velikost textu

Studium interakcí podílejících se na mechanizmu separace v chromatografických separačních systémech

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium interakcí podílejících se na mechanizmu separace v chromatografických separačních systémech
Název v angličtině:
Study of interactions participating in the separation mechanism of chromatographic separation systems
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Květa Kalíková, Ph.D.
Školitel:
prof. RNDr. Eva Tesařová, CSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Věra Pacáková, CSc.
prof. RNDr. Juraj Ševčík, Ph.D.
Id práce:
31825
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyzikální a makromol. chemie (31-260)
Program studia:
Fyzikální chemie (P1404)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
16. 12. 2009
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra fyzikální a makromolekulární chemie Studium interakcí podílejících se na mechanizmu separace v chromatografických separačních systémech Autoreferát dizertační práce Květa Kalíková Praha 2009 Dizertační práce shrnuje výsledky získané během let 2005-2009 na Katedře fyzikální a makromolekulární chemie, PřF UK v Praze. Školitel: Doc. RNDr. Eva Tesařová, CSc. 2 OBSAH 1. Úvod 4 2. Cíle práce 4 3. Výsledky a diskuze 5 3.1 Charakterizace separačních systémů metodou LFER (publikace I) 5 3.2 Popis systémových píků v RP HPLC s vodnými mobilními fázemi (publikace II) 6 3.3 Příklady nalezení a využití optimalizovaných separačních systémů 9 3.3.1 Achirální systémy 9 3.3.1.1 Separace estrogenů (publikace III) 9 3.3.1.2 Separace 1,4-benzodiazepinů (připravovaná publikace) 9 3.3.2 Chirální systémy (publikace IV) 11 3.3.2.1 Optimalizace a validace HPLC metody pro enantioseparaci (±)-cloprostenolu (publikace V) 11 4. Závěry 12 5. Literatura 13 6. Seznam publikovaných prací 14 7. Příspěvky na konferencích 15 8. Životopis 17 3 1. Úvod Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se řadí mezi nejčastěji používané separační metody. Vyniká vysokou spolehlivostí, dobrou opakovatelností a robustností. Výhodou této metody je možnost ovlivňovat separaci nejen volbou stacionární fáze, ale také změnami složení mobilní fáze, která se významně podílí na interakcích rozpuštěných látek se sorbentem. Touto technikou lze separovat širokou škálu strukturně velmi odlišných sloučenin [1] a lze ji použít pro kvalitativní i kvantitativní analýzu. Volba vhodného separačního systému se často provádí empiricky, na základě zkušeností experimentátora, podle informací získaných z literatury, s využitím některých optimalizačních programů nebo čistě postupem pokus-omyl. Lze však využít i některých fyzikálně-chemických charakteristik. Pro výběr optimálních separačních podmínek, tj. výběr vhodné stacionární fáze a mobilní fáze (popřípadě dalšího aditiva např. chirálního selektoru přidávaného do mobilní fáze), je nutné hlubší poznání interakčních a retenčních mechanizmů. Známé technické parametry chromatografických kolon nejsou ve většině případů postačující k výběru optimální kolony pro konkrétní separaci [2]. Z tohoto důvodu je žádoucí nalézt vztah mezi chemickou strukturou analytů, fyzikálně-chemickými vlastnostmi stacionárních fází resp. separačních systémů (včetně mobilní fáze) a jejich separačními účinky. Jedním z možných semiempirických postupů charakterizace separačních systémů je metoda lineárních vztahů volných energií (LFER – Linear Free Energy Relationship) [3, 4]. Proces optimalizace separace může velmi zkomplikovat výskyt systémových píků. Existují případy, kdy je daná systémová zóna detekovatelná a ve výsledném chromatogramu se objeví více píků než odpovídá počtu analyzovaných látek anebo systémová zóna „interaguje“ se zónou analytu a nastává tzv. rezonance. Porozumění jevům probíhajícím v chromatografických separačních systémech má zásadní vliv jak na optimalizaci separačních podmínek tak na správnou interpretaci analytických dat, a tudíž výsledky analýzy. 2. Cíle práce Cílem dizertační práce bylo studium interakčních mechanizmů v separačních systémech vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Dílčí cíle lze rozdělit do několika bodů: • charakterizace a srovnání interakčních možností tří chirálních stacionárních fází (CSP): na bázi teikoplaninu, teikoplanin aglykonu a methylovaného teikoplanin aglykonu v různých mobilních fázích pomocí modelu LFER, zjištění interakcí, které nejvíce ovlivňují retenci analytu a ukázání možnosti predikce retence nových analytů v popsaných separačních systémech 4 • studium systémových píků v RP HPLC, tzn. popsání jejich vzniku resp. výskytu a chromatografického chování v daném systému • aplikace získaných poznatků na separace konkrétních směsí analytů 3. Výsledky a diskuze 3.1 Charakterizace separačních systémů metodou LFER (publikace I) Popis separačních systémů pomocí modelu LFER umožňuje kvalitativní i kvantitativní objasnění interakcí, které se uplatňují v daném systému, a tudíž mají vliv na retenci analytů. Principem metody je korelace naměřených retenčních dat s deskriptory, které popisují schopnost analytu účastnit se určitého typu interakce v separačním systému [5], což popisuje rovnice LFER: log k = c + r.R2 + s.π2H + a.Σα2H + b.