapeptidů na koloně Discovery Zr PBD, konkrétně v těchto mobilních fázích: ACN-7·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr pH 10,0 18/82 (v/v), teplota 50 °C (Obr. 3.3.2.1 A) ACN-6·10-2 mol·dm-3 octanový pufr pH 6,5 18/82 (v/v), teplota 40 °C (Obr. 3.3.2.1 B) Z porovnání chromatogramů vyplývá, že mobilní fáze obsahující ACN-fosforečnanový pufr je pro separaci nonapeptidů výhodnější. Isotocin sice eluoval v mrtvém čase (tm), ale ostatních 5 analytů bylo separováno do 7 min s dobrým rozlišením (Rs min 2,9), symetrií píků (As max 2,0) a vypočítaná účinnost kolony se pohybovala v rozmezí 24 000 – 33 000 tp/m v závislosti na analytu. Separace všech 6 vasopresinů v mobilní fázi obsahující ACN-octanový pufr proběhla do 20 min, ale píky nemají příliš dobrou symetrii (As 1,1 – 2,9), na druhé straně došlo k částečnému oddělení isotocinu od uracilu (tm). V mobilní fázi obsahující octanový pufr je opět patrný výraznější šum základní linie, a proto je i celková odezva detektoru podstatně nižší. Vypočítaná účinnost kolony pro tuto mobilní fázi byla v rozmezí 5 000 – 22 000 tp/m v závislosti na analytu. 9 70 4 4 A B 60 3 7 4 50 Odezva, mAU Odezva, mAU 2 1 40 6 2 3 1+2 30 7 5 6 5 20 0 10 0 0 2 4 6 8 0 5 10 15 20 čas, min t, min Obr. 3.3.2.1 A Obr. 3.3.2.1 B Optimalizovaná separace směsi vasopresinů na koloně Optimalizovaná separace směsi vasopresinů na koloně Discovery Zr PBD; mobilní fáze ACN-7·10-2 mol·dm-3 Discovery Zr PBD; mobilní fáze ACN-6·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr pH 10,0 18/82 (v/v) teplota 50 °C octanový pufr pH 6,5 18/82 (v/v) teplota 40 °C Experimentální podmínky: průtok 1ml/min; dávkování 10 µl; UV detekce 214 a 230 nm. Identifikace píků: (1) uracil; (2) isotocin; (3) oxytocin; (4) Arg-vasotocin; (5) Arg-vasopresin; (6) Lys-vasopresin; (7) desmopresin 3.4 Butyl-methakrylátové monolitické stacionární fáze Poslední část disertační práce je věnována studiu chromatografického chování nonapeptidů na moderním separačním médiu, monolitu. Monolitické kolony mají své významné místo v kapilární kapalinové chromatografii (cLC). Separace na těchto stacionárních fázích naznačuje dobrý trend a vzrůstá i jejich použití díky poměrně snadné přípravě9. U monolitických materiálů na bázi butyl-methakrylátu se předpokládá větší chemická a teplotní stabilita než u silikagelových částicových materiálů. Nevýhodou těchto fází je zatím jejich menší separační účinnost oproti silikagelovým fázím. Příprava butyl-methakrylátových monolitických stacionárních fází spočívá v naplnění vhodně promyté a připravené křemenné kapiláry polymerizační směsí. Tato směs se skládala z 0,4 % hm. 2,2– azobisisobutyronitrilu jako iniciátoru; 17,8 % hm. butyl–methakrylátu jako funkčního monomeru; 21,8 % hm. ethylen–dimethakrylátu jako síťovacího monomeru; 42,0 % hm. propan–1–olu a 18,0 % hm. butan–1,4–diolu jako porogenního činidla. Po polymerizaci byly kapiláry upraveny na konečnou délku 15 cm a následně použity pro separaci peptidů v modu cLC. 10 3.4.1 Nonapeptidy Pro získání experimentálních dat bylo postupováno stejně jako při studiu retenčního chování analytů na silikagelových fázích a zirkoniové stacionární fázi. Byl tedy sledován vliv typu pufru (fosforečnanový, octanový a tetraboritanový), jeho pH, koncentrace a poměr ACN a příslušného pufru v mobilní fázi. Použitím mobilní fáze obsahující ACN-fosforečnanový pufr byly získány celkem slibné výsledky, podařilo se oddělit jednotlivé vasopresiny, i když doba analýzy byla dlouhá ~ 40 min. Bohužel v prostředí tohoto pufru došlo k porušení vazeb mezi monolitem a stěnou kapiláry a tím pádem k vytlačení monolitu z kapiláry. Následně byly hledány jiné vhodnější pufry. Na základě předchozích experimentů v rámci této práce byly vybrány dva, a to octanový a tetraboritanový pufr. Tetraboritanový pufr umožňuje měření v silně bazické oblasti, která se pro separaci vasopresinu osvědčila na koloně Discovery Zr PBD. Dle získaných výsledků se jako nejvhodnější mobilní fáze jevila fáze tvořená ACN- 3·10-2 mol·dm-3 octanovým pufrem pH 4,5 3/97 (v/v) nebo ACN-7·10-2 mol·dm-3 tetraboritanový pufr pH 7,7 8/92 (v/v). V mobilní fázi obsahující ACN-octanový pufr se podařilo rozdělit všech 6 nonapeptidů do 45 min. Záznam byl však opět zatížen značným šumem základní linie. V mobilní fázi ACN- tetraboritanový pufr byly sice rozděleny všechny analyty do 25 min, ale rozlišení píků nebylo dostatečné a ani symetrie píků nebyla dobrá. Porovnáním separace studovaných analytů na butyl-methakrylátovém monolitu se separací na koloně Supelcosil C18 v mobilní fázi ACN-octanový pufr došlo u monolitu ke značnému prodloužení retenčních časů a nepodařilo se od sebe oddělit Arg- a Lys-vasopresin. Změnila se i selektivita tohoto systému oproti silikagelovým kolonám Supelcosil C18 i Discovery HS F5. Vypočítaná účinnost na butyl-methakrylátových monolitech byla z testovaných stacionárních fázích nejnižší (2 400 – 10 000 tp/m), ale vzhledem k tomu, že se jedná o experimentální kolonu, je zde možný další vývoj a prostor pro zlepšení. 