velikost textu

Ovlivnění aktivace krevních destiček polyfenolickými látkami a jejich metabolity

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Ovlivnění aktivace krevních destiček polyfenolickými látkami a jejich metabolity
Název v angličtině:
The influence of polyphenolic compounds and their metabolites on platelet activation
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Lenka Applová
Vedoucí:
PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D.
Oponenti:
Prof. MUDr. Jan Bultas, CSc.
Doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek, Ph.D.
Id práce:
218314
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
Program studia:
Farmacie (M5206)
Obor studia:
Farmacie (FAR)
Přidělovaný titul:
PharmDr.
Datum obhajoby:
19. 12. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Abstrakt Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Kandidát: Mgr. Applová Lenka Školitel: doc. PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D. Název disertační práce: Ovlivnění aktivace krevních destiček polyfenolickými látkami a jejich metabolity Srážení krve je velice složitý a komplexní proces, ve kterém zaujímají krevní destičky nepostradatelnou úlohu. Na druhé straně je jejich aktivace při některých patologických procesech nadměrná, a tudíž nežádoucí. Kardiovaskulární onemocnění jsou ve vyspělých zemích nejčastější příčinou mortality, a je bohužel známo, že i přes významné pokroky v léčbě, zůstává Česká republika v úmrtnosti na tato onemocnění za většinou zemí západní Evropy. Epidemiologické studie naznačují, že vyšší příjem (iso)flavonoidů je spojen se snížením mortality na kardiovaskulární onemocnění. Je také vhodné zmínit, že Česká republika patří ve statistikách k zemím s nejnižším obsahem flavonoidů v potravě z celé Evropy. Cílem této dizertační práce bylo zjistit, zda mohou polyfenolické látky, zejména (iso)flavonoidy a/nebo jejich metabolity, ovlivnit agregaci krevní destiček, a tedy nepřímo podpořit epidemiologické nálezy, tj. zda může existovat souvislost mezi těmito látkami a možným příznivým kardiovaskulárním působením na experimentální úrovni. Celkově bylo v této práci otestováno 16 isoflavonoidů, 4 metabolity isoflavonoidů, 29 flavonoidních metabolitů a 12 syntetických xanthen-3-onů. Nejprve byl proveden screening jejich účinku na agregaci navozenou kyselinou arachidonovou (AA) a kolagenem s využitím impedanční agregometrie v plné lidské krvi. U velmi účinných látek byl otestován i mechanismus účinku: stanovení inhibice cyklooxygenázy-1 a tromboxan syntázy, antagonismu na tromboxanových receptorech, interference s vápníkovou signální kaskádou či inhibice vyplavení serotoninu. Tyto experimenty byly principiálně provedeny za pomocí ELISA stanovení finálních produktů nebo opět impedanční agregometrií. Nejdříve byla otestována antiagregační aktivita isoflavonoidů, které byly v předchozích studiích nejúčinnějšími flavonoidy. Byl potvrzen dobrý inhibiční potenciál genisteinu a daidzeinu, ale tentokrát i v plné lidské krvi, tedy v klinicky relevantnějším biologickém prostředí. Následně byl u nich nalezen inhibiční účinek proti destičkové cyklooxygenáze-1 a antagonistický vliv na tromboxanové receptory. Antagonismus na těchto receptorech byl stanoven i jako hlavní mechanismus pro