Σβ2H + v.Vx (1) kde k je retenční faktor, nezávisle proměnné členy na pravé straně rovnice jsou: R2 je rozsah molární refrakce (disperzní interakce), π2H dipolarita/polarizibilita (elektrostatické interakce) [6], Σα2H charakteristika proton-donorové schopnosti analytu pro tvorbu vodíkové vazby [7], Σβ2H charakteristika proton-akceptorové schopnosti analytu pro tvorbu vodíkové vazby [6], Vx McGowanův charakteristický objem solutu (hydrofobní interakce) [7]. Regresní koeficienty rovnice LFER jsou získávány mnohonásobnou lineární regresí a popisují rozdíly v daných molekulárních interakcích mezi stacionární a mobilní fází. Výše zmíněný model byl použit pro porovnání interakčních možností tří chirálních stacionárních fází na bázi teikoplaninu – teikoplaninové (T), teikoplanin aglykonové (TAG) a methylované teikoplanin aglykonové (MTAG) CSP ve čtyřech mobilních fázích lišících se poměrem methanolu (MeOH) a 1% triethylaminacetátového pufru (TEAA), pH 4,20 (obsah MeOH v mobilní fázi se pohyboval mezi 20 a 80 objemovými procenty), neboť i složení mobilní fáze významně ovlivňuje retenci a separaci analytů v HPLC. Výběrem pufru o pH 4,20 s obsahem triethylaminu jako vodné složky mobilní fáze byly eliminovány potenciální interakce vyvolatelné silanolovými skupinami nosiče, takže retenci analytů ovlivňují pouze interakce analyt/chirální selektor a analyt/mobilní fáze. Testovací sada solutů obsahovala 34 strukturně odlišných látek a pokrývala celou škálu interakcí vyjádřených molekulovými deskriptory, aby rozložení hodnot jednotlivých deskriptorů bylo rovnoměrné, a tím se nepreferoval žádný typ interakce na úkor jiného. Význam hydrofobních interakcí v srovnávaných systémech roste se zvyšujícím se obsahem pufru v mobilní fázi. Nejvyšší hodnota hydrofobicity byla nalezena u MTAG CSP ve všech použitých mobilních fázích. Důvodem je nárůst hydrofobicity chirálního selektoru methylací 5 karboxylové skupiny a fenolických skupin teikoplanin aglykonu. Pořadí významnosti hydrofobních interakcí klesá v řadě: MTAG>TAG>T ve všech studovaných separačních systémech. Schopnost interagovat s n- a π- elektrony analytu také vzrůstá s rostoucím obsahem pufru v mobilní fázi, nicméně příspěvek tohoto typu interakce k celkové retenci analytů je nižší než příspěvek hydrofobicity. Nejnižší schopnost pro interakci s n- a π- elektrony analytu vykazuje T CSP (oproti TAG a MTAG CSP při použití stejné mobilní fáze), protože má hůře přístupná, cukernými zbytky stíněná, aromatická jádra a karbonylové skupiny díky. Při použití mobilní fáze s vysokým obsahem methanolu (80 obj.%) methanolu interakce s n- a π- elektrony analytu obdobně jako interakce hydrofobní již nemají významný vliv na retenci. Interakce dipól-dipól a dipól-indukovaný dipól jsou významné téměř pro všechny studované systémy, neboť CSP na bázi teikoplaninu obsahují mnoho polárních i polarizovatelných skupin. V mobilní fázi s 80 % methanolu se tento typ interakcí stává významným faktorem ovlivňujícím retenci na TAG CSP a MTAG CSP (nahrazují hydrofobní a n- a π- elektronové interakce). Acidita a bazicita patří pro všechny studované systémy mezi faktory snižující retenci analytů. Na základě získaného popisu interakcí lze následně zvolit vhodnou kombinaci stacionární a mobilní fáze pro separace požadované směsi analytů. 3.2 Popis systémových píků v RP HPLC s vodnými mobilními fázemi (publikace II) Systémové píky jsou významným, ale často rušivým jevem, ztěžujícím proces optimalizace separace nejen v HPLC, ale též v dalších separačních metodách. Nepochopením podstaty systémových píků může dojít ke špatné interpretaci získaných výsledků, tyto píky bývají často chybně zaměňovány s píky měřených analytů [8]. Systémové píky však nemají pouze rušivé či negativní vlivy na separaci a detekci, ale lze je využít např. v HPLC k určení mrtvého času [9], který je nezbytný pro výpočet retenčních faktorů a tedy k charakterizaci separovaných látek. Systémové píky byly studovány v RP HPLC s kolonou Discovery® RP Amide C16 a mobilními fázemi tvořenými pouze vodnými pufry bez přídavku organického modifikátoru. Dvousložkové pufry byly tvořeny kyselinou benzoovou a hydroxidem alkalického kovu (LiOH nebo CsOH), třísložkové pufry obsahovaly jako další složku kyselinu tropovou (kyselina 3-hydroxy-2-fenylpropionová). Nadávkováním poruchy LiOH vznikly dvě resp. tři systémové zóny, kdy první byla vždy stacionární a další měnily svou pozici v závislosti na složení mobilní fáze (koncentraci složek pufru). 6 Nadávkováním kladné/záporné poruchy (koncentrace v dávkované zóně je vyšší/nižší než v mobilní fázi) kyseliny benzoové do dvousložkové mobilní fáze vznikne jeden kladný/záporný pohyblivý systémový pík. Z toho je zřejmé, že porucha kyseliny benzoové nezpůsobí poruchu LiOH, což poukazuje na skutečnost, že se LiOH nesorbuje na stacionární fázi (další důkazy jsou uvedeny v publikaci II) – viz Obr. 1 a je tedy vhodný k určení mrtvého času kolony. Při nadávkování kladné/záporné poruchy LiOH bude ve výsledném chromatogramu první pík kladný/záporný a druhý záporný/kladný. 10mM k. benzoová+11mM LiOH A 15mM k.benzoová+6mM LiOH B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 t (min) Obr. 1. Chromatogramy získané nadávkováním poruch: A) LiOH, B) kyseliny benzoové. Složení dávkovaných poruch je uvedeno v obrázku. Mobilní fáze: 10 mM kyselina benzoová + 6 mM LiOH. Nepřímá UV detekce: 290 nm; teplota kolony a v karuselu: 25 °C; průtoková rychlost mobilní fáze: 0,2 ml/min; dávkovaný objem: 10 μl. Pozici prvního systémového píku (stacionární pík) nelze změnit, protože, jak již bylo uvedeno, hydroxidy alkalických kovů se na danou stacionární fázi neváží. Změnit pozici druhého systémového píku je v binárních systémech možné dvěma způsoby. S rostoucí disociací kyseliny benzoové v mobilní fázi (tzn. s rostoucí koncentrací hydroxidu alkalického kovu) se druhý systémový pík posouvá k vyšším retenčním časům. Druhým způsobem je ředění mobilní fáze, s klesající koncentrací složek pufru se druhý systémový pík opět posouvá k vyšším retenčním časům. Důvodem je v obou případech skutečnost, že se stacionární fází interaguje pouze nenabitá (nedisociovaná) forma kyseliny benzoové. Nižší množství nenabité složky v pufru vede ke snížení kompetice o vazebná místa na stacionární fázi a tak dojde ke zvýšení retence. „Interakce“ systémové zóny a zóny analytu (jev nazývaný rezonance) byla pozorována při nadávkování