11 4. Shrnutí Cílem této disertační práce bylo studium retenčního chování dvou skupin peptidů, pentapeptidů a nonapeptidů, v různých separačních systémech tvořených rozdílnými stacionárními a mobilními fázemi. Na základě podrobného experimentálního popisu separačních systémů lze následně zvolit nejvhodnější separační systém pro vybranou směs analytů. Do disertační práce byly vybrány typově odlišné kolony, Supelcosil C18, Discovery HS F5, Discovery Zr PBD a butyl-methakrylátový monolit, které jsou zástupci silikagelových a zirkoniových náplňových stacionárních fází, a také moderního monolitického separačního média na bázi polymeru. Zvolené kolony jsou typově relativně nové a představují nové možnosti v separacích biologicky aktivních látek. Nejprve byly všechny používané kolony otestovány Waltersovým testem, který slouží k charakterizaci reverzních stacionárních fází. Ve skupině studovaných stacionárních fází jsou zastoupeny na základě výsledků Waltersova testu jak kolony s odlišnou polaritou, tak i s rozdílnou hydrofobností. Tento výběr kolon s dostatečně odlišnými vlastnostmi vytváří prostor k dobré charakterizaci separačního chování zvolených analytů případně k následné optimalizaci podmínek pro separaci peptidů v dvou- nebo více-dimenzionálním systému. Retenční pořadí separovaných pentapeptidů bylo na všech studovaných stacionárních fázích stejné. Výjimku tvořil D-Ala, Leu-enkefalin, který na koloně Supelcosil C18 eluoval jako první v pořadí a na kolonách Discovery HS F5 a Discovery Zr PBD jako třetí. Změna retence daného analytu zřejmě souvisí s rozdílnou polaritou daných stacionárních fází, neboť více je zmiňovaný enkefalin zadržován na polárnějších stacionárních fázích. Nejlepší separace z hlediska rozlišení (Rs ≥ 2,8), symetrie píků (As ≤ 1,3), účinnosti kolony (~ 38 000 tp/m) a doby analýzy (do 7 minut) byla dosažena na koloně Supelcosil C18 v mobilní fázi obsahující ACN-5·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr pH 5,0 22/78 (v/v). Při studiu retenčního chování nonapeptidů na různých typech stacionárních fází byly pozorovány následující důležité zobecňující poznatky: isotocin téměř ve všech studovaných separačních systémech, kromě kombinací Discovery HS F5/fosforečnanový pufr a Supelcosil C18/fosforečnanový pufr, eluoval v mrtvém čase. Druhým poznatkem bylo problematické dělení nonapeptidů Lys- vasopresinu a Arg-vasopresinu, které se liší pouze jednou aminokyselinou (lysin nebo arginin) umístěnou v poloze 8 aminokyselinového řetězce. Tuto dvojici analytů se nepodařilo rozdělit až na základní linii v žádném z následujících systémů Supelcosil C18/fosforečnanový pufr a Supelcosil C18/mravenčanový pufr, Discovery HS F5/octanový pufr ani butyl-methakrylátový monolit/octanový pufr. Z popsané skutečnosti vyplývá, že nejlepší studovaný separační systém pro nonapeptidy je tvořen kolonou Discovery HS F5 a mobilní fází obsahující ACN-7·10-2 mol·dm-3 fosforečnanový pufr o pH 6,5 20/80 (v/v). V tomto separačním systému došlo k rozdělení všech šesti vasopresinů do 20 min 12 s dostatečným rozlišením (R s ≥ 1,8) a symetrií píků (A s ~ 1,1). Vypočítaná účinnost kolony v optimalizované mobilní fázi se pohybovala v intervalu 37 000 – 47 000 (tp/m) pro daný analyt . Nejcitlivějším analytem na změnu složení mobilní fáze byl desmopresin, jehož retenční chování vykazovalo nejintenzivnější závislost na změně pH a koncentrace vybraného pufru. Desmopresin se odlišuje od ostatních analyzovaných nonapeptidů přítomností 3-merkaptopropionové kyseliny na začátku svého aminokyselinového řetězce, tedy na C konci. Absence aminokyseliny cysteinu v pozici 1, která byla nahrazena karboxylovou kyselinou obsahující síru, je pravděpodobně zodpovědná za jeho odlišné chování. Na závěr lze říci, že nové stacionární fáze v daném případě modifikované silikagelové, zirkoniové nebo monolitické, jsou dobrou a zajímavou možností pro separaci biologicky aktivních peptidů ke „klasickým“ C18 fázím. Zirkoniové stacionární fáze jsou sice vhodnou alternativou k silikagelovým nosičům, ale v našem případě neposkytly lepší separace směsi pentapeptidů i nonapeptidů než kolony silikagelové. Trend miniaturizace HPLC nabývá v dnešní době na významu, přesto výběr a dostupnost stacionárních fází pro cLC je oproti klasické kapalinové chromatografii stále omezený. Tento nedostatek by mohl být odstraněn i pomocí kapilárních monolitických kolon. Separace na monolitických kolonách naznačují dobrý trend a vzrůstá i jejich použití, díky poměrně snadné přípravě. Monolitické kolony ale ještě vyžadují další vývoj v oblasti technologie jejich přípravy a následně jejich aplikačního využití. Tento fakt potvrzují i nejnižší hodnoty účinnosti testované kolony zjištěné pro jednotlivé analyty. 13 5. Citace 1 - J.J. Kirkland, J.Chromatogr. A 1060 (2004) 9-21 2 - J. Nawrocki, J. Chromatogr. A 779 (1997) 29-71 3 - N.Tanaka, Y. Tokuda, K. Iwaguchi, M. Araki., J. Chromatogr. 