velikost textu

Studium vlastností radioaktivně značených monoklonálních protilátek pro zobrazování v onkologii

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium vlastností radioaktivně značených monoklonálních protilátek pro zobrazování v onkologii
Název v angličtině:
The study of properties of radiolabelled monoclonal antibodies for imaging in oncology
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Jiří Janoušek
Vedoucí:
Doc. PharmDr. František Trejtnar, CSc.
Oponenti:
RNDr. Mgr. Ján Kozempel, Ph.D.
Doc. Ing. Alice Lázníčková, CSc.
Konzultant:
Mgr. Pavel Bárta, Ph.D.
Id práce:
217459
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
Program studia:
Farmacie (M5206)
Obor studia:
Farmacie (FAR)
Přidělovaný titul:
PharmDr.
Datum obhajoby:
10. 10. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
ABSTRAKT Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Kandidát: Mgr. Jiří Janoušek Školitel: doc. PharmDr. František Trejtnar, CSc. Konzultant: Mgr. Pavel Bárta, Ph.D. Název disertační práce: Studium vlastností radioaktivně značených monoklonálních protilátek pro zobrazování v onkologii Monoklonální protilátky patří mezi cílená biologická léčiva, která se v současnosti s úspěchem uplatňují v řadě oblastí medicíny, včetně onkologie. Schopnost protilátek vázat se specificky na antigeny vyskytující se v nádorové tkáni lze využít k zobrazení nádorů v nukleární medicíně. Mezi možné cíle protilátek patří receptory pro vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGFR) a epidermální růstový faktor (EGFR), které jsou charakteristické pro některé typy proliferující nádorové tkáně. Pro potenciální radiodiagnostické využití je třeba k molekule protilátky připojit vhodný radionuklid. Tato operace vyžaduje chemickou modifikaci její molekuly, která může ovlivnit její imunoreaktivitu a vazbu na cílový receptor. Cílem této disertační práce bylo studovat vliv podmínek značení monoklonálních protilátek, potenciálně využitelných v onkologické radiodiagnostice, vybranými diagnostickými radionuklidy na jejich radiochemické parametry, in vitro receptorově specifickou vazebnost, orgánovou distribuci a kvalitu zobrazení experimentálních nádorů in vivo. Pro tyto účely byly vybrány anti-EGFR monoklonální protilátka cetuximab a anti-VEGFR2 protilátka ramucirumab. V případě cetuximabu byl zkoumán vliv metody při značení jódem-131 a zároveň byla testována možnost aplikace metody CTK (Concentration Through Kinetics) s využitím cílových receptorů exprimovaných na povrchu buněk. V případě ramucirumabu (RAM) byl zkoumán vliv značení vybranými radiokovy na radiochemické a biologické vlastnosti – afinitu protilátky k cílovému receptoru in vitro a in vivo. Pro značení cetuximabu jódem-131 byla použita metoda s chloraminem T. Monoklonální protilátka ramucirumab byla značena pomocí přímých i nepřímých metod radionuklidy vhodnými pro radiodiagnostické zobrazování techneciem-99m (99mTc), galiem-67 (67Ga) a zirkoniem-89 (89Zr). Pro stanovení radiochemické čistoty a stability byla použita tenkovrstvá a vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Afinita protilátek k cílovému receptoru byla charakterizována jako disociační konstanta KD, která byla stanovována pomocí klasické manuální saturační techniky a automatizované real-time metody. Jako experimentální model byly pro in vitro experimenty použity lidské nádorové buňky exprimující cílové receptory studovaných protilátek – A431 a HaCaT pro cetuximab a PC3 a SKOV3 89Zr-ramucirumabu pro ramucirumab. Biodistribuce značeného byla studována ex vivo po aplikaci myším s PC3 a SKOV3 nádory. Stejné myší nádorové modely sloužily k testování PET/CT zobrazení nádorů pomocí 89Zr-ramucirumabu. Ověření vlivu radiojodace metodou chloraminu T na kvalitu radiopreparátu cetuximabu ukázalo, že zkrácení reakční doby zásadně neovlivňuje radiochemickou čistotu, může mít ovšem vliv na afinitu k EGF receptoru a stabilitu této vazby. Zároveň byla pomocí 131I-cetuximabu prokázána možnost a výhodné vlastnosti provádění CTK analýzy s využitím živých buněk, zejména při nízkých koncentracích protilátky. Optimalizace metody značení ramucirumabu vybranými radiokovy vedla k přípravě radiopreparátů s vysokou radiochemickou čistotu, stabilitou a minimálním snížením vazebnosti protilátky k buněčnému VEGFR2 in vitro. Testování vlivu různých metod značení techneciem-99m na afinitu značeného RAM k VEGFR2 ukázalo menší vliv nepřímého značení přes připojený chelátor, než byl nalezen při použití přímé metody značení. Tyto experimenty umožnily následně 89Zr připravit adekvátně kvalitní radiopreparát ramucirumabu značený PET radionuklidem 89Zr-DFO-RAM s pomocí chelátoru desferoxamin (DFO) pro in vivo experimenty. Aplikace laboratorním myším s VEGFR2 pozitivními nádory ukázala významnou akumulaci značené protilátky v nádorové tkáni s maximem 72 h po aplikaci (9,4 ± 0,9 %ID/g u PC3 nádoru a 13,4 ± 1,7 %ID/g u SKOV3 nádoru). Akumulace v nádorech byla však patrná již 24 h po podání. V souladu s ex vivo experimenty byl nález velmi dobrého zobrazení nádorů pomocí 89Zr-DFO-RAM. PET/CT v intervalu 24 h po aplikaci Postupný pokles radioaktivního pozadí v necílových orgánech a současná retence radioaktivity v nádorech vedly k relativně čistému zobrazení nádorové léze 144 h po aplikaci. Získaná experimentální data potvrdila ovlivnění kvality radiopreparátů testovaných monoklonálních protilátek v závislosti na metodě použité pro jejich značení, které se může projevit jak změnami radiochemických parametrů, tak snížením afinity k cílovým antigenům. Výsledky experimentů in vivo potvrzují význam volby radionuklidu s delším poločasem pro značení radiodiagnostických monoklonálních protilátek, neboť zobrazení v delších časových intervalech po podání umožňuje zřetelnější zobrazení nádorů a zvýšení relevance vyšetření.