pentan-1-olu do jednosložkové mobilní fáze tvořené 10 mM kyselinou benzoovou – viz Obr. 2. Získaný signál má „cik-cak“ tvar, který je charakteristický při použití nepřímé UV detekce. Oba píky jsou rozšířené a nelze je bezchybně kvalitativně ani kvantitativně vyhodnotit. Z obrázku je též patrná zvyšující se odezva analytů, které se 7 vyskytují blíž systémovému píku – pík hexan-3-olu je mnohem větší než pík hexan-2-olu, protože jeho pozice je blíž pozici systémového píku (koncentrace i dávkovaný objem byly pro oba analyty stejné). Navíc byly získány opačné amplitudy píků analytů pokud eluovaly před systémovým píkem (propan-1-ol and butan-1-ol) nebo za (hexan-3-ol and hexan-2-ol) systémovým píkem. propan-1-ol butan-1-ol pentan-1-ol hexan-2-ol 0,15 rezonance hexan-3-ol systémové píky 0,10 Odezva (AU) 0,05 0,00 -0,05 -0,10 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 t (min) Obr. 2. Rezonance a amplitudy při nepřímé UV detekci. Mobilní fáze: 10 mM kyselina benzoová. Dávkované vzorky: 0,5 % roztoky alkoholů rozpuštěné v mobilní fázi. Nepřímá UV detekce: 290 nm; teplota kolony a v karuselu: 25 °C; průtoková rychlost mobilní fáze: 0,2 ml/min; dávkovaný objem: 20μl. V návaznosti na experimentálně zjištěná data byl vytvořen matematický model, který umožňuje predikovat pozice a amplitudy systémových píků. Na základě tohoto modelu byl vytvořen simulační program, který mimo predikce pozic a amplitud systémových píků, udává také informace o celkovém „vývoji“ koncentrací v daném systému a je schopný simulovat průběh experimentů. 8 3.3 Příklady nalezení a využití optimalizovaných separačních systémů 3.3.1 Achirální systémy 3.3.1.1 Separace estrogenů (publikace III) Cílem práce bylo vyvinout jednoduchou HPLC metodu pro separaci a stanovení pěti estrogenů, konkrétně estronu (E1), 17α-estradiolu (αE2), estriolu (E3), 17α-ethinylestradiolu (EE) a mestranolu (M). Pro separaci uvedených estrogenů byl vybrán reverzní mod vysokoúčinné kapalinové chromatografie se stacionární fází C18. Snahou bylo použít co nejjednodušší mobilní fázi. Acetonitril (ACN) byl vybrán jako organický modifikátor, vzhledem k jeho vyšší eluční síle (v porovnání s methanolem) v těchto systémech, a druhou složkou mobilní fáze byla deionizovaná voda. Nejvhodnější složení mobilní fáze v izokratickém modu při použití kolony Supelcosil TM LC-18-DB (250 x 4,6 mm, velikost zrnění 5 μm) bylo ACN/deionizovaná voda 40/60 (v/v), kdy došlo k rozdělení všech pěti látek na základní linii. Nicméně retence mestranolu byla velmi vysoká (tR = 85,8 min), příčinou je silná hydrofobní interakce, která se uplatňuje v retenčním mechanizmu této sloučeniny. Z tohoto důvodu byla optimalizována gradientová eluce. Nejvhodnější byl lineární gradient aplikovaný od 16. do 17. minuty z mobilní fáze původního složení při izokratické eluci - ACN/deionizovaná voda 40/60 (v/v) do 100% ACN. Použitím tohoto typu gradientu došlo ke snížení celkové doby analýzy na 22 minut. Kratší kolona Symmetry ® C18 (150 x 4,6 mm, velikost zrnění 5 μm) s principiálně stejným (i když technicky odlišným) typem stacionární fáze byla následně testována za účelem zkrácení doby analýzy a zlepšení symetrie píků, která nebyla v předchozím případě nejvhodnější. Na kratší koloně byla opět optimalizováno složení mobilní fáze. Jako nejvhodnější se ukázal lineární gradient do 100 % ACN aplikovaný od 8. do 9. minuty, prvních 8 minut bylo složení mobilní fáze konstantní - ACN/deionizovaná voda 40/60 (v/v). Byl použit i gradient pro rychlost průtoku mobilní fáze: 2ml/min do 8. minuty, od 8. do 9. min byl lineárně zvyšován na konečné 3 ml/min. Použitím kolony Symmetry ® C18 se značně zlepšila symetrie všech pěti píků a aplikací optimalizovaného gradientu byla doba analýzy zkrácena na 11 minut při zachování separace všech pěti analytů až na základní linii. 3.3.1.2 Separace 1,4-benzodiazepinů (připravovaná publikace) Optimalizace separace sedmi 1,4-benzodiazepinů - bromazepamu, oxazepamu, nitrazepamu, chlordiazepoxidu, flunitrazepamu, lormetazepamu a diazepamu probíhala rovněž v RP HPLC systému. Nejprve byla testována kolona Zorbax SB-C8 (4,6 x 150 mm, 5 µm), naplněná oktylsilikagelovou stacionární fází. Na této koloně bylo postupnou úpravou poměru ACN a okyselené deionizované vody (octovou kyselinou (HAc) na pH 3,0) v mobilní fázi dosaženo rozdělení všech sedmi benzodiazepinů na základní linii. Nejvhodnější (optimalizované) 9 složení mobilní fáze v izokratickém modu bylo ACN/ deionizovaná voda s HAc, pH 3,0 30/70 (v/v). Za těchto podmínek byly uvedené látky rozděleny za 25 minut. Okyselení mobilní fáze bylo aplikováno za účelem zvýšení symetrie píků. Výrazné zkrácení doby separace bylo dosaženo při použití kolony Zorbax SB-C18 (4,6 x 150 mm, 5 µm), která se od předchozí liší nepolárnější stacionární fází (oktadecylové řetězce navázané na silikagelový nosič). V tomto separačním systému bylo možné použít mobilní fázi s vyšším obsahem ACN (40 objemových procent), přičemž separace na základní linii všech benzodiazepinů byla zachována a celková doba analýzy v izokratickém modu se snížila na 7 minut při rychlosti průtoku mobilní fáze 2 ml/min – viz Obr. 3. chlordiazepoxid 0,16 bromazepam 0,14 oxazepam 0,12 0,10 Odezva(AU) nitrazepam 0,08 lormetazepam diazepam 0,06 flunitrazepam 0,04 0,02 0,00 -0,02 -0,04 0 2 4 6 8 10 t (min) Obr.3. Chromatogram separace směsi benzodiazepinů za použití kolony Zorbax SB-C18; složení mobilní fáze: ACN/okyselená deionizovaná voda HAc, pH 3,0 40/60 (v/v); rychlost průtoku mobilní fáze: 2 ml/min; teplota kolony: 25 °C; UV detekce: 240 nm. Za optimalizovaných podmínek izokratické eluce na koloně Zorbax SB-C18 byly stanoveny meze detekce (LOD) a meze stanovitelnosti (LOQ) 1,4-benzodiazepinů. Hodnoty LOD a LOQ pro jednotlivé analyty jsou uvedeny v Tabulce 1. Tabulka 1: LOD a LOQ určené pro