239 (1982) 761-772 4 - J. Nawrocki, C. Dunlap, A. McCormick, P.W. Carr, J. Chromatogr. A 1028 (2004) 1-30 5 - J. Nawrocki, C. Dunlap, A. McCormick, P.W. Carr, J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31-62 6 - A. Palm, M. V. Novotný, Anal. Chem. 69 (1997) 4499 7 - J. P. C. Wissers, H. A. Claessens, C. A. Cramers, J. Chromatogr. A779 (1997) 1 8 - J. P. C. Wissers, J. Chromatogr. A 856 (1999) 117 9 - J. Grafnetter, Disertační práce, PřF UK v Praze 14 Příloha 1: Seznam publikací, prezentací a plakátových sdělení Publikace: K. Soukupová, J. Suchánková–Sobotníková, L. Janečková, E. Tesařová: Application of modern silica–based and zirconia–based reversed stationary phases for separation of selected vasopressins – ve stádiu přípravy K. Soukupová, E. Kafková, J. Suchánková, E. Tesařová: Comparison of zirconia- and silica-based reversed stationary phases for separation of enkephalins. Journal of Chromatography A 1087 (2005) 104 – 111 J. Suchánková, K. Soukupová, E. Tesařová, Z. Bosáková, P. Coufal: Separation and Quantification of Enkephalin and Vasopressin Related Peptides in Reversed Phase Capillary Liquid Chromatography. Chromatographia 60 (2004) S119 - S124 Přednášky: K. Soukupová: Comparison of zirconia-based and silica-based reversed stationary phases for separation of enkephalins, 2nd International conference „Modern Analytical Chemistry”, UK Praha, 25. 1. 2005 K. Soukupová: Separace biologicky aktivních látek v RP HPLC na kolonách na bázi oxidu zirkoničitého, SPE and HPLC seminář organizovaný firmou Sigma-Aldrich, ÚOCHB Praha, 22.10.2004 K. Soukupová: Využití cLC pro separaci biologicky aktivních látek - peptidů, SPE and HPLC seminář organizovaný firmou Sigma-Aldrich, ÚOCHB Praha, 21.11.2003 Plakátová sdělení: K. Soukupová, L. Janečková, J. Suchánková, E. Tesařová: New reversed stationary phases applied to separation of selected biologically active compound, 12th Internation Symposium on Separation Sciences ISSS 2006, Lipica, Slovinsko, 27. – 29.9.2006 15 K. Soukupová, J. Kodeš, J. Suchánková, E. Tesařová: New reversed Stationary Phases and Their Use for separation of biologically active peptides, 11th Internation Symposium on Separation Sciences ISSS 2005, Pardubice, 12.– 14.9.2005 K. Soukupová, E. Krafková, J. Suchánková, E. Tesařová: Comparison of separation behaviour of some biologically active compounds on zirconia- and silica-based RP-HPLC stationary phases, 25th International Symposium on Chromatography, Paříž, Francie, 4.-8. 10. 2004 K. Soukupová, J. Suchánková, E. Tesařová, Z. Bosáková: Capillary liquid chromatography for separation of biologically active peptides, 5th Balaton Symposium on High-performance Separation Methods, Siófok, Maďarsko, 3.-5. 9. 2003 J. Suchánková, K. Soukupová, E. Tesařová : Srovnání separace biologicky aktivních peptidů na různých reverzních stacionárních fázích, IX. konference ACP 2002 Súčasný stav a perspektivy analytické chemie v praxi, Bratislava, Slovensko, září 2002 16 Příloha 2: Curriculum vitae Osobní data: Jméno: Klára Soukupová Datum narození: 15.11.1979 Místo narození: Plzeň Adresa: Kaznějovská 23, Plzeň 323 00, Česká Republika E-mail: Soukupova.Klara@seznam.cz Vzdělání: 2003 – 2006 doktorandské studium, PřF UK , Katedra analytické chemie, Hlavova 2030, 128 40 Praha 2 1998 – 2003 magisterské studium, PřF UK , Katedra analytické chemie, Hlavova 2030, 128 40 Praha 2 1994 – 1998 Gymnázium L. Pika, Plzeň Zaměstnání: 2007 – Zentiva a.s., Kontrola kvality Jazykové znalosti: Angličtina (TOEFL) 17 18
Abstract v angličtině:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Analytical Chemistry Modern Reversed Stationary Phases Based on Silicagel, Zirconium Dioxide and Organic Monoliths; Their Used in Separation of Biologically Active Compounds Synopsis of PhD. Thesis Prague 2008 Klára Soukupová The PhD. Thesis was carried out at the Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague, in the period of 2003-2008. Author: Mgr. Klára Soukupová Supervisors: RNDr. Jana Suchánková-Sobotníková, Ph.D Doc. RNDr. Eva Tesařová, CSc. Prague 2008 Table of contents 1. Introduction 2 2. Objectives of the Thesis 3 3. Results and Discussion 4 4. Conclusions 12 5. References 13 Appendix 1: List of Publications, Lectures and Poster presentations 14 Appendix 2: Curriculum Vitae 16 1 1. Introduction High performance liquid chromatography (HPLC) is modern instrumental method used mainly in analytical chemistry. Most used separation mode is reversed phase liquid chromatography (RP HPLC). This method is very useful because of high separation efficiency, reliability and wide choice of stationary phases with different selectivity. Most used stationary phases in RP HPLC are bonded phases, which have many advantages: good availability, wide application range, fast establishment of equilibrium and ability to use aqueous mobile phases. The most widely used carrier for RP HPLC stationary phases is silica with bonded C18 or C8 groups. Silica gel modified with pentafluorophenylpropyl ligands belongs among the recently introduced silica based stationary phases1. This new type of stationary phase is used as a sufficient alternative to the classical C18 phases. Silica gel based HPLC phases have well known chemical and temperature limitations. Variety of other carrier materials has been investigated in an effort to overcome