velikost textu

Studium bariérových lipidů v kůži a kožních modelech

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium bariérových lipidů v kůži a kožních modelech
Název v angličtině:
Study of barrier lipids in the skin and skin models
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Michaela Sochorová
Vedoucí:
Doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D.
Oponenti:
Doc.PharmDr. Petr Zimčík, Ph.D.
doc. MUDr. Miloslav Salavec, CSc.
Id práce:
218313
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra organické a bioorganické chemie (16-16120)
Program studia:
Farmacie (M5206)
Obor studia:
Farmacie (FAR)
Přidělovaný titul:
PharmDr.
Datum obhajoby:
9. 12. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Abstrakt Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra organické a bioorganické chemie Kandidát: Mgr. Michaela Sochorová Školitel: prof. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Název disertační práce: Studium bariérových lipidů v kůži a kožních modelech Jako „bariérové“ označujeme lipidy nacházející se v nejsvrchnější vrstvě epidermis – stratum corneum (SC). Jedná se o přibližně ekvimolární směs ceramidů (Cer), volných mastných kyselin (MK) a cholesterolu (Chol). Tato směs je jedinečná svým složením i strukturou a zajišťuje bariéru, která chrání organismus před negativními vlivy vnějšího prostředí a současně brání nadměrným ztrátám vody a reguluje tak homeostázu organismu. Narušení kožní bariéry, včetně pozměněného složení a organizace bariérových lipidů, bylo popsáno u řady onemocnění postihujících kůži, jako je atopická dermatitida, psoriáza či rakovinná onemocnění kůže. Studium a terapie těchto onemocnění jsou limitovány jejich komplexní patofyziologií a nedostatkem biologického materiálu (lidské tkáně). Kožní modely tak představují vhodnou alternativu a užitečný nástroj pro studium kožních onemocnění. Modely využívané ve studiu kožní bariéry se liší svojí jednoduchostí/složitostí, způsobem přípravy a tudíž i druhem informací, které mohou poskytnout. Jednoduchým modelem mezibuněčné lipidové směsi SC jsou lipidové membrány. První studované modely napodobovaly narušený metabolismus Cer ve SC u Gaucherovy choroby. Cer za normálních okolností vznikají z jejich prekurzorů – glukosylCer (GlcCer), u tohoto onemocnění je však přeměna omezena či znemožněna. Připravili jsme modely se sníženým obsahem Cer, které byly nahrazeny jejich prekurzorem – GlcCer. U modelových membrán jsme studovali jejich permeabilitu pomocí 4 permeačních markerů a lamelární uspořádání lipidů jsme hodnotili rentgenovou práškovou difrakcí. Náhrada malého množství Cer za GlcCer vedla ke zhoršení bariérových vlastností membrán a narušení jejich mikrostruktury. Naopak, záměna polovičního a většího množství Cer za GlcCer způsobila tvorbu nové lamelární fáze a membrány měly lepší bariérové vlastnosti v porovnání s kontrolní membránou. Výsledky naznačují, že akumulace GlcCer pravděpodobně není hlavní příčinou zvýšené ztráty vody u pacientů s Gaucherovou chorobou. Obdobně, pomocí modelových lipidových membrán, jsme studovali vliv množství Chol v lipidové směsi na bariérové vlastnosti připravených membrán. Rentgenová prášková difrakce odhalila, že jen přibližně polovina ekvimolárního množství Chol je promísena s ostatními složkami směsi a začleněna do lamelárních fází. Větší množství Chol vytváří separovanou fázi ve struktuře membrán. Permeabilita membrán nebyla s úbytkem Chol negativně ovlivněna, naopak, membrána s 40 % fyziologického množství Chol měla nejlepší bariérové vlastnost. Z toho vyplývá, že ekvimolární množství Chol má ve SC pravděpodobně jinou než bariérovou funkci. Složitějšími modely pokožky či kůže jsou rekonstruované kožní modely. Obsahují kožní buňky, které vytvářejí pokožku rozčleněnou do jednotlivých vrstev. Tyto modely jsou výhodné 1 pro biochemické analýzy, kdy je zpravidla sledován vliv mutace specifického genu, či přítomnost specifických buněk. Mutace v genu pro filaggrin (FLG) je jednou z významných predispozic pro rozvoj atopické dermatitidy. Kolegové z Německa připravili kožní modely s normální a sníženou expresí FLG. FLG-deficitní modely mají prokázaný vyšší obsah MK ve SC a horší organizaci lipidů. V připravených modelech jsme sledovali vliv vybraných PPAR agonistů na složení, organizaci a funkci kožní bariéry. Selektivní PPAR α agonista zvýšil expresi FLG a ostatních strukturních proteinů, normalizoval hladinu a složení MK, čímž došlo ke zlepšení organizace lipidů a snížení permeability FLG-deficitních modelů. Látky ze skupiny agonistů PPAR by tak mohly být využity v léčbě kožních onemocnění souvisejících s nedostatkem FLG. Jelikož atopická dermatitida je chronické zánětlivé onemocnění, studovali jsme FLG-deficitní modely s přídavkem aktivovaných imunitních buněk a jejich vliv na homeostázu a kožní bariéru kožních modelů. Zvýšená hladina pro-zánětlivého