sledované 1,4-benzodiazepiny. LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) chlordiazepoxid 8,68 28,92 bromazepam 7,89 26,28 oxazepam 8,91 29,69 nitrazepam 17,05 56,83 flunitrazepam 26,70 89,00 lormetazepam 17,77 59,23 diazepam 22,76 75,86 10 3.3.2 Chirální systémy (publikace IV) Významná část přírodních látek je chirálních, vyskytují se ve formě enantiomerů, případně diastereomerů [10]. Lze říci, že chiralita je základní vlastností živé hmoty. Proto je oprávněná pozornost věnována sledování stereoselektivního chování/působení sloučenin a z toho vyplývajících důsledků při aplikaci léčiv, agrochemikálií i při kontrole složek potravin. Především odlišnému chování enantiomerů léčiv je věnována pozornost již delší dobu. V posledních letech se zájem rozšiřuje i do oblasti agrochemikálií s ohledem na rozdílné účinky enantiomerů i enantioselektivní metabolizmus. Záměna chirálních složek potravin nemá tak závažné důsledky jako třeba použití nevhodného enantiomeru léčiva, nicméně stanovení enantiomerního zastoupení může dobře posloužit v řadě aplikací. Základní přehled nejdůležitějších chirálních složek potravin a nápojů a jejich význam při hodnocení kvality výrobků je uveden v podrobné rešerši v publikaci IV. 3.3.2.1 Optimalizace a validace HPLC metody pro enantioseparaci (±)- cloprostenolu (publikace V) Tato práce se zabývala vývojem HPLC metody pro separaci a kvantifikaci enantiomerů (±)- cloprostenolu. Nejprve byly pro enantioselektivní separaci (±)-cloprostenolu vyzkoušeny chirální stacionární fáze na bázi makrocyklických antibiotik, jejich použití však nevedlo k uspokojivé enantioseparaci. Vhodnou alternativou k CSP na bázi makrocyklických antibiotik, glykopeptidů, jsou polysacharidové CSP. Pro další experimenty proto byla použita kolona Chiralcel OD-RH s celulosou modifikovanou tris (3,5-dimethylfenyl)-karbamátem na silikagelovém nosiči. Na této koloně se podařilo najít vhodné podmínky pro separaci (±)- cloprostenolu. Optimalizované chromatografické podmínky jsou: kolona Chiralcel OD-RH, mobilní fáze: ACN/20 mM fosfátový pufr, pH 3,0 33/67 (v/v), rychlost průtoku mobilní fáze: 0,7 ml/min, teplota kolony: 20 °C, UV detekce: 274 a 210 nm. Chromatogram separace je ukázán na Obr. 4. V optimalizovaném systému byly dále stanoveny základní validační parametry (stabilita vzorků, opakovatelnost a reprodukovatelnost metody, linearita, mez detekce, mez stanovitelnosti a robustnost metody). 11 25 (+)-cloprostenol (-)-cloprostenol 20 15 Odezva (mV) 10 5 0 0 2 4 6 8 10 t (min) Obr. 4. Chromatogram enantioseparace (±)-cloprostenolu na koloně Chiralcel OD-RH; složení mobilní fáze: ACN/20 mM fosfátový pufr, pH 3,0 33/67 (v/v); rychlost průtoku mobilní fáze: 0,7 ml/min; teplota kolony: 20 °C; UV detekce: 274 nm. Metoda byla optimalizována pro kontrolu enantiomerní čistoty léčiva, nicméně změnou poměru ACN/20 mM fosfátový pufr, pH 3,0 v mobilní fázi lze vypracovanou metodu použít i pro semipreparativní účely. 4. Závěry Předkládaná dizertační práce kombinuje teoretické přístupy směřující k objasnění separačních systémů a interakčních mechanizmů s aplikacemi pro konkrétní analytické účely. Model LFER byl použit k porovnání tří chirálních stacionárních fází na bázi teikoplaninu ve čtyřech mobilních fázích z hlediska jimi poskytovaných interakčních možností. Pomocí modelu byly zjištěny interakce rozhodující o retenci analytů v těchto systémech, a také vliv složení mobilní fáze na zastoupení jednotlivých typů interakcí a jejich velikost. Získané výsledky lze použít pro výběr vhodného separačního systému. Výskyt a chromatografické chování systémových píků byly sledovány a popsány v RP HPLC na koloně Discovery® RP Amide C16 v mobilních fázích, které byly tvořeny pouze vodnými pufry. Bylo zjištěno a pomocí CZE ověřeno, že kationty alkalických kovů neinteragují s použitou stacionární fází, a proto jsou vhodné k určování mrtvého času kolony. Naproti tomu organické kyseliny v nedisociované formě použité jako složky mobilních fází interagují se stacionární fází a jejich pozice v chromatogramu lze ovlivňovat změnou disociace kyseliny anebo pouhým ředěním pufru. Na základě rozsáhlého souboru získaných experimentálních dat 12 byl vytvořen matematický model, který umožňuje predikovat pozice a amplitudy systémových píků. Byly vyvinuty RP HPLC metody pro separace vybraných estrogenů a 1,4-benzodiazepinů. Nejvhodnější nalezené HPLC podmínky pro separaci estrogenů gradientovou elucí jsou: kolona Symmetry® C18, mobilní fáze ACN/voda 40/60 (v/v) do 8. min, od 8. do 9. min lineární gradient do 100 % ACN, rychlost průtoku mobilní fáze 2 ml/min do 8. min, od 8. do 9. min lineárně zvyšován průtok na 3 ml/min. Za těchto podmínek bylo všech pět sledovaných estrogenů rozděleno na základní linii a doba separace nepřesáhla 11 minut. Vhodné podmínky pro separaci 1,4-benzodiazepinů byly nalezeny v izokratickém modu: kolona Zorbax SB-C18, mobilní fáze ACN/ deionizovaná voda okyselená octovou kyselinou pH 3,0 40/60 (v/v), rychlost průtoku mobilní fáze 2 ml/min. Za těchto podmínek se podařilo rozdělit všech sedm zástupců této skupiny analytů na základní linii do 8 minut. Pro kontrolu enantiomerní čistoty veterinárního léčiva (±)-cloprostenolu byla nalezena a následně validována HPLC metoda. Optimalizované chromatografické podmínky, při kterých bylo docíleno dobrého rozlišení enantiomerů a doba analýzy nepřesáhla 9 minut, jsou: kolona Chiralcel OD-RH, mobilní fáze ACN/20 mM fosfátový pufr, pH 3,0 33/67 (v/v), rychlost průtoku mobilní fáze: 0,7 ml/min. Metodu lze modifikovat i pro semipreparativní použití. 5. Literatura [1] Perry S.G., Amos R., Brever P.I.: Practical Liquid Chromatography. Plenum Press, New York 1972. [2] Claessens H.A., Straten M.A., Cramers C.A., Jezierska M., Buszewski B.: J. Chromatogr. A 826, 135 (1998). [3] Sándi Á., Szepesy L.: J. Chromatogr. A 818, 19 (1998). [4] Sándi Á., Nagy M., Szepesy L.: J. Chromatogr. A 893, 215 (2000). [5 ] Szepesy L.: J. Chromatogr. A 960, 69 (2002). [6] Abraham M.H., Whiting G.S., Doherty R.M., Shuely W.J.: J. Chromatogr. A 587, 213 (1991). [7] Abraham M.H., Mc Gowan J.C.: Chromatographia 23, 243 (1987). [8] Srbek J., Coufal P., Bosáková Z., Tesařová E.: J. Sep. Sci 28, 1263 (2005). [9] Levin S., Grushka E.: Anal. Chem. 61, 2428 (1989). [10] Maier N.M., Franco P., Lindner W.: J. Chromatogr. A 906, 3 (2001). 13