these limitations2. In attempt to replace the silica based reversed phases by more stable and selective carrier materials, various metal oxides such as zirconium, titanium and aluminum oxides were tested and characterized. Especially zirconia based stationary phases have exhibited special physical and chemical properties, namely good mechanical and chemical stability in a wide pH range (1-14) and temperature range up to 150°C3,4. The trend of the recent years is miniaturization of HPLC5,6 columns. Capillary liquid chromatography (cLC) use the same stationary phases as classical HPLC but in smaller dimensions. New promising technique, which is an alternative to traditional particle based phases are monolithic columns7. These monolithic phases have become popular especially in cLC thanks to their easy preparation. In this PhD. Thesis, retention behaviour of biologically active peptides with various stationary and mobile phases was tested. Basic analytical parameters on various columns were compared and the differences were discussed. 2 2. Objectives of the Thesis The subject of this Thesis is a chromatographic behaviour of selected biologically active pentapeptides and nonapeptides (Table 2.1). Different reversed stationary phases (Table 2.2), based on silica gel, zirconium dioxide and organic monolith were tested using various mobile phase systems. Studied stationary phases were critically compared and practical use was assessed. Table 2.1 Amino acid sequences of the studied biologically active peptides. The vasopressin analogues have disulphide bridge between Cys1 and Cys2. Pentapeptides Amino acid sequence methionine5–enkephalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Met leucine5–enkephalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu D–alanine2,leucine5–enkephalin Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu leucine5–enkephalinamide Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuNH2 Nonapeptides Amino acid sequence arginine8–vasopressin (AVP) Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-GlyNH2 lysine8–vasopressin (LVP) Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-GlyNH2 oxytocin (OXT) Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-GlyNH2 arginine8–oxytocin (AVT, vasotocine) Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-GlyNH2 isotocin (ISO) Cys-Tyr-Ile-Ser-Asn-Cys-Pro-Ile-GlyNH2 deaminoCys1,D–arginine–vasopressin Mpa*-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-GlyNH2 (dDAVP, desmopresine) * 3–mercaptopropionic acid Table 2.2 List of the reversed phase columns tested and their relevant physico-chemical properties. Pore Surface Temp. Partical Bonded Partical Column Size Area Limits pH Range Platform Phase Shape (Å) (m2/g) (°C) Supelcosil silica C18 spherical 120 170 60 2–7 C18 Discovery pentafluoro– silica spherical 120 300 70 2–8 HS F5 phenylpropyl Discovery poly– ZrO2 spherical 300 30 150 1–13 Zr PBD butadien Monolith – – polymeric 200 24 – – Monoliths are new materials and all their properties are not available. 3 3. Results and Discussion In this Thesis, four different reversed stationary phases were studied: two silica based stationary phases (Supelcosil C18 and Discovery HS F5), one zirconia based stationary phase (Discovery Zr PBD) and one monolithic column prepared in Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague. Columns were characterized and evaluated using common chromatographic parameters measured under Walters test conditions. The influence of mobile phase composition (pH, buffer, concentration, content of organic modifier) was tested as parameter affecting retention, separation efficiency, resolution and peak symmetry. Selected biologically important pentapeptides and nonapeptides were used as test compounds. 3.1 Walters test The Walters test8 is a simple test proposed for classification of reversed phases based on evaluation of two predominating retention mechanism in RP HPLC, hydrophobic and polar. The results obtained are summarized in Fig. 3.1.1. It was found that the selected stationary phases differ both in hydrophobic (HI) and polar (SI) indexes. This choice of columns with different properties leads to different separation behaviour of tested peptides and makes possible to use to multidimensional separation. 8 Supelcosil C18 7 Discovery HS F5 Discovery Zr PBD Monolit 6 Value of parameters 5 4 3 2 1 0 HI SI Fig. 3.1.1 Order of all studied columns according to the hydrophobicity (HI) and polarity (SI) parameters To test column stability, Walters test was used repeatedly during optimization experiments, with differently buffered mobile phases. According to the results, the buffers did not affect the properties (HI, SI) of tested columns, except for Discovery Zr PBD column, where phosphate and acetate buffers caused change of hydrophobicity and polarity of this column. 