velikost textu

Molecular principles of translation reinitiation in mammals

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Molecular principles of translation reinitiation in mammals
Název v češtině:
Molekulární principy translační reiniciace v savčích buňkách
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Vladislava Vlčková
Id práce:
223296
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Genetika, molekulární biologie a virologie (NGEMOVI)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
12. 3. 2020
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Abstrakt Iniciace translace představuje mnohastupňový proces, který zajišťuje sestavení 80S ribosomu na AUG start kodonu molekuly mRNA, jež má být přeložena do polypeptidového řetězce. Správný průběh tohoto procesu je řízen mnoha eukaryotickými iniciačními faktory (eIFs), z nichž nejdůležitějším je eukaryotický iniciační faktor 3 (eIF3). Hlavním cílem naší laboratoře je co nejpodrobněji popsat proteinový komplex eIF3 a také způsoby, jakými tento faktor přispívá k jednotlivým krokům procesu iniciace translace. Kromě toho též zkoumáme jeden z genově specifických kontrolních mechanismů translace zvaný reiniciace, který je, alespoň u kvasinek, umožňován právě faktorem eIF3. V této práci popisuji, že N-terminální doména (NTD) jedné z největších podjednotek kvasinkového eIF3, označované jako a/Tif32, hraje důležitou úlohu nejen ve vazbě eIF3 k 40S ribozomální podjednotce, ale taktéž významně přispívá k nasedání mRNA na 43S preiniciační komplexy in vivo. Stabilizační role N-terminální domény podjednotky a/Tif32 byla ověřena též v naší následující studii, a to biofyzikálními experimenty. Pomocí dalších in vivo přístupů jsme v této práci též dokázali, že pro mRNA s delšími 5´nepřekládanými oblastmi je stabilizační role a/Tif32-NTD důležitější než pro mRNA s krátkými 5´nepřekládanými oblastmi. V následujících studiích, kde se zaměřuji na popis mechanismu reiniciace, jsme odhalili dosud neznámé cis-elementy důležité pro správné fungování reiniciace na kvasinkové modelové mRNA GCN4. Náš výzkum též přinesl první důležité detaily o tomto kontrolním mechanismu v lidských buňkách, a to za použití lidské modelové mRNA ATF4. Zjistili jsme například, že uORF1 z ATF4, jenž je elementem umožňujícím reiniciaci, je obklopen sekvencemi, které jsou důležité pro vysokou efektivitu reiniciace na tomto uORF. Podobně je tomu i v případě uORF1 z GCN4, který též umožňuje reiniciaci na této mRNA. Z našich in silico analýz vyplynulo, že nukleotidová sekvence předcházející uORF1 z ATF4 pravděpodobně tvoří konkrétní sekundární strukturu, jež se zdá být konzervována mezi savci. Na základě počítačových analýz jsme vytvořili mutace, které narušily tuto strukturu, a po jejich testování jsme zjistili, že skutečně snižují schopnost uORF1 z ATF4 podporovat reiniciaci. To nasvědčuje tomu, že přítomnost této struktury je pro efektivitu reiniciace v savčích buňkách důležitá. Na závěr jsme prokázali, že stejně jako je tomu v případě kvasinek, i reiniciace v savcích je umožňována faktorem eIF3, avšak konkrétní zúčastněnou podjednotkou není v tomto případě eIF3a/Tif32, ale eIF3h. Tato Ph.D. práce tedy přispívá nejen k obecnému porozumění základním procesům iniciace translace, ale osvětluje též molekulární mechanismus reiniciace v lidských buňkách a odhaluje tak, že mnoho aspektů tohoto procesu zůstalo konzervováno mezi nižšími a vyššími eukaryoty.
Abstract v angličtině:
Abstract Translation initiation is a multistep process resulting in the formation of the elongation-competent 80S ribosome at the AUG start codon of the mRNA to be translated into a polypeptide chain. This process is orchestrated by numerous proteins called eukaryotic initiation factors (eIFs), out of which the most multitasking one is the eukaryotic initiation factor 3 (eIF3). The main focus of our laboratory aims at the complex characterization of the multisubunit protein eIF3 and the mechanisms of its contribution to various steps of translation initiation. Besides this, we also study one of the gene-specific translational control mechanisms called reinitiation which was, at least in yeast, also shown to be promoted by eIF3. Here I show that the N-terminal domain (NTD) of the largest subunit of yeast eIF3, a/Tif32, plays an important role not only in anchoring the eIF3 complex to the 40S small ribosomal subunit but it also critically contributes to mRNA recruitment to the 43S preinitiation complexes in vivo. The mRNA stabilization role of the a/Tif32-NTD at the mRNA exit channel of the 40S subunit was further confirmed in our following study by biophysical experiments. There, using in vivo approaches, we also demonstrated that mRNAs with longer 5´UTRs are more dependent on the stabilization role of the a/Tif32-NTD than those containing short 5´UTRs. In other studies, where I turned my attention to the mechanism of reinitiation, we revealed novel cis-determinants contributing to the efficiency of reinitiation on the yeast model GCN4 mRNA and, importantly, brought the first insights into this gene-specific regulatory mechanism in human cells on the model human ATF4 mRNA. In detail, we discovered that similarly to the yeast GCN4 mRNA, the reinitiation-permissive upstream ORF1 (uORF1) of ATF4 is also surrounded by sequences that contribute to high reinitiation efficiency that this uORF allows. Moreover, we computationally predicted that the sequence immediately preceding uORF1 of ATF4 probably folds into a specific secondary structure that seems to be conserved among mammals. Computationally designed mutations disrupting this structure obliterated the reinitiation potential of uORF1 suggesting that formation of this secondary structure critically contributes to the yet-to-be-described molecular mechanism underlying reinitiation in humans. Finally, we also demonstrated that in analogy with the reinitiation mechanism in yeasts, reinitiation in humans is also promoted by eIF3; only the contributing subunit is not eIF3a/Tif32, but eIF3h. Thus, this PhD thesis contributed not only to our understanding of basic principles of general translation initiation in eukaryotes but also shed new light onto the molecular mechanism of reinitiation in human cells, revealing that many mechanistic aspects of this process are conserved both in higher and lower eukaryotes.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Vladislava Vlčková 31.76 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Vladislava Vlčková 154 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Vladislava Vlčková 86 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Zdena Palková, CSc. 151 kB