Abstract v angličtině:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Physical and Macromolecular Chemistry Study of interactions participating in the separation mechanism of chromatographic separation systems The PhD Thesis Report Květa Kalíková Prague 2009 The PhD thesis was carried out within the PhD study during years 2005-2009 at the Department Physical and Macromolecular Chemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague. Supervisor: Doc. RNDr. Eva Tesařová, CSc. 2 Content 1. Introduction 4 2. Aims of the thesis 4 3. Results and discussion 5 3.1 Characterization of separation system using LFER model (publication I) 5 3.2 Occurrence and behavior of system peaks in RP HPLC with solely aqueous mobile phases (publication II) 6 3.3 Examples of optimized separation systems and their application 8 3.3.1 Achiral separation systems 8 3.3.1.1 HPLC separation of estrogens (publication III) 8 3.3.1.2 HPLC method for separation of 1,4-benzodiazepines (publication in progress) 9 3.3.2 Chiral separation systems (publication IV) 10 3.3.2.1 Optimization and validation of HPLC method for enantioseparation of (±)-cloprostenol (publication V) 11 4. Conclusions 12 5. References 13 6. List of publications 14 7. List of presentations 15 8. Curriculum Vitae 17 3 1. Introduction High performance liquid chromatography (HPLC) is one of the preferently used separation techniques. Generally, this method provides good reproducibility and robustness. An advantage of the method is a possibility to influence separation not only by the type of stationary phase but also by composition of the mobile phase. A large range of structurally different compounds can be separated by HPLC and it can be used for qualitative as well as quantitative determination [1]. As various interaction types can participate in the retention mechanism of analytes in separation systems, the choice of the optimal separation system is often ambiguous. The selection of suitable separation conditions is very often made empirically. Such approach is rather time consuming therefore, it could be advantageous to utilize some physicochemical characteristics of the separation system. The knowledge of retention and interaction mechanism is necessary for choice of the optimal separation condition, i.e. suitable stationary and mobile phases. In most cases the available technical information given by producers is not sufficient to select the optimum column for a particular separation [2]. Linear free energy relationship (LFER) is one of the comprehensive semiempirical methods that allows characterization and comparison of stationary phases/separation systems and yield to better understanding of the intermolecular interactions, which play role in the separation processes [3,4]. The optimization of separation processes can be disturbed or complicated by phenomena called system peaks. In the case of detectable system zone the resultant chromatogram includes more peaks than is the number of analytes in the sample. These additional signals are often misinterpreted since they are considered as analyte signals. A serious problem that can arise if an analyte interacts with the system zones is resonance. This phenomenon can disturb completely the separation results and make evaluation of the measured data impossible. 2. Aims of the thesis The aim of the PhD thesis was investigation of interaction mechanisms that take part in separation processes in HPLC. Partial goals can be divided as: • characterization and comparison of interaction possibilities of three chiral stationary phases, namely teikoplanin, teikoplanin aglykon a methylated teikoplanin aglykon in various mobile phase compositions using LFER model; to characterize the interactions decisive in retention of analytes in studied separation systems and show prediction of new analytes retentions in these systems • study of system peaks in RP HPLC, in order to describe their formation, appearance and also chromatographic behavior in the given separation system • application of theoretical knowledge on separation of given analytes mixtures 4 3. Results and discussion 3.1 Characterization of separation system using the LFER model (publication I) LFER is a semiempirical method that allows characterization and comparison of the intermolecular interactions possibilities of separation systems, which play a role in the separation processes. The main advantage of the LFER model lies in its ability to independently describe (qualify and quantify) the contributions of individual molecular interactions to the retention process. The principle of the LFER model is based on the correlation between the retention parameters determined for a representative series of analytes in a separation system (e.g. retention factor) and the solute parameters (descriptors) that characterize properties of the solute molecule [5]. The logarithm of the retention factor, log k, can be correlated with various fundamental solute properties, as seen in the general form of the LFER equation: log k = c + r.R2 + s.π2H + a.Σα2H + b.