4 3.2 Silica based stationary phases During the first experiment with silica based stationary phases, Supelcosil C18 and Discovery HS F5, were used. Both columns were obtained from Supelco (Bellefonte, PA, USA). Supelcosil C18 column is classical C18 phase that is specially deactivated for analyses of basic compounds. Second column, Discovery HS F5, has stationary phase based on silica modified by pentafluorophenylpropyl ligands. The Discovery HS F5 bonded phase provides unique selectivity, excellent peak shape and good stability. Various mobile phases composed of acetonitrile (ACN) and phosphate, acetate or formate buffer were tested. The goal was to reach a rapid and effective separation of tested analytes. 3.2.1 Pentapeptides First tested group was mixture of four enkephalins (Table 2.1). The effect of concentration of acetonitrile, pH, the type and concentration of buffer were studied. Based on the results obtained by optimization of parameters it was found out that mixture of pentapeptides is well separated on Supelcosil C18 column with mobile phase containing ACN - 5·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 5.0 22/78 (v/v). Separation of mixture was within 7 minutes (Fig. 3.2.1.1 A). All studied parameters were satisfactory; resolution (Rs) ≥ 2.8, symmetry of peaks (As) ≤ 1.3, column efficiency (tp/m) ~ 38 000. On Discovery HS F5 column the mixture of pentapeptides was best separated in mobile phase containing ACN - 8·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 4.5 22/78 (v/v) (Fig. 3.2.1.1 B). The separation of pentapeptides took 10 minutes with suitable resolution (Rs ≥ 2.8), peak symmetry (As ≤ 1.7) and column efficiency ~ 26 000 (tp/m). Comparing the results, separation on Supelcosil C18 was unquestionably better than on Discovery HS F5 column in terms of analysis time, column efficiency and peak symmetry. 5 A B 70 160 3 4 60 3 2 140 2 120 50 Response, mAU Response, mAU 100 40 5 5 80 30 60 20 1 40 4 10 20 1 0 0 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 t, min t, min Fig. 3.2.1.1 A Fig. 3.2.1.1 B Optimized separation of enkephalins on Supelcosil C18; Optimized separation of enkephalins on Discovery HS F5; mobile phase ACN – 5·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH mobile phase ACN – 8·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 5.0 22/78 (v/v) 4.5 22/78 (v/v) Temperature 25 °C; flow rate 1 ml/min; injection 10 µl; UV detection 214 nm. Identification of peaks: (1) uracil; (2) D– Ala,Leu–enkephalin; (3) Met–enkephalin; (4) Leu–enkephalin; (5) Leu–enkephalinamide 3.2.2 Nonapeptides Second group of analytes tested were nonapeptides (Table 2.1). These compounds are structurally different from pentapeptides. Their structure is formed by cyclic part closed by disulfidic bridge. Remaining three aminoacids make a free side chain which is accessible for interactions. As in experiments with enkephalins, the influence of pH and concentration of buffers, the ratio of acetonitrile to buffers on retention parameters were tested and differences were discussed. Based on the chromatographic parameters, suitable systems for separation of nonapeptides set were following: Supelcosil C18 column ACN - 1·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 4.5 18/82 (v/v) ACN - 3·10-2 mol·dm-3 acetate buffer pH 5.0 20/80 (v/v) Discovery HS F5 column ACN - 7·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 6.5 20/80 (v/v) ACN - 5·10-2 mol·dm-3 acetate buffer pH 6.5 21/79 (v/v) Optimum mobile phases for Supelcosil C18 column had similar composition in terms of ACN concentration and pH. With ACN - phosphate buffer mobile phase analysis time of six nonapeptides was 26 minutes. Arg- and Lys-vasopressin were not separated from each other (Rs ~ 0.6). In system 6 ACN - acetate buffer system isotocin eluated in dead time and was not separated from uracil. The other analytes were separated in only 10 minutes (Rs ≥ 1.2). It is interesting that the retention order of isotocin, oxytocin and uracil in ACN – phosphate system is different from retention order in ACN – acetate system. The change in buffer anion from inorganic to organic leads to significantly different system selectivity. The calculated separation efficiency was in range 15 000-22 000 tp/m in mobile phase ACN - phosphate buffer and 18 000-24 000 tp/m for ACN - acetate buffer. Results obtained on Discovery HS F5 column show that in system with mobile phase ACN- phosphate buffer set of six vasopressins was separated in 18 minutes. Resolution (Rs ≥1.8) and peak’s symmetry (As ≤1.3) were satisfactory. In second mobile phase consisting of ACN-acetate buffer separation of six nonapeptides was not successful. Isotocin, Arg-vasopressin and Lys-vasopressin were not separated to the baseline. In this system, separation order of isotocin changed compared to the system with ACN-phosphate buffer, being eluated first. Separation efficiency of system was ACN- phosphate buffer 37 000-47 000 tp/m and 17 000-30 000 tp/m for ACN-acetate buffer. The most suitable system for separation of set of nonapeptides was with Discovery HS F5 column using mobile phase ACN - 7·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 6.5 20/80 (v/v). The representative chromatogram is shown in Fig. 3.2.2.1. 