velikost textu

Hepatocyte ROCK1 kinase activity incites liver inflammation in murine non-alcoholic fatty liver disease

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Hepatocyte ROCK1 kinase activity incites liver inflammation in murine non-alcoholic fatty liver disease
Název v češtině:
Zvýšená ROCK1kinázová aktivita v hepatocytech vede k jaternímu zánětu u myšího modelu nealkoholického ztučnění jater.
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Ester Dohnálková
Vedoucí:
Doc. PharmDr. Petr Nachtigal, Ph.D.
Oponent:
Mgr. Iveta Najmanová, Ph.D.
Id práce:
222281
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra biologických a lékařských věd (16-16150)
Program studia:
Farmacie (M5206)
Obor studia:
Farmacie (FAR)
Přidělovaný titul:
PharmDr.
Datum obhajoby:
17. 2. 2020
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
ABSTRAKT Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biologických a lékařských věd. Školitel: doc. PharmDr. Petr Nachtigal, Ph.D., Kandidát: Mgr. Ester Dohnálková Název rigorózní práce: Hepatocyte ROCK1 kinase activity incites liver inflammation in murine non-alcoholic fatty liver disease Úvod: Již dříve bylo zjištěno, že Rho-asociovaná proteinová kináza 1 (ROCK1) se podílí na uvolňování extracelulárních vezikulů (EV) z hepatocytů vyvolaného lipotoxicitou. Lipotoxické EV uvolněné z hepatocytů vyvolávají zánětlivou odpověď v monocytech a makrofázích. Kromě toho jsme dříve zjistili, že aktivovaná ROCK1 kináza je histologickým znakem zánětlivého stadia myšího a lidského nealkoholového ztučnění jater (NAFLD). V současné době však není známo, zda aktivovaná ROCK1 kináza může přímo přispívat k patogenezi NAFLD. V naší studii jsme se zaměřili na zkoumání účinků hepatocytové ROCK1 kinázové aktivity při vývoji zánětu v myším modelu NAFLD. Metody: Pro posouzení role ROCK1 kinázy v NAFLD jsme použili in vivo model. Myším (C57BL/6J kmen) bylo injekčně podáno buď: a) vehikulum; b) AAV8-zabalený, TBG-řízený konstitutivně aktivní ROCK1 (CA-ROCK1) konstrukt; nebo c) AAV8-zabalený, TBG-řízený kinázově neaktivní ROCK1 (KD-ROCK1) konstrukt jako negativní kontrola. O dva týdny později byly myši umístěny na standardní laboratorní dietu (chow) nebo dietu s vysokým obsahem tuku, fruktózy a cholesterolu (FFC) po dobu 8 týdnů; toto krátkodobé krmení představuje model izolované steatózy s minimálním zánětem tkáně. Na konci studie byly odebrány játra, tuková tkáň a krev pro následné analýzy a hmotnostní cytometrii “time-of-flight“ (CyTOF). Výsledky: Myši krmené standardní laboratorní dietou exprimující ROCK1 kinázové mutanty vykazovaly normální histologii a funkci jater. U všech tří skupin myší krmených FFC dietou byla pozorována podobná tělesná hmotnost, hmotnost jater a hmotnost epididymální bílé tukové tkáně (nebyly pozorovány signifikantní rozdíly). Metabolický fenotyp (glukóza nalačno, inzulín nalačno) neukazoval žádné statisticky významné rozdíly mezi KD-ROCK1 a CA-ROCK1 u myší krmených FFC dietou. K posouzení inzulínové rezistence byl vypočten index HOMA-IR (homeostatický model inzulínové rezistence). Myši krmené FFC dietou exprimující CA-ROCK1 vykázaly zvýšené HOMA-IR ve srovnání s myšmi KD-ROCK1. Poškození jater, které bylo stanoveno hladinou alanin aminotransferázy v séru, se nelišilo mezi skupinami myší krmených FFC dietou. Naopak myši CA-ROCK1, které byly krmeny FFC dietou, vykazovaly významné zvýšení markerů aktivace makrofágů (CCL3, CCL4, CCL5, CXCL10), povrchových markerů makrofágů (CD68, F4/80) a makrofágů (Mac-2 imunohistochemicky) v játrech. Tyto zánětlivé markery spojené s makrofágy byly významně nižší u myší KD-ROCK1 krmených FFC dietou a kontrolních zvířat krmených FFC dietou. Analýza CyTOF byla provedena na izolovaných intrahepatických leukocytech a prokázala významné změny v subpopulacích imunitních buněk u myší krmených FFC dietou s expresí CA-ROCK1. Charakteristické znaky fibrogeneze (aSMA, kolagen 1a1, fibronektin) byly zvýšeny u myší CA-ROCK1 krmených FFC dietou ve srovnání s myšmi KD-ROCK1. Závěr: Zvýšená aktivita ROCK1 kinázy na pozadí izolované steatózy vyvolává steatohepatitidu charakterizovanou zánětem spojeným s makrofágy. Kromě toho exprese CA-ROCK1 v hepatocytech také přispívala k jaterní fibrogenezi. Vzhledem k důkazu, že ROCK1 kináza podporuje progresi onemocnění, předpokládáme, že inhibice aktivity ROCK1 kinázy může být potenciálně použita pro léčbu lidského NAFLD.