Σβ2H + v.Vx (1) The independent variables in Eq. (1) are solute descriptors and denote specific solute properties: Vx is the McGowan characteristic volume (hydrophobic interactions) [7], Σα2H is the effective or overall hydrogen bond acidity [7], Σβ2H is the effective or overall hydrogen bond basicity [6], π2H is the solute dipolarity/polarizability parameter (electrostatic interactions) [6] and R2 is the excess molar refraction (dispersion interactions). The coefficients in Eq. (1) are determined by multivariate regression analysis and reflect the individual types of molecular interactions in the given separation system. LFER model was used for characterization and comparison of three teicoplanin-based chiral stationary phases (CSPs) – native teicoplanin, teicoplanin aglycon (TAG) and methylated teicoplanin aglycon (MTAG) in four mobile phases differing in methanol (MeOH) and 1% triethylamine acetate buffer (TEAA), pH 4.20, ratio (content of MeOH in the mobile phase varied in the range of 20-80 volume percent). The possible interactions with silanol groups of silica gel support are eliminated using buffer at pH 4.20 with triethylamine; so retention of analytes is influenced only by interactions analyte/chiral selector and analyte/mobile phase. The series of test analytes covered a wide range of interactions, 34 solutes were structurally diverse and the distribution of individual descriptors was equal so that no interaction was preferred. Hydrophobic interactions (described by regression coefficient v) exhibited a clearly defined trend, i.e., increase with the buffer contents in the mobile phase. The highest value of the v coefficient was obtained on the MTAG column, on which we expected the highest hydrophobicity due to methylation of the carboxylic acid and phenolic groups of TAG CSP. The hydrophobicity of these CSPs clearly decreases in the sequence MTAG > TAG > T in all the mobile phases used. 5 The ability to interact with solute n and π-electrons (described by coefficient r) also increases with the contents of the aqueous buffer in the mobile phase. However, lower values of the r coefficient than of the former one show that the contribution of this type of interaction is smaller than that of the hydrophobicity. The tendency cannot be generalized, as the r values are not significant under certain mobile phase compositions. Nevertheless, it can be seen that better accessible aromatic structures or carbonyl groups on the TAG and MTAG CSPs result in a higher portion of these n- and π -electron interactions in the retention mechanism there, than on the T CSP. The hydrophobic interactions (and n- and π -electron interactions) are substituted by polar interactions (described by regression coefficiens s) in mobile phases with increased MeOH content. The polar interactions are significant for almost all the studied separation systems because many polar and polarizable groups are available on the teicoplanin-based CSPs. The regression coefficients a and b, reflecting a disposition of the separation system to interact through hydrogen bonding interactions, are negative. This means that these interactions are preferred in the mobile phase. 3.2 Occurrence and behavior of system peaks in RP HPLC with solely aqueous mobile phases (publication II) System peaks are important but often also disturbing phenomena that complicate optimization processes occurring in separation systems. Signals of system peaks can cause serious problems in evaluation of separation results - they are often misinterpreted since they are considered as analyte signals [8]. On the other hand these peaks have not only negative or disturbing properties they can be used for example for calculation of column void volumes and retention factors or determination of adsorption isotherms [9]. Behavior of system peaks was studied in reversed phase high performance liquid chromatography (RP HPLC) systems consisting of an RP Amide C16 column and aqueous solutions of organic acids with alkaline metal hydroxides as mobile phases without any organic modifier. Binary mobile phases were composed of aqueous solutions of benzoic acid with various concentrations of hydroxides – LiOH or CsOH. The ternary mobile phase used contained LiOH, benzoic acid, and tropic acid (3-hydroxy-2-phenylpropionic acid) in different concentrations. Binary mobile phases yielded two system peaks; ternary mobile phases yielded three system peaks after injection of disturbance of LiOH. The first system peak was stationary while the second or second and third moved with changes of concentration of the buffer components. The injection of higher/lower concentration of LiOH and the same concentration of benzoic acid leads to the positive/negative first system peak and the negative/positive second system peak in binary mobile phases, respectively. The injection of higher/lower concentration of benzoic acid causes only one positive/negative second system peak (the stationary peak is missing) – see Fig. 1. 6 10mM benzoic acid+11mM LiOH A 15mM benzoic acid+6mM LiOH B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 t (min) Fig. 1. Chromatograms obtained by injections of a disturbance of: A) LiOH, B) benzoic acid. Compositions of injected disturbances are given in the figure. Mobile phase: 10 mM benzoic acid + 6 mM LiOH. Indirect UV detection: 290 nm; column and sample temperature: 25 °C; flow rate: 0.2 ml/min; injected volume: 10 µl. As LiOH does not adsorb on the stationary phase the position of the first system peak is constant and does not depend on the mobile phase composition therefore, it can be used as a void volume marker. The position of the second system peak can be affected by mobile phase composition. The position of the second system peak shifts to higher retention times with reduced concentration of the buffer or with increasing dissociation of benzoic acid (e.g. with higher LiOH content). The shifting can be caused in both cases by lower coverage of the