cytokinu TSLP byla nalezena v modelu se sníženou expresí FLG, po přídavku imunitních buněk došlo ke zvýšení TSLP i v kontrolních modelech. Oba typy modelů vykazovaly po přídavku imunitních buněk zvýšenou permeabilitu a vyšší povrchové pH. Výhradně ve FLG-deficitních modelech byla pozorována migrace aktivovaných T-lymfocytů z místa aplikace do dermální části modelu. Toto zjištění naznačuje, že TSLP přímo podněcuje migraci imunitních buněk, což nebylo dosud popsáno. Rekonstruované kožní modely mohou být cenným pomocníkem při hledání cílené léčby rakoviny kůže. Za tímto účelem jsme studovali kožní modely rakoviny kůže (v různém rozsahu) a charakterizovali jsme jejich bariérové vlastnosti. Analýza odhalila porušené uspořádání lipidových řetězců i pozměněné složení lipidové matrix. Defekt kožní bariéry a zvýšená propustnost modelů byla úměrná rozsahu karcinomu (počtu rakovinných buněk). Studované kožní modely tak simulují lokální změny bariérové funkce pokožky v místě lézí in vivo. Lidská kůže ex vivo, v celé její tloušťce nebo její vrstvy, se využívá v řadě pokusů. Kůže v celé její tloušťce jsme použili v permeačních pokusech k porovnání výsledků získaných z pokusů s modelovými membránami. Topická aplikace GlcCer na intaktní lidskou kůži narušila kožní bariéru, což je patrné z vyšších hodnot ztráty vody přes pokožku a nižších hodnot elektrické impedance. V druhé studii, selektivní extrakce Chol z izolovaného lidského SC potvrdila výsledky z modelových membrán se stejným zastoupením Chol. Ačkoli bylo možné extrahovat Chol jen z 20 %, porovnatelné hodnoty z modelových membrán a izolovaného SC dokazují vhodnost a reprodukovatelnost modelových membrán v tomto typu studie. Odběr vzorku pokožky pacientů s kožními onemocněními je limitujícím krokem v diagnostice a výzkumu kožních onemocněních. Neinvazivní metody odběru by značně zlepšily pohodlí pacientů v porovnání s invazivní biopsií. Ve spolupráci s Dr. Svobodou jsme porovnávali dvě metody odběru – „stripování páskou“ a „tvorbu puchýře podtlakem“. Druhá uvedená metoda poskytuje intaktní epidermis v množství, které je dostačující pro izolaci proteinu, RNA, k přípravě histologických preparátů i ke kvalitativní a kvantitativní analýze bariérových lipidů. Výsledky práce ukazují praktické využití kožních modelů různých úrovní ve vědeckých studiích. Získané poznatky přispěly k lepšímu porozumění funkce bariérových lipidů ve zdravé i nemocné kůži. 2
Abstract v angličtině:
Abstract Charles University, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Organic and Bioorganic Chemistry Candidate: Mgr. Michaela Sochorová Supervisor: prof. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Title of doctoral thesis: Study of barrier lipids in the skin and skin models The barrier lipids are found in the intercellular spaces of the uppermost layer of epidermis – stratum corneum (SC). These lipids comprise an approximately equimolar mixture of ceramides (Cer), fatty acids (FA) and cholesterol (Chol). The composition and organization of the lipid mixture is unique and provides a barrier, which protects organism against harmful effects from the surroundings and, at the same time, it protects body from excessive water loss and contributes to homeostasis maintenance. Skin barrier disruption, including altered barrier lipid composition and organization, was described in many skin diseases, for example atopic dermatitis, psoriasis or skin cancer. Study and therapy of these diseases are limited by their complex pathophysiology and a lack of biological material (human skin). Therefore, skin models are appropriate and useful tools for study of skin diseases. The skin models differ in their simplicity/complexity and their preparation therefore they can provide different information. Model lipid membranes are simple models of intercellular lipid matrix of SC. First prepared model membranes simulated a disrupted Cer metabolism in SC with Gaucher disease. In healthy state, Cer arise from their precursors – glucosylCer (GlcCer), in the diseased state, however, the Cer transformation is reduced or disabled. Model membranes with Cer fraction partially replaced by GlcCer were prepared. Membranes permeability was studied using four permeability markers and membrane microstructure was assessed by X-ray powder diffraction. Replacement of small amount of Cer by GlcCer led to impaired barrier properties and altered lipid organization of the membrane. By contrast, replacement of 50% and more caused formation of a novel lamellar organization and the membranes had better barrier properties in comparison to control membrane. The results suggest that accumulation of GlcCer is not the main cause of increased transepidermal water loss in patients with Gaucher disease. Also using model lipid membranes, the influence of Chol amount in the lipid matrix on barrier properties was studied. X-ray