120 2 100 80 Response, mAU 60 40 3 4 6 20 7 5 1 0 0 5 10 15 20 t, min Fig. 3.2.2.1 Optimized separation of vasopressin analogues on Discovery HS F5; mobile phase ACN-7·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 6.5 20/80 (v/v); temperature 25 °C; flow rate 1 ml/min; injection 10 µl; UV detection 214 nm. Peak identification: (1) uracil; (2) Arg-vasotocin; (3) Lys-vasopressin; (4) Arg-vasopressin; (5) isotocin; (6) oxytocin; (7) desmopresine. 3.3 Zirconia based stationary phase Reversed-phase, zirconia based stationary phases have exceptional pH and thermal stability compared to silica based particles. The separation mechanism on zirconia based stationary phases is different from silica based phases and is based on Lewis acid-base chemistry. 7 Zirconia based Discovery Zr PBD column (Supelco, Bellefonte, PA, USA) was chosen for separation of set of pentapeptides and nonapeptides in different mobile phases. Mobile phases consisted of ACN or MetOH combined with phosphate or acetate buffer. The buffers used are strong Lewis bases, especially phosphate ion. Zirconia based columns are thermally stable so the influence of temperature was also tested among parameters affecting chromatographic behaviour of analytes. 3.3.1 Pentapeptides Zirconia based columns are relatively new material on market. So minimum references about zirconia based columns and separation of peptides were found. Thus in first experiments, the effect of acetonitrile (ACN) and methanol (MetOH) on retention of analytes were examined. A significant difference between MetOH and ACN can based mobile phases was observed (Fig. 3.3.1.1). Mobile phases containing MetOH were found to yield long retention times and very bad peak shapes. ACN in mobile phases offered low viscosity, low UV transmittance, and high separation efficiency (~ 30 000 tp/m). For these reasons ACN was chosen as organic part of mobile phase. 160 methanol Fig. 3.3.1.1 2 140 3 acetonitrile Influence of organic modifier on retention behaviour of 120 tested analytes. Mobile phase MetOH / ACN and Response, mAU 100 5 80 4 5·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 2,0 50/50 (v/v); 60 temperature 25 °C; flow rate 1 ml/min; injection 10 µl; UV 1 40 2 5 detection 214 nm. Peak identification: (1) uracil, (2) D-Ala- 20 3 4 Leu-enkephalin, (3) Met-enkephalin, (4) Leu-enkephalin, (5) 0 Leu-enkephalinamide 0 5 10 15 20 25 30 35 t, min In following, effect of pH and concentration of phosphate buffer, ratio of ACN to buffer, and temperature variation were studied as parameters affecting retention behaviour of analytes. Based on the optimized results, good resolution (Rs 1.9-2.9), good peak symmetry (As ≤ 1.4) and good efficiency (tp/m ~ 20 000) in the reasonable time was achieved on Discovery Zr PBD in mobile phase consisting of ACN - 5·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 2.0 45/55 (v/v) and separation temperature was set to 70 °C (Fig. 3.3.1.2). The elution order of enkephalins varied on zirconia based and silica based phases, implying that the retention mechanism differs. The advantage of zirconia based stationary phase is that acidic mobile phase can be used without danger of column damage. 8 180 3 Fig. 3.3.1.2 160 2 140 Optimized separation of enkephalins on Discovery Zr PBD; mobile phase ACN - 5·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 2.0 Response, mAU 120 5 100 45/55 (v/v); temperature 70 °C; flow rate 1 ml/min; injection 4 80 60 10 µl; UV detection 214 nm. Peak identification: (1) uracil; (2) 1 40 Met-enkephalin; (3) Leu-enkephalin; (4) D-Ala,Leu-enkephalin; 20 (5) Leu-enkephalinamide. 0 0 2 4 6 8 t, min 3.3.2 Nonapeptides Retention behaviour of nonapeptides on Discovery Zr PBD was also studied. The influence of composition of mobile phase (buffer pH and concentration, content of organic modifier) and temperature was tested as variables affecting retention, separation efficiency, resolution and peak symmetry of selected nonapeptides. Mobile phases consisted of ACN as organic modifier and phosphate and acetate buffer. Based on the results obtained by evaluation of chromatographic parameters, a successful attempt to separation of nonapeptides on Discovery Zr PBD was done in following mobile phase: ACN-7·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 10.0 18/82 (v/v), temperature 50 °C (Fig.3.3.2.1 A) ACN-6·10-2 mol·dm-3 acetate buffer pH 6.5 18/82 (v/v), temperature 40 °C (Fig. 3.3.2.1 B) When looking at Fig. 3.3.2.1 A or B, the separation of nonapeptides in mobile phase consisting of ACN-phosphate buffer was better then in mobile phase consisting of ACN-acetate buffer. Isotocin was eluated in dead time not separated from uracil. Despite this fact, separation within 7 min was done with good resolution (Rs min 2.9), good peak symmetry (As max 2.0) and separation efficiency in range 24 000 – 33 000 tp/m depending on analytes. In the mobile phase consisting of ACN-acetate buffer, separation of six vasopressins was done in 20 minutes and isotocin was separated from uracil (dead time marker). In this mobile phase, significant base line noise was observed and peak symmetry