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Biological and Medical Sciences Candidate: Mgr. Ester Dohnalkova Consultant: prof. PharmDr. Petr Nachtigal, Ph.D. Title of Thesis: Hepatocyte ROCK1 kinase activity incites liver inflammation in murine non- alcoholic fatty liver disease Background: Rho-associated protein kinase 1 (ROCK1) activity has been previously implicated in lipotoxicity-induced extracellular vesicle (EV) release from hepatocytes. In turn, lipotoxic hepatocyte-derived EVs incite inflammatory response in monocytes and macrophages. In addition, we previously found that activated ROCK1 is a distinct histologic feature of inflammatory stage of murine and human nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). However, it is currently unknown whether activated ROCK1 may directly contribute to NAFLD pathogenesis. Therefore, we aimed to examine the effect of hepatocyte ROCK1 kinase activity on the development of inflammation in a model of murine NAFLD. Methods: To assess the role of ROCK1 in NAFLD, we have adopted an in vivo gain-of-function approach. C57BL/6J mice were injected with either: a) vehicle; b) adeno-associated virus, serotype 8 (AAV8)-packaged, TBG-driven constitutively active ROCK1 (CA-ROCK1) construct; or c) AAV8-packaged, TBG-driven kinase-dead ROCK1 (KD-ROCK1) as a negative control. Two weeks later, mice were placed on either chow or diet high in fat, fructose and cholesterol (FFC) for 8 weeks; this short-term feeding represents model of isolated steatosis with minimal tissue inflammation. At the end of the study, livers, adipose tissue and blood were harvested for downstream analyses and mass cytometry by time-of-flight (CyTOF). Results: Chow-fed mice expressing ROCK1 mutants showed normal liver histology and function. All three groups of FFC-fed mice developed similar body weight, liver weight, and epididymal white adipose tissue weight. Metabolic phenotype (fasting glucose, fasting insulin) of all mice was assessed and there were no statistically significant differences between KD-ROCK1 and CA-ROCK1 in FFC-fed groups. Homeostatic model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) was calculated and FFC-fed mice expressing CA-ROCK1 showed increased HOMA-IR compare to KD-ROCK1 mice. Liver injury, as assessed by serum alanine aminotransferase, did not differ between the three FFC groups. In contrast, FFC-fed CA-ROCK1 mice displayed a significant increase in markers of macrophage activation (CCL3, CCL4, CCL5, CXCL10), macrophage surface markers (CD68, F4/80), and macrophage abundance (Mac-2 by immunohistochemistry) in the liver. These macrophage-associated inflammation markers were significantly lower in FFC-fed KD-ROCK1 mice and FFC-fed controls. CyTOF analysis was performed on isolated intrahepatic leucocytes and demonstrated significant alterations in immune cell subpopulations caused by both the FFC feeding as well as CA-ROCK1 expression. Finally, hallmarks of liver fibrogenesis (αSMA, collagen 1a1, fibronectin) were increased in FFC-fed CA-ROCK1 mice compared to FFC-fed KD-ROCK1 mice. Conclusion: Induction of ROCK1 kinase activity on the background of isolated steatosis incites steatohepatitis characterized by macrophage-associated inflammation. In addition, the expression of CA-ROCK1 in hepatocytes also promoted liver fibrogenesis. Given the evidence that ROCK1 promotes disease progression, we speculate that inhibition of ROCK1 kinase activity maybe salutary in human NAFLD.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Ester Dohnálková 5.12 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Ester Dohnálková 276 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Ester Dohnálková 475 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Iveta Najmanová, Ph.D. 272 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 145 kB