nejúčinnější látku, tektorigenin, jehož hodnoty IC50 byly 3x nižší než pro standartní látku, kyselinu acetylsalicylovou (ASA). S ohledem na špatnou biologickou dostupnost parentních látek po p.o. podání, z důvodu jejich špatné penetrace buňkami gastrointestinálního traktu a/nebo jejich rychlému metabolismu již v těchto buňkách, byly otestovány i známé isoflavonoidní metabolity. Z nich prokázal největší účinek S-equol, který vykazoval na kolagenem navozené agregaci podobný potenciál jako ASA. Dalším účinným metabolitem byl stanoven 4-etylfenol, který byl schopný částečně inhibovat cyklooxygenázu-1, antagonizovat tromboxanové receptory i ovlivnit homeostázu vápníku. Metabolit O-desmetylangolensin vykazoval celkový účinek nižší, nicméně se stejnými mechanismy účinku jako 4-ethylfenol. Oproti tomu u (2RS)-2-(4-hydroxyfenyl) propionové kyseliny nebyl pozorován žádný antiagregační účinek. S ohledem na farmakokinetiku i ostatních flavonoidů a skutečnost, že tyto metabolity dosahují v plasmě vyšších koncentrací než parentní látky, byly otestovány i flavonoidní metabolity tvořené lidskou mikroflórou. Pouze 4 látky z 29 byly schopné inhibovat agregaci navozenou AA, a to 4- metylkatechol, pyrogallol, resorcinol a floroglucinol. Hodnoty IC50 u 4-metylkatecholu jsou jak pro agregaci navozenou AA, tak i kolagenem přibližně 10x nižší než pro ASA. Tato látka byla schopná částečně inhibovat tromboxan syntázu, ale jako hlavní mechanismus účinku předpokládáme ovlivnění kinetiky vápenatých iontů. 4-metylkatechol a floroglucinol jsou mimo jiné prokázanými metabolity nejčastěji se vyskytujícího se flavonolu kvercetinu. Účinek 4-metylkatecholu a pyrogallolu byl potvrzen i na novém in vivo (ex ovo) modelu trombózy. Agregace zde byla navozena lokálním podáním AA, kde po první hodině zemřelo 46 % kontrolních vzorků a po 24 hodinách 60 %. I.v. premedikace ASA snížila úmrtnosti na 7 %, respektive 27 %. Premedikace 4-metylkatecholem a pyrogallolem nebyla v první hodině spojená s žádnou mortalitou, po 24 hodinách to bylo 7 %, respektive 31 %. Součástí této dizertační práce bylo i otestování antiagregačních účinků nově nasyntetizovaných látek ze skupiny derivátů xanten-3-onů. Z 12 testovaných látek byly téměř všechny schopny významně inhibovat agregaci navozenou AA při koncentraci 80 µM. V nižších koncentracích byly účinné dvě látky, které byly dále testovány. 9-(2´-hydroxy-5´-bromofenyl)-2,6,7-trihydroxy-xanten-3- on inhiboval rekombinantní ovčí cyklooxygenázu-1, ale tento účinek nebyl potvrzen v prostředí lidské plasmy obohacené o destičky. Druhá látka, (9-(4´-dimetylamino-fenyl)-2,6,7-trihydroxy-xanten-3-on, byla nejvíce aktivní na kolagenem navozené agregaci, a to dokonce ve srovnatelných koncentracích jako ASA. Její mechanismus účinku byl následně stanoven jako antagonismus na tromboxanových receptorech. Závěrem lze shrnout, že tyto publikované práce týkající se polyfenolických látek, které tvoří součást naší potravy a jejich gastrointestinálních metabolitů, naznačují možné protektivní účinky na kardiovaskulární systém. Nicméně u nejaktivnějších látek je stále prostor k získání nových informací, především jejich farmakokinetiky a posléze jejich ex vivo či dokonce in vivo kombinací s klinicky používanými antiagregačními látkami.