was not good (As 1.1 – 2.9). Separation efficiency was in range 5 000 – 22 000 tp/m. 9 A 4 B 70 4 60 3 7 4 50 Response, mAU Response, mAU 2 1 40 6 2 3 1+2 30 7 5 6 5 20 0 10 0 0 2 4 6 8 0 5 10 15 20 t, min t, min Fig. 3.3.2.1 A Fig. 3.3.2.1 B Optimized separation of vasopressins on Discovery Zr Optimized separation of vasopressins on Discovery Zr PBD; mobile phase ACN-7·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer PBD; mobile phase ACN-6·10-2 mol·dm-3 acetate buffer pH pH 10.0 18/82 (v/v) temperature 50 °C. 6.5 18/82 (v/v) temperature 40 °C. Flow rate 1ml/min; injection 10 µl; UV detection 214 nm. Peak identification: (1) uracil; (2) isotocin; (3) oxytocin; (4) Arg-vasotocin; (5) Arg-vasopressin; (6) Lys-vasopressin; (7) desmopresine 3.4 Butyl-methacrylate monolithic stationary phase In the following part of this Thesis, the retention behaviour of nonapeptides on monolithic column was tested. It is supposable that monolithic stationary phases are more chemically and thermally stable than silica based stationary phases. Disadvantage of these columns is their smaller separation efficiency. The monolithic columns were prepared by thermally initiated radical polymerization of butyl methacrylate monomers in 320 µm i.d. fused silica capillaries according to procedure9, developed at the Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague. 3.4.1 Nonapeptides The same set of experiments that were used with silica and zirconia based columns was applied to on monolithic columns. The influence of composition of mobile phase (buffer pH and concentration, content of organic modifier) and temperature was tested as variables affecting retention, separation efficiency, and resolution and peak symmetry of selected nonapeptides. Mobile phases were consisted of ACN and phosphate, acetate or borate buffer. The mixture of nonapeptides was well separated on monolithic phase using mobile phase consisting of ACN-phosphate buffer, but analysis time was 40 minutes. Phosphate buffer caused 10 damage of bonds between monolith and walls of capillary, resulting in monolith being pushed out of column. For this reason acetate and borate buffers were preferred. Based on the results, mobile phase consisting of ACN - 3·10-2 mol·dm-3 acetate buffer pH 4.5 3/97 (v/v) or ACN - 7·10-2 mol·dm-3 borate buffer pH 7.7 8/92 (v/v) was suitable for separation of mixture of vasopressins. In mobile phase ACN-acetate buffer all six vasopressins analogues were well separated in 45 minutes, but significant noise of base line was observed. In second mobile phase, ACN-borate buffer, six analytes were separated in 25 minutes, but poor peak resolution and peak symmetry was observed. Separation efficiency for this monolithic column was lower than on other column only 2 400 to 10 000 tp/m. These monolithic stationary phases are experimental materials so there is chance for further improvement. 11 4. Conclusions This Thesis was focused on study of retention behaviour of two selected group of peptides on different stationary and mobile phase. Based on the detailed experiments, suitable separation system for good separation of analytes was found. Four different reversed stationary phases were tested; two silica based columns, one zirconia based column and one butyl-methacrylate monolithic phase. Selected stationary phases are relatively new materials and they promise new possibilities in separation of biologically active peptides. In the first step, selected columns were tested by Walters test. The great differences in hydrophobicity and polarity of chosen columns were observed. Different character of selected columns leads to good characterization of separation behaviour of selected peptides. Elution order of tested pentapeptides was similar on all tested stationary phases, except D-Ala- Leu-enkephalin that eluated first on Supelcosil C18 and third on Discovery HS F5 and Discovery Zr PBD. Different retention behaviour of this analyte was obviously related to polarity of stationary phase. D-Ala- Leu-enkephalin was most held on stationary phases high polarity. The mixture of pentapeptides was well separated on silica based Supelcosil C18 column using mobile phase consisting of ACN-5·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer pH 5.0 22/78 (v/v). Generalized information about retention behaviour of nonapeptides: isotocin eluated in dead time apart from separation system Discovery HS F5/phosphate buffer and Supelcosil C18/phosphate buffer. Second fact about separation was problematic separation of Lys-vasopressin and Arg-vasopressin. These analytes differ in one aminoacid (lysine or arginine), which is in position 8 of aminoacid chain. Both mentioned analytes were separated to baseline on Discovery HS F5 column using ACN - 7·10-2 mol·dm-3 phosphate buffer o pH 6.5 20/80 (v/v) as mobile phase. Finally, new reversed stationary phases modified silica based, zirconia based and monolithic phase, are a satisfactory and interesting alternatives to “classical” silica based stationary phases for separation of biologically active pentapeptides