stationary phase with non-dissociated benzoic acid (only this form of benzoic acid adsorbs on the stationary phase) as the mobile phase constituent; thereby the competition for binding sites on the stationary phase is diminished. The resonance phenomenon (“interaction“ of analyte and system zones) was obtained by injection of 1-pentanol as a sample into one component mobile phase – 10 mM benzoic acid – see Fig. 2. The increase of the response when the analyte peak approaches the system peak is evident. Moreover, the peak of hexane-3-ol is larger than that of hexane-2-ol because the former is closer to the system peak (concentrations and injected volumes were the same for the both analytes). In addition, reverse responses (peak signs) of the analyte peak eluted before (propane-1-ol and butane-1-ol) and behind (hexane-3-ol and hexane-2-ol) the position of the system peak were observed. 7 propane-1-ol butane-1-ol pentane-1-ol hexane-2-ol 0,15 resonance hexane-3-ol system peaks 0,10 Response (AU) 0,05 0,00 -0,05 -0,10 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 t (min) Fig. 2. Resonance phenomenon and responses in indirect detection. Mobile phase: 10 mM benzoic acid. The composition of injected samples is shown in the chromatogram. Injected samples: 0.5% solutions of alcohols dissolved in the used mobile phase. Indirect UV detection 290 nm, injected volume 20 μl. The collected data were used for development of a mathematical model that describes positions and amplitudes of system peaks. The chromatographic model was incorporated into the computer program Simul 5 originally designed for simulations in capillary electrophoresis. The computer program can simulate time depending positions and amplitudes of system peaks also under various initial compositions. 3.3 Examples of optimized separation systems and their application 3.3.1 Achiral separation systems 3.3.1.1 HPLC separation of estrogens (publication III) This work deals with the development and optimization of a simple HPLC method for determination of five estrogen derivatives, namely estrone, 17α-estradiol, estriol, 17-α-ethinylestradiol and metranol. RP HPLC method was developed with C18 stationary phase (Supelcosil TM LC-18-DB (250 x 4.6 mm, particle size 5 μm)) and mobile phase composed of just acetonitrile (ACN) and deionised water. For isocratic elution the optimized mobile phase composition found was ACN/deionised water 40/60 (v/v). A baseline resolution of all five compounds was achieved but analysis time was too long for practical application. The reason was strong hydrophobic interaction of mestranol with the stationary phase - its retention time was 85.8 min. The next step was optimization of gradient elution. ACN/deionised water 40/60 (v/v) with a linear gradient to 100 vol. % of acetonitrile applied from 16th to 17th minutes provided separation of all the analytes within 22 minutes. The 8 mobile phase flow rate was kept at a constant value of 1.3 ml/min. Shorter retention and better peak shape and efficiency were obtained when gradient elution was employed. A shorter column Symmetry ® C18 (150 x 4.6 mm, particle size 5 μm) with principally analogous stationary phase type was tested in order to decrease the analysis time and improve peak symmetry. When gradient elution with this shorter column was performed, the optimized mobile phase composition found was ACN/water 40/60 (v/v) with the linear gradient to 100 vol. % of acetonitrile applied from 8th to 9th minutes. In addition a linear gradient of flow rate from 2 ml/min to 3 ml/min was applied between 8th – 9th minutes. Shorter retention, better peak symmetry and higher separation efficiency were obtained. Baseline resolution of all five compounds was achieved and the analysis time did not exceed 11 min. 3.3.1.2 HPLC method for separation of 1,4-benzodiazepines (publication in progress) Optimization of separation conditions of seven drugs from 1,4-benzodiazepine group – bromazepam, oxazepam, nitrazepam, chlordiazepoxide, flunitrazepam, lormetazepam and diazepam was also carried out in RP HPLC system. The first column tested was Zorbax SB- C8 (4.6 x 150 mm, particle size 5 μm) packed with an encapped octyl-silica gel stationary phase. The most suitable mobile phase composition found was ACN/deionised water with acetic acid (HAc), pH 3.0, 30/70 (v/v). Baseline resolution of all seven analytes was achieved and the analysis time was 25 minutes. Acidic mobile phase component was applied to enhance peak symmetry if compared with pure deionized water used as the mobile phase constituent. Using column with more hydrophobic stationary phase (octadecyl-silica gel SP) – Zorbax SB-C18 (4.6 x 150 mm, particle size 5 μm) the analysis time was substantially reduced. Then a mobile phase with higher ACN content (40 volume percent) had to be applied for the separation. The baseline resolution of all seven analytes was achieved within 7 min – see Fig. 3. 