powder diffraction showed that approximately only half of the equimolar amount of Chol is mixed with other lipids and integrates in the lamellar organization. More than half-amount of Chol creates additional separated phase in the membrane structure. The membrane permeability was not negatively influenced by Chol reduction, by contrast, the membrane with 40% Chol had the best barrier properties. This implies that the equimolar amount of Chol has probably other than barrier function in the SC. Reconstructed skin equivalents (RHS) are more complex model systems. They contain dermal and epidermal cells, which create a stratified epidermis. These models are suitable for biochemical analyses, where usually influence of a gene mutation or addition of specific 1 cells is investigated. Mutations in the gene encoding for filaggrin (FLG) are the major predisposing factor for atopic dermatitis. RHS with normal and decreased FLG expression were prepared at cooperating institution in Germany. FLG-deficient models have higher content of FA in SC and worse lipid organization compared to the control model. Influence of selected PPAR agonists on lipid composition and organization of SC in prepared RHS was evaluated. Selective PPARα agonist increased expression of FLG and other structural proteins, normalized level and composition of FA, which led to improved lipid organization and barrier properties of FLG-deficient RHS. Therefore, PPAR agonists could be used in treatment of FLG-associated skin diseases. Since atopic dermatitis is a chronic inflammatory disease, FLG-deficient RHS with addition of activated immune cells were studied. Impact of immune cells on homeostasis and skin barrier of the models was observed. Increased level of pro-inflammatory cytokine TSLP was found in the FLG-deficient model, TSLP was increased after addition of immune cells also in the control models. Both types of models showed higher permeability and increased values of surface pH. Exclusively in FLG-deficient models, the migration of activated immune cells from the application site into the dermal compartment was noted. This finding indicates that TSLP directly triggers immune cells migration, which had not been reported before. RHS could be a valuable tool for searching and designing targeted skin cancer treatment. For that purpose, reconstructed models of skin cancer (in different stages) were prepared in Germany and their barrier properties were characterized at our Department. The analysis revealed impaired lipid organization as well as altered composition of the lipid matrix. Skin barrier defect and increased permeability of models correlated with stage of skin cancer (number of carcinoma cells). The prepared RHS mimic well the local changes of skin barrier of skin cancer lesions in vivo. Human skin ex vivo (full-thickness or its individual layers) can be used in many experiments. Full-thickness skin was used in permeation experiments to compare the results obtained from experiments with model lipid membranes. Topical application of GlcCer on intact ex vivo human skin disrupted the skin barrier, represented by higher values of transepidermal water loss and lower values of electrical impedance. In the second study, selective extraction of Chol from isolated human SC confirmed results of model membranes with the same Chol proportion. Although only 20% of Chol were extracted from human SC, comparable values from both model lipid membranes and extracted SC indicate a suitability and reproducibility of model membranes in this kind of study. Skin sampling from patients with skin diseases is a limiting step in diagnostics and research of skin diseases. Non-invasive techniques of skin sampling could strongly improve patient’s comfort in comparison to punch biopsy. Therefore, two skin sampling techniques were compared (in cooperation with Dr. Svoboda) – tape stripping and suction blistering (SB). SB provides an intact epidermis in sufficient amount for isolation of proteins and RNA, for preparation of histological sections and also for qualitative and quantitative analysis of barrier lipids. The results of the work show practical application of the skin models of different complexity in scientific studies. Acquired knowledge contributed to better understanding of the function of barrier lipids in healthy and diseased skin. 2
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Michaela Sochorová 4.3 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Michaela Sochorová 538 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Michaela Sochorová 534 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. 271 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc.PharmDr. Petr Zimčík, Ph.D. 627 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Miloslav Salavec, CSc. 426 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 95 kB