and nonapeptides. Zirconia based reversed stationary phase provide little shorter retention times for nonapeptides, but separation of analytes is not better, compared to silica based columns. The trend of recent years is miniaturization of HPLC. Capillary liquid chromatography (cLC) exploits the same stationary phases like in classical HPLC but dimensions are smaller. Promising new stationary phases used mainly in cLC are monolithic columns. Monolithic capillary columns are cheap and easy to prepare. The columns can be used to separate nonapeptides but efficiency is lower than with particle based columns, retention times longer and there are problems with baseline noise. The methods of preparation of experimental monolithic columns still need further improvement. 12 5. References 1 - N.Tanaka, Y. Tokuda, K. Iwaguchi, M. Araki., J. Chromatogr. 239 (1982) 761 2 - J. Nawrocki, J. Chromatogr. A 779 (1997) 29 3 - J. Nawrocki, C. Dunlap, A. McCormick, P.W. Carr, J. Chromatogr. A 1028 (2004) 1 4 - J. Nawrocki, C. Dunlap, A. McCormick, P.W. Carr, J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31 5 - J. P. C. Wissers, H. A. Claessens, C. A. Cramers, J. Chromatogr. A779 (1997) 1 6 - J. P. C. Wissers, J. Chromatogr. A 856 (1999) 117 7 - A. Palm, M. V. Novotný, Anal. Chem. 69 (1997) 4499 8 - M. J. Walters, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70 (1987) 465 9 - J. Grafnetter, PhD. Thesis, Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague 13 Appendix 1: List of Publications, Lectures and Poster Presentations List of Publications: K. Soukupová, J. Suchánková–Sobotníková, L. Janečková, E. Tesařová: Application of modern silica–based and zirconia–based reversed stationary phases for separation of selected vasopressins – in preparation K. Soukupová, E. Krafková, J. Suchánková, E. Tesařová: Comparison of zirconia- and silica-based reversed stationary phases for separation of enkephalins. Journal of Chromatography A 1087 (2005) 104 – 111 J. Suchánková, K. Soukupová, E. Tesařová, Z. Bosáková, P. Coufal: Separation and Quantification of Enkephalin and Vasopressin Related Peptides in Reversed Phase Capillary Liquid Chromatography. Chromatographia 60 (2004) S119 - S124 List of Lectures: K. Soukupová: Comparison of zirconia-based and silica-based reversed stationary phases for separation of enkephalins, 2nd International conference „Modern Analytical Chemistry”, Charles University in Prague, Faculty of Science, 25. 1. 2005 K. Soukupová: Separation of biologically active compounds on zirconia-based reversed stationary phases in RP HPLC, SPE and HPLC seminar organized by Sigma-Aldrich, ÚOCHB Prague, 22.10.2004 K. Soukupová: Separation of biologically active compounds in cLC, SPE and HPLC seminar organized by Sigma-Aldrich, ÚOCHB Prague, 21.11.2003 List of Poster presentations: K. Soukupová, L. Janečková, J. Suchánková, E. Tesařová: New reversed stationary phases applied to separation of selected biologically active compound, 12th Internation Symposium on Separation Sciences ISSS 2006, Lipica, Slovenia, 27. – 29.9.2006 14 K. Soukupová, J. Kodeš, J. Suchánková, E. Tesařová: New reversed Stationary Phases and Their Use for separation of biologically active peptides, 11th Internation Symposium on Separation Sciences ISSS 2005, Pardubice, Czech Republic, 12.– 14.9.2005 K. Soukupová, E. Krafková, J. Suchánková, E. Tesařová: Comparison of separation behaviour of some biologically active compounds on zirconia- and silica-based RP-HPLC stationary phases, 25th International Symposium on Chromatography, Paris, France, 4.-8. 10. 2004 K. Soukupová, J. Suchánková, E. Tesařová, Z. Bosáková: Capillary liquid chromatography for separation of biologically active peptides, 5th Balaton Symposium on High-performance Separation Methods, Siófok, Hungary, 3.-5. 9. 2003 J. Suchánková, K. Soukupová, E. Tesařová: Srovnání separace biologicky aktivních peptidů na různých reverzních stacionárních fázích, IX. konferencia ACP 2002 Súčasný stav a perspektivy analytické chemie v praxi, Bratislava, Slovakia, September 2002 15 Appendix 2: Curriculum Vitae Personal data: Name: Klára Soukupová Date of birth: 15.11.1979 Place of birth: Pilsen Address: Kaznějovská 23, Pilsen 323 00, Czech Republic E-mail address: Soukupova.Klara@seznam.cz Education: 2003 – 2006 PhD. study, Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Hlavova 2030, 128 40 Prague 2 1998 – 2003 MSc. study, Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Hlavova 2030, 128 40 Prague 2 1994 – 1998 Grammar School L. Pika, Pilsen Job: 2007 – Zentiva a.s., Quality Control Language knowledge: English (TOEFL) 16
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Klára Soukupová, Ph.D. 1.13 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Klára Soukupová, Ph.D. 187 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Klára Soukupová, Ph.D. 143 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Věra Pacáková, CSc. 117 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Josef Cvačka, Ph.D. 118 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 478 kB