9 chlordiazepoxide 0,16 bromazepam 0,14 oxazepam 0,12 Response (AU) 0,10 nitrazepam 0,08 lormetazepam diazepam 0,06 flunitrazepam 0,04 0,02 0,00 -0,02 -0,04 0 2 4 6 8 10 t (min) Fig. 3. Chromatogram of the separation of 1,4-benzodiazepines mixture. Column: Zorbax SB- C18; mobile phase: ACN/deionised water with acetic acid, pH 3.0, 40/60 (v/v); flow rate: 2ml/min; column temperature: 25 °C; UV detection: 240 nm. The LOD and LOQ values were established for all the analytes under optimized separation conditions (see caption to Fig. 3) as shown in Table 1. Table 1. LOD and LOQ values determined for the individual 1,4-benzodiazepines. LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) chlordiazepoxide 8.68 28.92 bromazepam 7.89 26.28 oxazepam 8.91 29.69 nitrazepam 17.05 56.83 flunitrazepam 26.70 89.00 lormetazepam 17.77 59.23 diazepam 22.76 75.86 3.3.2 Chiral separation systems (publication IV) A significant number of natural substances are chiral – they can be present in enantiomeric or diastereomeric forms [10]. Chirality can be considered the basic characteristic of living organisms. Therefore, monitoring of stereoselective behavior/effect of chiral compounds, especially drugs, agrochemicals and also food components, is very important. Acquaintance of chirality of natural and synthetic compounds is a significant factor in evaluation of food quality. Individual enantiomers or enantiomeric ratios of food components do not influence only flavour and aroma but affect also nutritional values. As a consequence of processing of foodstuffs chiral components can racemize. The distribution of enantiomers can change also during storage, e.g. owing to bacterial contamination, or due to adulteration with synthetic additives. Determination of enantiomeric ratios in food and beverages can 10 therefore provide valuable information on food quality control (QC). A basic review of chiral food components and their significance in food QC is given in publication IV. 3.3.2.1 Optimization and validation of HPLC method for enantioseparation of (±)-cloprostenol (publication V) This work is focused on the development of a HPLC method for separation and quantification of (±)-cloprostenol enantiomers. In our preliminary experiments we examined the possibility to utilize CSPs based on macrocyclic antibiotics but they were not suitable for the enantioseparation. Suitable alternatives to macrocyclic antibiotics CSPs are polysaccharide CSPs. Chiralcel OD-RH column (cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) CSP) was proved to be more convenient for separation of cloprostenol enantiomers than CSPs used before. The optimized separation conditions, as the compromise between resolution and analysis time, were found: Chiralcel OD-RH column; mobile phase, ACN/sodium dihydrogenphosphate (pH 3.0; 20 mM) (33/67, v/v); flow rate 0.7 ml/min; column temperature 20 °C; detection wavelengths 274 nm and 210 nm. The chromatogram is shown in Fig. 4. 25 (+)-cloprostenol 20 (-)-cloprostenol Response (mV) 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 t (min) Fig. 4. Chromatogram of enantioseparation of (±)-cloprostenol on the Chiralcel OD-RH column. Mobile phase: ACN/sodium dihydrogenphosphate (pH 3.0; 20 mM) (33/67, v/v); flow rate: 0.7 ml/min; column temperature: 20 °C; UV detection: 274 nm. Basic validation parameters (stability of sample solution, precision, linearity, LOD, LOQ, robustness) have been evaluated under optimized separation conditions. The method is aimed for enantiomeric purity control but it should be easy switched to a semipreparative mode. 11 4. Conclusions The PhD Thesis combines the theoretical part focused on better understanding of separation processes and interaction mechanisms with the experimental applications for specific analytical purposes. LFER model was used for comparison and characterization of interaction abilities of three teicoplanin-based chiral stationary phases in four mobile phases. Interactions resulting in the retention mechanism were evaluated and also the influence of mobile phase composition on the distribution and quantity of individual interaction types was taken into account. Obtained results can help with choice of suitable separation system for analysis of compounds of interest. Occurrence and behavior of system peaks in RP HPLC composed of Discovery® RP Amide C16 column and aqueous buffers as mobile phases were described. It was found and also confirmed by CZE that alkaline metal cations do not interact with the stationary phase so they are suitable for determination of column void volume. On the other hand organic acids in non- dissociated form interact with stationary phase and their position in the chromatogram can be affected by their dissociation or buffer dilution. The collected data were used for development of a mathematical model that describes positions and amplitudes of system peaks. RP HPLC methods for separation of selected estrogens and 1,4-benzodiazepines were developed. The best gradient conditions found for separation of estrogens were: Symmetry® C18, mobile phase ACN/deionised water 40/60 (v/v) with the linear gradient to 100 vol. % of acetonitrile applied from 8th to 9th minutes, and linear gradient of flow rate from 8th to 9th minutes from 2 ml/min to 3 ml/min that were applied simultaneously. The baseline separation of all five analytes was obtained within 11 min. The optimized isocratic conditions found for separation of 1,4-benzodiazepines were: Zorbax SB-C18 column, mobile phase ACN/deionised water with HAc, pH 3.0, 40/60 (v/v), flow rate 2 ml/min. The baseline resolution of all compounds was achieved and the analysis time did not exceed 8 min. The method for enantiomeric purity control of the veterinary drug (±)-cloprostenol was developed and validated. The optimized chromatographic conditions were: Chiralcel OD-RH column, mobile phase ACN/sodium dihydrogenphosphate (pH 3.0; 20 mM) (33/67, v/v), flow rate 0.7 ml/min. The baseline resolution within 9 min was achieved. The method is aimed for enantiomeric purity control but it should be easy switched to a semipreparative mode. 12
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Květa Kalíková, Ph.D. 237 kB
Stáhnout Příloha k práci RNDr. Květa Kalíková, Ph.D. 1.81 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Květa Kalíková, Ph.D. 204 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Květa Kalíková, Ph.D. 152 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Věra Pacáková, CSc. 92 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Juraj Ševčík, Ph.D. 55 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 956 kB