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Charles University, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Candidate: Jiří Janoušek, MSc. Supervisor: Assoc. Prof. PharmDr. František Trejtnar, CSc. Consultant: Mgr. Pavel Bárta, Ph.D. Title of doctoral thesis: The study of properties of radiolabelled monoclonal antibodies for imaging in oncology Monoclonal antibodies belong to the group of targeted biological drugs that are currently successfully applied in various medical specialties, including oncology. The ability to specifically bind to antigens present in a tumour tissue is their significant attribute that can be used for imaging tumours in Nuclear Medicine. Receptors for vascular endothelial growth factor (VEGFR) and epidermal growth factor (EGFR) are possible tumour specific targets that are characteristic for some types of proliferating tumour tissue. The attachment of appropriate radionuclide is necessary for the potential radiodiagnostic use of monoclonal antibody. This task requires chemical modification of the antibody molecule that can damage its immunoreactivity and the binding to the target receptor. The aim of the doctoral thesis was to study the influence of labelling conditions with selected diagnostic radionuclides on radiochemical characteristics, in vitro receptor specific binding and organ distribution of used monoclonal antibodies with the potential application in Oncology for radiodiagnostics and imaging of experimental tumours in vivo. Anti-EGFR monoclonal antibody cetuximab and anti-VEGFR2 monoclonal antibody ramucirumab were chosen for these purposes. In the case of cetuximab we studied the influence of the method during the labelling with iodine-131 and tested the possibility of CTK (Concentration Through Kinetics) method application with the use of target receptors expressed on the surface of living cells. In the case of ramucirumab (RAM) we studied the influence of labelling with selected radiometals on the radiochemical and biological characteristics – the antibody affinity to the target receptors in vitro and in vivo. For the labelling of cetuximab with iodine-131 we used the chloramine T method. Monoclonal antibody ramucirumab was labelled using direct and indirect methods with radionuclides suitable for radiodiagnostic imaging - technetium-99m (99mTc), gallium-67 (67Ga) and zirconium-89 (89Zr). The thin-layer and high-performance liquid chromatography were employed for the determination of radiochemical purity and stability. The affinity of labelled antibodies to their target receptor was characterized as the equilibrium dissociation constant KD and was determined by the classic manual saturation technique and real-time automatized method. Human cancer cell lines expressing target receptors for the used antibodies were used as an experimental model in the in vitro experiments – A431 and HaCaT for cetuximab and PC3 and SKOV3 for ramucirumab. The biodistribution of 89Zr-RAM was studied ex vivo after the application to the mice bearing PC3 and SKOV3 tumours. The same mice models were used to test the PET/CT imaging of tumours with 89Zr-RAM. The verification of radioiodination influence using the chloramine T method on the quality of cetuximab radiopreparations demonstrated that the shortening of reaction time does not affect their radiochemical purity, but it can influence their stability and affinity 131I-cetuximab to EGFR. At the same time, the usage of demonstrated the potential and advantageous properties of CTK analysis with the living cells, especially at low antibody concentrations. The optimization of the RAM labelling method with selected radiometals resulted in the radiopreparations with high radiochemical purity, stability and minimal reduction of the antibody affinity to the cell surface VEGFR2 in vitro. The testing of the influence of different labelling methods with technetium-99m demonstrated less impact of indirect labelling with chelator than was observed using the direct method. These experiments subsequently enabled the preparation of RAM radiopreparation labelled with PET 89Zr radionuclide using the chelating agent deferoxamine (DFO) with adequate quality 89Zr-DFO-RAM for in vivo experiments. The application of to laboratory animals bearing VEGFR2-positive tumours demonstrated significant accumulation of the labelled antibody in tumours with the maximum 72 h after administration (9,4 ± 0,9 %ID/g in PC3 tumour and 13,4 ± 1,7 %ID/g in SKOV3 tumour). The accumulation in tumours was significant even 24 h post injection. The good tumour imaging using PET/CT technique 24 h after administration 89Zr-DFO-RAM of was in accordance with ex vivo experiments. The gradual decrease of radioactive background in nontarget organs and retention of radioactivity in tumours resulted in relatively clear image of tumour lesion 144 h after administration. The obtained experimental data confirmed that the labelling method affects the quality of radiopreparations of tested monoclonal antibodies. This can be reflected in the changes of radiochemical characteristics or the affinity reduction to target antigens. Results of in vivo experiments confirmed the importance of long physical half-life radionuclide for the labelling of radiodiagnostic monoclonal antibodies because the imaging at longer time intervals post injection enabled clearer tumour imaging and better examination relevance.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Jiří Janoušek 3.46 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Jiří Janoušek 126 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Jiří Janoušek 126 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Doc. PharmDr. František Trejtnar, CSc. 211 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Mgr. Ján Kozempel, Ph.D. 2.29 MB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. Ing. Alice Lázníčková, CSc. 168 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 94 kB