Abstract v angličtině:
Abstract Charles University, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Candidate: Applová Lenka, MSc. Supervisor: Assoc. Prof. Přemysl Mladěnka, PharmD., Ph.D. Title of Doctoral Thesis: The influence of polyphenolic compounds and their metabolites on platelet activation Blood aggregation is a very difficult and complex process, in which platelets play crucial role. On the other hand, their activation is excessive and therefore undesirable under pathophysiological conditions. Cardiovascular diseases are the most common cause of mortality in developed countries and unfortunately, despite significant advances in treatment, the Czech Republic remains in mortality from these diseases behind most Western European countries. Epidemiological studies suggest, that higher intake of (iso)flavonoids is associated with reduced cardiovascular mortality. It is also worth mentioning, that the Czech Republic is among European countries with the lowest content of flavonoids in diet. The aim of this doctoral thesis was to find out, if polyphenolic compounds, especially (iso)flavonoids and/or their metabolites, are able to influence platelet aggregation and thus indirectly to support epidemiological findings, i.e. whether there may be a link between these substances and possible positive cardiovascular effect at experimental level. In summary, 16 isoflavonoids, 4 isoflavonoid metabolites, 29 flavonoid metabolites and 12 synthetic xanthen-3-ones were tested in this thesis. At first, the screening was performed on aggregation induced by arachidonic acid (AA) and collagen with using of impedance aggregometry in whole human blood. In the case of very active substances, the mechanism of action was also tested: determination of cyclooxygenase-1 and thromboxane synthase inhibition, antagonism at thromboxane receptors, calcium signalling cascade interference or serotonin release inhibition. These experiments were performed principally by ELISA determination of final products or again by impedance aggregometry. First, the antiplatelet potential of isoflavonoids, which were the most effective flavonoids in previous studies, was tested. The good inhibitory effect of genistein and daidzein has been confirmed, but now also in whole human blood, i.e. under more clinically relevant biological conditions. Subsequently, these compounds inhibited platelet cyclooxygenase-1 and acted as antagonists at thromboxane receptors. Antagonism at these receptors has also been established as the major mechanism for the most potent compound, tectorigenin, whose IC50 values were three times lower than that of the standard, acetylsalicylic acid (ASA). Due to the poor bioavailability of parent compounds after oral administration due to their poor penetration into the gastrointestinal cells and/or their rapid metabolism in these cells, the proven isoflavonoid metabolites were tested. Of these, S-equol has shown the greatest effect that was similar to ASA on collagen induced aggregation. Another active metabolite was 4-ethylphenol, which was able to partially inhibit cyclooxygenase-1, antagonize thromboxane receptors and affect calcium homeostasis. The metabolite O-desmethylanolensin showed a lower effect, but shares the same mechanisms of action with 4-ethylphenol. In contrast, no antiplatelet effect was observed for (2RS)-2-(4-hydroxyphenyl) propionic acid. Based on pharmacokinetics of flavonoids and the fact, that these metabolites reach higher concentrations than parent flavonoids in plasma, these GIT metabolites were also tested. Only four compounds from 29 were able to inhibit platelet aggregation induced by AA; 4-methylcatechol, pyrogallol, resorcinol and phloroglucinol. IC50 of 4-methylcatechol were approximately ten times lower than for ASA, both for aggregation induced by AA and by collagen. This compound was able to partially inhibit thromboxane synthase, but we assume that the main mechanism of action is based on influence on calcium kinetics. 4-methylcatechol and phloroglucinol are among other proven metabolites of the most commonly occurring flavonol quercetin. The effects of 4-methylcatechol and pyrogallol were also confirmed in a new in vivo (ex ovo) model of thrombosis. In this experiment, platelet aggregation was induced by local (topical) administration of AA. This resulted in 46 % mortality of the control samples after the first hour and 60 % after 24 hours. I.v. premedication with ASA reduced the mortality to 7 % and 27 %, respectively. Premedication with 4-methylcatechol and pyrogallol was not associated with any mortality in the first hour. The corresponding values after 24 hours were 7 % and 31 %, respectively. A part of this thesis was also testing of the antiplatelet effects of newly synthesized compounds from the group of xanthene-3-one derivatives. From 12 tested substances, almost all were able to significantly inhibit AA induced platelet aggregation at a concentration of 80 µM. Only two compounds were active in lower concentrations and were subsequently tested more in depth. 9- (2'-hydroxy-5'-bromophenyl)-2,6,7-trihydroxyxanthene-3-one inhibited ovine recombinant cyclooxygenase-1, but this effect was not confirmed in human platelet rich plasma. The second compound, (9-(4'-dimethylamino-phenyl)-2,6,7-trihydroxy-xanthen-3-one, was very active on collagen induced aggregation. In fact, its activity was even comparable with ASA. The mechanism of action was subsequently established as antagonism at thromboxane receptors. In conclusion, these published outcomes on polyphenolic substances, that form part of our diet and their gastrointestinal metabolites, suggest possible protective cardiovascular effects. However, for the most active substances there is still space for new information, especially their pharmacokinetics, and then their testing ex vivo and in vivo in combinations with clinically used antiplatelet agents.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Lenka Applová 2.17 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Lenka Applová 522 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Lenka Applová 524 kB
Stáhnout Posudek vedoucího PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D. 140 kB
Stáhnout Posudek oponenta Prof. MUDr. Jan Bultas, CSc. 214 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek, Ph.D. 247 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 95 kB